CN107102078A - 一种测定栀子黄中黄曲霉毒素b1的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种测定栀子黄中黄曲霉毒素B₁的方法，所述的方法包括如下步骤：称取一定量的栀子黄粉状样品，采用三氯甲烷进行萃取、浓缩、净化并过滤，之后再用超高效液相色谱‑串联质谱对其进行测定。本发明利用黄曲霉毒素B₁难溶于水而易溶于三氯甲烷，而栀子黄易溶于水难溶于三氯甲烷的特性，对栀子黄样品水溶液用三氯甲烷进行液液萃取，克服了因样品基质对目标物的干扰，降低了基质效应的影响，可有效避免假阳性或假阴性结果，定性准确。

Description

一种测定栀子黄中黄曲霉毒素B1的方法

技术领域

本发明属于食品添加剂技术领域，具体涉及一种测定栀子黄中黄曲霉毒素B₁的方法。

背景技术

黄曲霉毒素B₁对包括人和若干动物具有强烈的毒性，是已知的化学物质中致癌性最强的一种，对人畜危害极大。黄曲霉毒素是黄曲霉、寄生曲霉等产生的代谢产物。黄曲霉毒素广泛存在于土壤、大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶及其制品、食用油、肉类(鱼)制品、花生和核桃中等动植物和各种坚果中，特别是花生和核桃中。当人摄入含黄曲霉毒素B₁污染的食物，可发生急性肝炎、出血性坏死等急性中毒，甚至死亡；当微量持续摄入，可造成慢性中毒，生长障碍，致癌、致畸等。黄曲霉毒素在农产品中几乎无法避免，在天然食物中以黄曲霉毒素B₁最为多见，危害性最强，国家质检总局规定黄曲霉毒素B₁是大部分食品的必检项目之一。我国食品卫生标准中规定：玉米、花生油、花生及其制品中黄曲霉毒素不得>20μg/kg；大米、其它食用油不得>10μg/kg；其它粮食、豆类、发酵食品不得>5μg/kg；婴儿代乳食品不得检出黄曲霉毒素。欧盟等国于2002年对粮食，花生及其产品中的黄曲霉毒素B₁含量规定，人类直接使用的花生中黄曲霉毒素B₁含量需≤2μg/kg，作为食品原料进口的花生黄曲霉毒素B₁含量需≤8μg/kg。人们若食品中黄曲霉毒素含量超出一定标准，就会直接威胁到人的健康。

现有黄曲霉毒素B₁的检测方法包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。

薄层层析法不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和环境的污染危害较大，此法已逐渐被淘汰。

精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高校液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。

免疫学分析法包括酶免疫法、放射免疫法和时间分辨荧光法，酶免疫法，具有特异性强、灵敏度高、成本低、适于批量检测等优点，但一般为定性或半定量方法，在检测成分复杂的农产品中黄曲霉毒素时易受干扰，并存在假阳性的比例较高，检测准确度不高等缺点。

放射免疫法与酶免疫法相似，但放射免疫法还存在放射污染，对操作者及环境容易带来额外不利影响，应用较少。时间分辨荧光法是今年已有应用，检测灵敏度比前两者更高，但前处理仍较复杂，切所需仪器昂贵，限于医学临床诊断领域使用。

发明内容

为了克服传统检测方法处理繁琐、定性不准确、检出限高(灵敏度差)等缺点，本发明提供了一种测定栀子黄中黄曲霉毒素B₁的方法，该方法步骤简单、定性准确、检出限低(灵敏度高)，能满足检测栀子黄中黄曲霉毒素B₁的需求。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种测定栀子黄中黄曲霉毒素B₁的方法，所述的方法包括以下步骤：

1)提取栀子黄中黄曲霉毒素B₁：将栀子黄粉状样品与水混合，得到混合液，然后采用三氯甲烷萃取剂对混合液进行萃取，得到萃取液，萃取液浓缩、净化并过滤，得到待测液；

2)采用超高效液相色谱-串联质谱对步骤1)得到的待测液进行测定。

本发明中采用三氯甲烷作为萃取剂为本发明的一个重要发明点，现有方法对栀子黄样品中黄曲霉毒素测定前处理过程繁琐，易受色素等杂质干扰，灵敏度差，因此，申请人从黄曲霉毒素的化学性质入手进行研究，从溶解性能上看，黄曲霉毒素B₁难溶于水而易溶于三氯甲烷，而栀子黄易溶于水难溶于三氯甲烷，采用三氯甲烷对栀子黄样品水溶液进行萃取，能较好的将黄曲霉毒素B₁萃取出来，并且克服了因样品基质对目标物的干扰，降低了基质效应的影响，可有效避免假阳性或假阴性结果，定性准确。

优选的，步骤1)中所述的浓缩为在40-60℃的条件下旋转蒸发近干。

优选的，步骤1)中所述的净化为采用N-丙基乙二胺和C₁₈填料进行净化。

优选的，步骤1)中所述的净化为浓缩后采用体积分数为80-95％乙腈水溶液淋洗得到淋洗液，然后将淋洗液转入装有N-丙基乙二胺和C₁₈填料的离心管中，以10000r/min转速离心10min得到净化液。

优选的，步骤1)中所述的过滤为采用0.22μm有机滤膜进行过滤。

优选的，步骤2)中，所述的超高效液相色谱-串联质谱条件为：

色谱柱：BEH C₁₈，2.1×50mm，1.7μm；

柱温：40℃；

流动相：5mmol/L的甲酸铵+体积分数0.1％的甲酸水溶液、乙腈作为流动相进行梯度洗脱；

流速：0.4mL/min；

进样量：5μL；

质谱条件为：

检测方式：采用质谱检测器进行多离子反应监测；

电离方式：ESI+；

脱溶剂气温度：450℃；

脱溶剂气流速：900L/h；

毛细管电压：3.4kv；

离子源温度：150℃；

锥孔气流速：150L/h。

优选的，步骤2)中，所述的流动相进行梯度洗脱程序为：

时间(min)	流速(mL/min)	流动相A(％)	流动相B(％)
				0	0.4	90	10
2	0.4	10	90
				3	0.4	90	10
4	0.4	90	10

其中，流动相A为5mmol/L的甲酸铵+体积分数0.1％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，两者按照体积百分比混合。

优选的，步骤2)中，质谱检测器的采集参数为：

本发明的优点是：

1)本发明中前处理方法简单，目标物在前处理过程中损失少，回收率高，重复性好，定量准确；

2)本发明中通过选择合适的色谱柱，设定合适的色谱柱洗脱程序、监测离子、驻留时间、锥孔电压和碰撞能量，对样品中目标物进行最优化的分离和监测；

3)本发明中采用三氯甲烷作为萃取剂，从溶解性能上看，黄曲霉毒素B₁难溶于水而易溶于三氯甲烷，而栀子黄易溶于水难溶于三氯甲烷，采用三氯甲烷对栀子黄样品水溶液进行萃取，能较好的将黄曲霉毒素B₁萃取出来，并且克服了因样品基质对目标物的干扰，降低了基质效应的影响，可有效避免假阳性或假阴性结果，灵敏度高，定性准确。

附图说明

图1是本发明实施例1中黄曲霉毒素B₁标准溶液的选择离子流图；

图2是本发明实施例2中栀子黄样品中黄曲霉毒素B₁(加标浓度0.10μg/kg)的选择离子流图；

图3是本发明实施例3中栀子黄样品中黄曲霉毒素B₁(加标浓度0.20μg/kg)的选择离子流图；

三个选择离子流图中，纵坐标代表峰的强度，横坐标代表峰的保留时间；“MRM OF2Channels ES+”表示：正离子模式电离，多离子反应监测模式。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步的说明：

实施例1

以体积分数为90％乙腈水溶液为溶剂，配制浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0μg/L的黄曲霉毒素B₁系列标准溶液，利用超高效液相色谱-串联质谱检测，以外标法定量。具体操作如下：

高效液相色谱-串联质谱条件为：

色谱柱：BEH C₁₈，2.1×50mm，1.7μm；

柱温：40℃；

流动相：5mmol/L的甲酸铵+体积分数0.1％的甲酸水溶液(流动相A)、乙腈(流动相B)作为流动相进行梯度洗脱；

流速：0.4mL/min；

进样量：5μL；

质谱条件为：

检测方式：采用质谱检测器进行多离子反应监测；

电离方式：ESI+；

脱溶剂气温度：450℃；

脱溶剂气流速：900L/h；

毛细管电压：3.4kv；

离子源温度：150℃；

锥孔气流速：150L/h；

将黄曲霉毒素B₁系列标准溶液样品注入所述色谱柱中，流动相进行梯度洗脱，洗脱程序如下：

流动相进行梯度洗脱程序为：

时间(min)	流速(mL/min)	流动相A(％)	流动相B(％)
				0	0.4	90	10
2	0.4	10	90
				3	0.4	90	10
4	0.4	90	10

其中，流动相A为5mmol/L的甲酸铵+体积分数0.1％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，两者按照体积百分比混合。

所述被色谱柱分离的样品进入质谱检测器进行检测，质谱检测器的采集参数为：

其中，标准溶液选择离子流图如图1，以峰面积y为纵坐标，浓度x为横坐标进行线性回归，结果如表1。

表1黄曲霉毒素B₁的保留时间，监测离子，线性方程及相关系数

真菌毒素名称	保留时间(min)	定量离子对	线性方程	相关系数
					黄曲霉毒素B1	1.32	313.2/241.3	y＝1939x+61.252	0.9997

在上述条件下，黄曲霉毒素B₁选择离子流图峰形尖锐、对称、保留时间稳定，黄曲霉毒素B₁的浓度与对应的峰面积相关性显著，说明检测方法可信。

实施例2

(1)称取10g栀子黄样品(不含黄曲霉毒素B₁)精确至0.01g，添加黄曲霉毒素B₁标准溶液，加标浓度为0.10μg/kg，得到含黄曲霉毒素B₁的栀子黄样品，将样品置于100mL烧杯中，用100mL水分次溶解转移样品至250mL分液漏斗；

(2)向分液漏斗中加入100mL三氯甲烷，剧烈震荡，混匀，静止分层；

(3)将下层溶液转入250mL圆底烧瓶，50℃旋转蒸发近干，用2mL体积分数为90％乙腈水溶液淋洗圆底烧瓶得到淋洗液；

(4)将淋洗液转入装有0.5g N-丙基乙二胺和0.5g C₁₈填料的离心管中，以10000r/min转速离心10min；

(5)将上述离心液通过0.22μm有机滤膜后，得到待测液；

(6)利用超高效液相色谱-串联质谱检测步骤(5)得到的待测液，具体操作如实施例1，设置三个平行测定，实验编号分别为S-1、S-2、S-3，选择离子流图如图2。由图2可知，栀子黄样品中黄曲霉毒素B₁峰形尖锐，对称，目标物保留时间1.32分钟处无明显杂质峰干扰，说明前处理过程中提取、净化效果较好。

栀子黄样品中黄曲霉毒素B₁的测试结果见表2，由表2可知，平行样中黄曲霉毒素B₁的相对标准偏差(RSD)为4.9％。对第一个平行样(实验编号S-1)平行测定5次，分析结果见表3。由表3可知，重复性测试的相对标准偏差为4.0％。

按照称样量10g，定容体积100mL、浓缩50倍计算，栀子黄样品中的黄曲霉毒素B₁的检出限为0.1μg/kg。

表2栀子黄样品中黄曲霉毒素B₁的测试结果

表3栀子黄样品中黄曲霉毒素B₁的重复性测试

实施例3

按照实施例2中样品前处理方法和仪器分析检测方法，对栀子黄样品(不含黄曲霉毒素B₁)添加黄曲霉毒素B₁标准溶液，进行不同加标浓度的实验。设置三个加标量，每个加标含量的样品作3次平行测量取平均值，根据实际加入量和实测结果，计算样品的加标回收率。结果见表4。由表4可知，样品的加标回收率范围为91.5-104％。加标浓度为0.20μg/kg的选择离子流图如图3所示，由图可知，栀子黄样品中黄曲霉毒素保留时间稳定，浓度与响应值线性关系良好，目标物回收率理想。

表4栀子黄样品中黄曲霉毒素B1的加标回收率

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种测定栀子黄中黄曲霉毒素B₁的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

1)提取栀子黄中黄曲霉毒素B₁：将栀子黄粉状样品与水混合，得到混合液，然后采用三氯甲烷萃取剂对混合液进行萃取，得到萃取液，萃取液浓缩、净化并过滤，得到待测液；

2)采用超高效液相色谱-串联质谱对步骤1)得到的待测液进行测定。

2.如权利要求1所述的一种测定栀子黄中黄曲霉毒素B₁的方法，其特征在于，步骤1)中所述的浓缩为在40-60℃的条件下旋转蒸发近干。

3.如权利要求1所述的一种测定栀子黄中黄曲霉毒素B₁的方法，其特征在于，步骤1)中所述的净化为采用N-丙基乙二胺和C₁₈填料进行净化。

4.如权利要求3所述的一种测定栀子黄中黄曲霉毒素B₁的方法，其特征在于，步骤1)中所述的净化为浓缩后采用体积分数为80-95％乙腈水溶液淋洗得到淋洗液，然后将淋洗液转入装有N-丙基乙二胺和C₁₈填料的离心管中，以10000r/min转速离心10min得到净化液。

5.如权利要求1所述的一种测定栀子黄中黄曲霉毒素B₁的方法，其特征在于，步骤1)中所述的过滤为采用0.22μm有机滤膜进行过滤。

6.如权利要求1所述的一种测定栀子黄中黄曲霉毒素B₁的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的超高效液相色谱-串联质谱条件为：

色谱柱：ACQUITYBEH C₁₈，2.1×50mm，1.7μm；

柱温：40℃；

流动相：5mmol/L的甲酸铵+体积分数0.1％的甲酸水溶液、乙腈作为流动相进行梯度洗脱；

流速：0.4mL/min；

进样量：5μL；

质谱条件为：

检测方式：采用质谱检测器进行多离子反应监测；

电离方式：ESI+；

脱溶剂气温度：450℃；

脱溶剂气流速：900L/h；

毛细管电压：3.4kv；

离子源温度：150℃；

锥孔气流速：150L/h。

7.如权利要求6所述的一种测定栀子黄中黄曲霉毒素B₁的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的流动相进行梯度洗脱程序为：

时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 0.4 90 10 2 0.4 10 90 3 0.4 90 10 4 0.4 90 10

其中，流动相A为5mmol/L的甲酸铵+体积分数0.1％的甲酸水溶液，流动相B为乙腈，两者按照体积百分比混合。

8.如权利要求6所述的一种测定栀子黄中黄曲霉毒素B₁的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的质谱检测器的采集参数为：