CN103472178A - 液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基质分散固相萃取法联合超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪测定基质复杂的液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法，属于丙烯酰胺的检测方法领域。本发明的丙烯酰胺快速检测方法利用基质分散固相萃取法提取、净化样品，得产物A；对产物A进行旋转蒸发浓缩，用乙酸乙酯进行洗涤，用氮气吹干，并用水超声溶解；用正己烷脱脂，离心分离后取下层溶液过滤后使用UPLC/MS/MS检测，用内标法定量。与现行的通用检测方法相比，本发明方法高通量、快速、准确、高效、安全，能准确对基质复杂的酱油等调味品中丙烯酰胺的含量进行检测，满足企业生产中食品安全日常监控要求。

Description

液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种丙烯酰胺的检测方法，尤其是涉及一种基质分散固相萃取法联合超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪测定基质复杂的液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法。

背景技术

丙烯酰胺是一种化学物质，是生产聚丙烯酰胺的原料。其聚合物聚丙烯酰胺广泛用于纺织、化工、冶金等行业，也可用于水处理中的絮凝剂。2002年4月瑞典国家食品局和斯德哥尔摩大学科学家率先报道在炸薯条、面包等经高温处理的食品中广泛存在较高水平的丙烯酰胺，由于丙烯酰胺潜在的神经毒性、遗传毒性及致癌性，该项研究结果引起了全球的极大关注。随后，世界各国的科学家对食品中丙烯酰胺的形成机制、不良反应、检测方法等各个方面进行了深入研究。

目前，关于丙烯酰胺含量的检测研究主要针对涉及烤、烘、炸、煎类的淀粉食品，而对于中国老百姓餐桌上常用的调味品，特别是酱油类色深液态的调味品中的检测研究较少。而酱油等调味品由于用途较广，用量较大，已经成为不可忽视的一项食品安全检测项目。国内外大量研究表明，氨基酸和还原糖由高温加热发生的美拉德反应会产生丙烯酰胺。酱油富含氨基酸和糖类物质，存在产生丙烯酰胺的风险。因此有必要开发一种针对酱油、卤水汁等富含氨基酸、糖类物质的调味品的丙烯酰胺检测方法，以此来进行风险评估与食品安全监控。

酱油、卤水汁等色深液态调味品成分相当复杂，含有多种氨基酸、糖类、有机酸、酯类物质、焦糖色素及多种芳香物质。要在检测分析前处理中除掉这些有机杂质的干扰，处理过程相对复杂繁琐。尤其是对于添加了天然色素焦糖色来增加色泽和稠度的产品老抽、卤水汁等，基质更为复杂，在色谱上会有多个色谱峰出现干扰目标物质的定性和定量。

我国现有针对食品的丙烯酰胺检测方法主要是GB/T5009.204-2005—食品中丙烯酰胺含量的测定方法气相色谱-质谱（GC-MS）法。该法也是当前行业测定食品中丙烯酰胺主要使用的方法。其采用的是衍生化处理，气质联用色谱进行检测。原理是通过对食品中丙烯酰胺用水、醇类等极性溶剂提取，使用正己烷脱脂的净化处理，溴化衍生生成2,3-二溴丙烯酰胺（2,3-DBPA），并结合气相色谱-质谱联机分析检测丙烯酰胺含量。使用上述方法对酱油等色深液态调味品进行检测，杂质干扰严重，无法准确定性定量。

综合目前丙烯酰胺的检测方法，主要是用水或甲醇等极性有机溶剂进行提取，利用正己烷除脂，使用GC/MS方法则使用衍生化处理进行检测；使用LC/MS和LC/MS/MS方法则直接检测净化所得物质。从以上可参考的检测方法上来看，主要存在着以下几点不足：（1）所有方法在样品的提取步骤多数用水提取，正己烷净化，并不能有效去除色深液态调味品中同样具有较强极性的杂质，该杂质干扰同样具有较强极性的丙烯酰胺的仪器定性定量，影响着检测结果的准确性；（2）GC/MS法需要样品在提取净化后进行溴化衍生，需要使用溴水、氢溴酸这些毒性和腐蚀性较大的试剂，对检测人员的身体健康构成威胁。而且衍生化用时长，需要15个小时，条件要求较高，需要避光、在冷藏温度下进行，能耗比较高；（3）GC/MS法在衍生化过程中，复杂的样品基质影响了衍生化率，这需使用标准添加法来校正结果，在延长检测时间的基础上检测人员的工作量同时也大大增加；（4）所有方法普遍存在色谱分析过程用时较长，总的色谱分析过程在10分钟以上。

总而言之，目前现有的丙烯酰胺检测方法在前处理方法上并不能解决对于基质复杂的色深液态调味品的净化问题；衍生化和标准加入法导致一个样品的分析时间长；衍生化试剂毒性较大；较长的仪器分析测试时间，这些均满足不了目前高通量、快速、准确、高效、安全的检测方法要求。

发明内容

本发明旨在针对现有的食品中丙烯酰胺检测方法操作繁琐、耗时、准确性低、毒性较大等问题，特别是针对处理基质复杂的色深液态调味品净化效果不理想的问题，提供一种液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法。该检测方法是将基质分散固相萃取法联合超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪测定基质复杂的液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法，具有针对色深液态调味品、操作简单、高通量、快速高效、准确安全的特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法，具体包括以下步骤：

1）样品前处理：称取样品，并加入内标物后，加水稀释，并与硅藻土混合均匀，获得已经混合样品的硅藻土；取玻璃层析柱依次装入棉花、下层无水硫酸钠、已经混合样品的硅藻土以及上层无水硫酸钠，敲实，平衡；

2）丙烯酰胺的净化及提取：向步骤1）的玻璃层析柱中加入乙酸乙酯，控制流速进行3～5次吸附洗脱，得洗脱液A；将洗脱液A进行浓缩，用乙酸乙酯溶液洗涤并转移到离心管中；在室温下将浓缩液吹近干，然后加水超声溶解，再加入正己烷涡旋后离心，取水层过滤，获得待测提取液B；

3）仪器检测：将步骤2）中所得待测提取液B放入超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪中采用正离子电离模式和多反应监测模式（MRM）进行检测，通过内标法定量，经3分钟色谱分析检测出样品中丙烯酰胺的含量。

步骤1）中所述的样品为基质复杂的色深液态调味品；优选为生抽、老抽和卤水汁中的一种；

步骤1）中所述的内标物优选为甲基丙烯酰胺；内标物在提取液B中的终浓度优选为0.02～0.2ug/mL；

步骤1）中所述的样品与水的质量比为1～3：7～9；

步骤1）中所述的样品与水的质量和等于所用硅藻土的质量；

步骤1）中所述的平衡的时间为3～6min；

步骤1）中所述的下层无水硫酸钠和上层无水硫酸钠的柱高分别为1～2cm；

步骤2）中所述的洗脱中每次所用乙酸乙酯的量优选为10～20ml；

步骤2）中所述的控制流速优选为1滴/秒的流速；

步骤2）中所述的用乙酸乙酯溶液洗涤的次数优选3～5次；

步骤2）中所述的吹干优选为用氮气吹干；

步骤2）中所述的加水的加入量为1～5ml；水和正己烷的用量的体积比为1～5：3～5；

步骤2）中所用正己烷主要用于脱脂；

步骤2）中所述的离心优选为在4000～8000r/min下离心5～10min；

步骤2）中所述的过滤优选为用0.22um的过滤膜过滤；

步骤3）所述的色谱条件为：

色谱柱为超高效液相色谱专用C18色谱柱；

流动相A为乙酸铵甲酸溶液（5～10nmol/mL，甲酸（FA）体积分数为0.05～0.1%），流动相B为甲醇，流速为0.2mL/min；

流动相梯度洗脱条件：a）甲醇：5%线性变化至40%～65%，用时2～3min；b）甲醇：40%～65%马上变化至5%，保持1～2min；

步骤3）中所述的电离模式为ESI+；

步骤3）中所述的多反应监测模式（MRM）推荐条件为：

丙烯酰胺：定量离子对：71.9>54.6，一级锥孔电压20～25kv，碰撞能量：5.0～11.0kv，驻留时间为0.1～0.4min；定性离子对：71.9>43.8，一级锥孔电压20～25kv，碰撞能量5.0～11.0kv,驻留时间为0.1～0.4min。

甲基丙烯酰胺：离子对：85.7>57.6，一级锥孔电压20～25kv，碰撞能量：5.0～11.0kv，驻留时间为0.1～0.4min。

本发明的技术方案为使用基质分散固相萃取法提取并净化液态调味品中的丙烯酰胺，并对提取的丙烯酰胺进行浓缩、脱脂，结合超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪（UPLC/MS/MS）进行快速检测，并用内标法来进行定量，以此提高本检测方法准确性。

本发明方法中，使用以硅藻土为材料的基质分散固相萃取法代替常规检测方法中用水提取、过柱、离心净化的步骤，提取与净化同时进行；而且硅藻土能较好地吸附样品中的复杂基质，选择极性适合的试剂可实现选择性地将丙烯酰胺洗脱下来的同时极性高的杂质不被洗脱。在大大缩短了前处理时间的同时起到很好的样品净化效果。在仪器检测阶段，使用超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪进行含量测定，分析时间（3min）比常用的方法缩小1/3，大大提高了检测效率。使用内标法定量进一步提高方法的准确性。内标物采用与丙烯酰胺化学性质相近的甲基丙烯酰胺，既起到内标物的作用，同时使用成本低，易于在企业日常分析中应用。

与现有技术的国标分析检测方法（GB/T5009.204-2005）等相比，本发明所提出的丙烯酰胺检测方法主要有以下几点优势：

1）本发明方法具有技术方案步骤少，用时时间短的特点，实现一种快速处理样品技术：基质分散固相萃取法，大大缩短样品处理时间。现有技术的GB/T5009.204-2005等分析方法为5步检测，用时为27小时左右；本发明方法仅需3步检测，用时6小时左右。

2）本发明方法分析时间大大减少，在仪器分析使用的时间上，现有技术的GB/T5009.204-2005等分析方法为10分钟以上，本发明方法用时为3分钟。

3）本发明方法无需衍生，减少步骤和损失，而现有技术的检测方法大都需要衍生化处理。

4）本发明方法使用的内标法具有高通量的特点，能同时处理多个样品，效率较高。现有技术的GB/T5009.204-2005等分析方法使用标准加入法，要得到一个样品的数据需要同时处理4个相同样品，因此1次只能处理1个样品；本发明使用内标法，能同时处理至少5个样品，得到5不同样品的数据。

5）本发明方法检测限优于国标方法。本发明的检测限为5μg/kg，优于国标方法的检测限7μg/kg。

6）本发明方法能较好的净化样品并获得良好的色谱峰，定性定量准确。现有技术中GB/T5009.204-2005等分析方法所得净化样品颜色较深，在目标峰处杂峰较多，干扰定性定量；本发明方法所得净化样品颜色为淡黄色，在目标峰处杂峰少。

附图说明

图1为本发明实施例1中标准溶液的丙烯酰胺质谱图。

图2为本发明实施例1中标准溶液的丙烯酰胺（500ng/mL）和甲基丙烯酰胺（200ng/mL）总离子流图。

图3为本发明实施例1中标准溶液的丙烯酰胺（500ng/mL）和甲基丙烯酰胺（200ng/mL）的MRM色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，选用了广东珠江桥生物科技股份有限公司的生抽、老抽及卤水汁作为分析物，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

1）直接称取生抽样品2g于烧杯中，加入内标物甲基丙烯酰胺（10ug/mL）0.02mL，加入8g的水溶解稀释，加入10g硅藻土混合。取玻璃层析柱，依次垫棉花、1cm高的无水硫酸钠，然后加入混合好的样品，再加一层1cm高的无水硫酸钠，平衡3min。

2）加入20mL的乙酸乙酯，控制流速1滴/秒，用100mL梨形瓶接液；待溶液完全流出，让柱子重新吸附3min；如此进行3次的吸附洗脱及接液。将所得液进行浓缩至1mL左右并转移刻度管。用乙酸乙酯进行3次洗涤梨形瓶并转移至10mL离心管。在室温下用氮气吹干，用1mL水超声溶解，加入3ml正己烷涡旋。用5000r/min转速离心10min后，取水层用0.22um滤膜过滤，获得待测提取液。

3）上机检测并计算丙烯酰胺含量：将步骤2）中所得待测提取液放入超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪中进行检测；本发明质谱方法采用正离子电离模式和多反应监测模式（MRM）进行检测，使用内标法定量，色谱分析时间为3分钟；对实施例中样品进行了精密度及回收率试验，标准曲线制作显示在本实验条件下获得良好的线性关系，相关系数R2均大于0.999，表明该检测方法具有良好的精密度及准确度，实验结果可靠。

本实例配制的标准溶液的线性范围在5～1000ng/mL。稀释液为水。用甲醇配制母液10ug/mL。定量限为5μg/kg。

具体配置如下：

标准溶液配制：

丙烯酰胺溶液：准确称取丙烯酰胺标准物质0.025g，用色谱纯甲醇定容至25mL，制成标准储备液。吸取标准储备液0.25mL，用纯水稀释定容至25mL，制成标准工作液10μg/mL。

甲基丙烯酰胺溶液：准确称取甲基丙烯酰胺标准物质0.025g，用色谱纯甲醇定容至25mL，制成标准储备液。吸取标准储备液0.25mL，用纯水稀释定容至25mL，制成标准工作液10μg/mL。

标准曲线的配制：

吸取丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺标准工作液，用纯水稀释，配制系列标准溶液，含甲基丙烯酰胺内标200ng/mL，含丙烯酰胺5，10，50，100，500，1000ng/mL。

检测的色谱条件为：

色谱柱为超高效液相色谱专用C18色谱柱；

流动相A为乙酸铵甲酸溶液（5nmol/mL，FA0.1%），流动相B为甲醇，流速为0.2mL/min。

流动相梯度洗脱条件如表1：

表1流动相梯度洗脱条件

步骤	时间（min）	流速（mL/min）	A％	B％	曲线
						1	——	0.2	95	5	——
2	2.00	0.2	50	50	6
						3	3.00	0.2	95	5	1

色谱分析时间为3min。

质谱条件为：电离模式：ESI+。

多反应监测模式（MRM）推荐条件如表2：

表2多反应监测模式（MRM）推荐条件

图1为本发明实施例1中标准溶液的丙烯酰胺质谱图。

图2为本发明实施例1中标准溶液的丙烯酰胺（500ng/mL）和甲基丙烯酰胺（200ng/mL）总离子流图。

图3为本发明实施例1中标准溶液的丙烯酰胺（500ng/mL）和甲基丙烯酰胺（200ng/mL）的MRM色谱图。

实施例2：直接称取老抽样品2g于烧杯中，按照上述实验步骤进行操作，测定产物的含量。

实施例3：直接称取卤水汁样品2g于烧杯中，按照上述实验步骤进行操作，测定产物的含量。

实施例1～3检测调味品中丙烯酰胺精密度与加标回收率试验结果如表3所示；

表3调味品中丙烯酰胺精密度与加标回收率试验结果（n＝6）

上述表格中，加标值为添加到样品中丙烯酰胺的浓度；平均回收率=平均测定值/加标值×100%；RSD为相对标准偏差，就是标准偏差与测量结果算术平均值的比值，相对标准偏差（RSD）=标准偏差（SD）/计算结果的算术平均值（X）×100%）。

从以上可以看出，本发明所提供的检测方法检测限低（5μg/kg），方法稳定性实验中回收率均在90%以上，RSD均在7.0%以下，结果准确度及精密度较高，结果可靠。且方法操作快速简单，耗时短，所使用的溶剂及试剂安全且分析成本低，能同时测定多个样品，所选仪器分析速度快，检测周期大大缩短。与国标方法相比较，具有显著的优势。对于广大调味品企业用于进行原料和产品中丙烯酰胺的风险评估与食品安全监控具有重要的意义和实用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法，其特征在于具体包括以下步骤：

1）样品前处理：称取样品，并加入内标物后，加水稀释，并与硅藻土混合均匀，获得已经混合样品的硅藻土；取玻璃层析柱依次装入棉花、下层无水硫酸钠、已经混合样品的硅藻土以及上层无水硫酸钠，敲实，平衡；

2）丙烯酰胺的净化及提取：向步骤1）的玻璃层析柱中加入乙酸乙酯，控制流速进行3～5次吸附洗脱，得洗脱液A；将洗脱液A进行浓缩，用乙酸乙酯溶液洗涤并转移到离心管中；在室温下将浓缩液吹近干，然后加水超声溶解，再加入正己烷涡旋后离心，取水层过滤，获得待测提取液B；

3）仪器检测：将步骤2）中所得待测提取液B放入超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪中采用正离子电离模式和多反应监测模式进行检测，通过内标法定量，经3分钟色谱分析检测出样品中丙烯酰胺的含量；

步骤1）中所述的样品为基质复杂的色深液态调味品。

2.根据权利要求1所述的液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法，其特征在于：步骤1）中所述的样品为生抽、老抽和卤水汁中的一种。

3.根据权利要求1所述的液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法，其特征在于：步骤1）中所述的内标物为甲基丙烯酰胺；内标物在提取液B中的终浓度为0.02～0.2ug/mL。

4.根据权利要求1所述的液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法，其特征在于：步骤1）中所述的样品与水的质量比为1～3：7～9；

步骤1）中所述的样品与水的质量和等于所用硅藻土的质量。

5.根据权利要求1所述的液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法，其特征在于：步骤1）中所述的平衡的时间为3～6min；

步骤1）中所述的下层无水硫酸钠和上层无水硫酸钠的柱高分别为1～2cm。

6.根据权利要求1所述的液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法，其特征在于：步骤2）中所述的洗脱中每次所用乙酸乙酯的量为10～20ml；

步骤2）中所述的控制流速为1滴/秒的流速；

步骤2）中所述的用乙酸乙酯溶液洗涤的次数为3～5次；

步骤2）中所述的吹干为用氮气吹干。

7.根据权利要求1所述的液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法，其特征在于：步骤2）中所述的加水的加入量为1～5ml；水和正己烷的用量的体积比为1～5：3～5；

步骤2）中所述的离心为在4000～8000r/min下离心5～10min；

步骤2）中所述的过滤为用0.22um的过滤膜过滤。

8.根据权利要求1所述的液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法，其特征在于：步骤3）所述的色谱条件为：

色谱柱为超高效液相色谱专用C18色谱柱；

流动相A为乙酸铵甲酸溶液，流动相B为甲醇，流速为0.2mL/min；所述的乙酸铵甲酸溶液浓度为5～10nmol/mL，其中甲酸体积浓度为0.05～0.1%；

流动相梯度洗脱条件：a）甲醇：5%线性变化至40%～65%，用时2～3min；b）甲醇：40%～65%马上变化至5%，保持1～2min。

9.根据权利要求1所述的液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法，其特征在于：步骤3）中所述的电离模式为ESI+。

10.根据权利要求1所述的液态调味品中丙烯酰胺含量的快速检测方法，其特征在于：步骤3）中所述的多反应监测模式条件为：

丙烯酰胺：定量离子对：71.9>54.6，一级锥孔电压20～25kv，碰撞能量：5.0～11.0kv，驻留时间为0.1～0.4min；定性离子对：71.9>43.8，一级锥孔电压20～25kv，碰撞能量5.0～11.0kv，驻留时间为0.1～0.4min；

甲基丙烯酰胺：离子对：85.7>57.6，一级锥孔电压20～25kv，碰撞能量：5.0～11.0kv，驻留时间为0.1～0.4min。

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