CN102539600A

CN102539600A - 一种样品中氨基丁酸的高效液相色谱分析方法

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Publication number: CN102539600A
Application number: CN2011104363513A
Authority: CN
Inventors: 程艳梅; 刘春芳; 王磊; 于慧娟; 朱生樑
Original assignee: Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Shanghai University of TCM
Current assignee: Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Shanghai University of TCM
Priority date: 2011-12-23
Filing date: 2011-12-23
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2031-12-23
Also published as: CN102539600B

Abstract

本发明涉及一种样品中氨基丁酸的高效液相色谱分析方法，它首先将待衍生样品与NaH₂CO₃和衍生试剂2,4-二硝基氟苯进行衍生化反应，再采用C18柱，以体积比1:1的乙腈和水的混合液为流动相A，以pH=3.3-3.7，0.05MKH₂PO₄溶液为流动相B，在0.8-1.2ml/min的流速、30-40℃的柱温、20-40μl的进样量下对衍生产物进行高效液相分析，并在350nm的波长下进行紫外检测，最终得到样品中氨基丁酸的含量。该高效液相色谱分析方法的运行时间短、基线稳定、回收率高、精密度和重复性良好，能有效分离检测脑组织中氨基丁酸含量，可广泛用于临床检测和科学研究。

Description

一种样品中氨基丁酸的高效液相色谱分析方法

技术领域

本发明涉及化学分析技术领域，具体地说，是一种样品中氨基丁酸的高效液相色谱分析方法。

背景技术

氨基酸类神经递质是调节机体生理活动的重要物质，这些氨基酸类递质的异常是诱发多种神经系统疾病，如兴奋性毒性反应、癫痫、舞蹈病、帕金森病的因素之一。

动物脑内含有的多种氨基酸类神经递质，按其功能主要分为两类，一类是兴奋性氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸等；另一类是抑制性氨基酸，包括甘氨酸、氨基丁酸（γ-aminobutyric acid ，GABA）和牛磺酸等。其中，GABA在动物脑组织中的含量大约为0.1-0.6mg/克组织，是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，具有很高的生理活性。因此，测定GABA的含量变化是研究中枢神经系统疾病的重要生化指标，必须建立一种快速、精确的脑组织中GABA的定量分析方法，以利于神经药理学研究的深入和临床神经系统疾病病因的探索。

经典的氨基酸分离方法是离子交换色谱法，此法需特殊装置氨基酸分析仪，造价高且分析时间较长，因而普及率较低；而荧光分光光度法检测灵敏度较低，且干扰因素较多。而高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）具有“三高一广一快”，即高压、高效、高灵敏度、应用范围广和分析速度快、载液流速快的特点，已经越来越多地应用于化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域，成为重要的分离分析技术。利用HPLC分析生物样品中的GABA含量则是一种较为理想的方法。

HPLC实验所用色谱柱常采用C18柱、C8柱以及CN柱，检测器使用紫外、荧光或电化学。流动相常采用强极性溶剂，如水、乙腈、甲醇以及磷酸盐缓冲液。不同种类、不同离子强度的缓冲液均可影响到氨基酸容量因子。洗脱一般采用二级或三级梯度洗脱方式，洗脱程序明显影响分离效果。摸索合适的HPLC条件是氨基酸分析的前提。

中国期刊《中国实验动物学报》，第19卷，第5期，报道了“高效液相荧光法测定大鼠脑内氨基酸类神经递质方法的改良”，该文献是采用高效液相荧光法对动物脑内氨基酸进行分离检测。但是目前关于操作简单、检测成本低、灵敏度高、快速有效的样品中氨基丁酸的HPLC分析方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种简便快速、高效灵敏的样品中氨基丁酸的高效液相色谱分析方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种样品中氨基丁酸的高效液相色谱分析方法，它包括以下步骤：

（a）将待衍生样品与NaH₂CO₃和衍生试剂2,4-二硝基氟苯进行衍生化反

应，得到可紫外吸收的衍生产物；

（b）对衍生产物进行高效液相色谱分析和紫外检测。

所述的衍生化反应是在500μl的待衍生样品中加入40-60μl的0.05mol/L的NaH₂CO₃溶液和100-300μl的质量百分数为0.2%的2,4-二硝基氟苯，40-60℃下反应30-50min，冷却，用甲醇-水定容至1ml。

所述的衍生化反应是在500μl的待衍生样品中加入50μl的0.05mol/L的NaH₂CO₃溶液和200μl的质量百分数为0.2%的2,4-二硝基氟苯，50℃下反应40min，冷却，用甲醇-水定容至1ml。

所述的甲醇-水是体积比为1:1的甲醇和水的混合溶液。

所述的待衍生样品是大脑样品中加入甲醇-水，旋窝混合，超声提取，离心取上清，于上清中加入乙腈，混匀，离心，最终收集得到的上清液。

所述的色谱分析的条件是：色谱柱是C18柱，柱长250mm×内径4.6mm×粒径4-6μm；流动相A是体积比1:1的乙腈和水的混合液；流动相B是0.05M KH₂PO₄，pH=3.3-3.7；流速为0.8-1.2ml/min；柱温为30-40℃；进样量是20-40μl。

所述的色谱柱的粒径为5μm，所述的流动相B的pH是3.5，所述的流速为1 ml/min，所述的柱温为35℃，所述的进样量为30μl。

所述的流动相B是用磷酸调节pH至3.3-3.7。

所述的紫外检测的紫外波长是350nm。

本发明优点在于：

1、本发明的样品中氨基丁酸的高效液相色谱分析方法能有效分离检测脑组织中氨基丁酸含量，运行时间短、基线稳定、回收率高、精密度良好且重复实验的变异系数小；

2、本发明的样品中氨基丁酸的高效液相色谱分析方法是采用紫外检测，对实验的要求较为宽松，操作简单，检测成本低，易于实施，可广泛用于临床检测和科学研究。

附图说明

附图1是试样液一的色谱图。

附图2是试样液二的色谱图。

附图3是试样液三的色谱图。

附图4是试样液四的色谱图。

附图5是试样液五的色谱图。

附图6是试样液六的色谱图。

附图7是混合标准品的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

以下实施例使用的仪器是：Agilent 1200高效液相色谱仪，紫外检测器；试剂及其来源是：GABA标准品购于Promega公司，甲醇、2,4-二硝基氟苯、NaH₂CO₃均购于Sigma公司，试剂用水为纯化水。

样品及其预处理：体重200±15g的雄性SD大鼠，冰面上断头取脑，均质混匀后，取2g大脑样品，加入18ml 甲醇-水（V:V=1:1），旋窝混合2min，超声提取5min，5℃，8000rpm离心10min，取1ml上清液，加入1ml乙腈，混匀，5℃，10000r/min，离心10min，收集上清液，得到待衍生样品。总共制备了七只SD大鼠的待衍生样品，分别记为待衍生样品一~待衍生样品七。

实施例1

（a）柱前衍生：

取待衍生样品一500μl，加入50μl 0.05mol/L NaH₂CO₃溶液和200μl 质量百分数为0.2%的2,4-二硝基氟苯，混匀，50℃水浴，反应40min，冷却至室温，用甲醇-水（V:V=1:1）定容至1mL，得到试样液一。

（b）HPLC分析和紫外检测：

色谱条件为：色谱柱：Zorbax SB-C18柱，柱长250mm×内径4.6mm×粒径5μm；流动相A：体积比1:1的乙腈和水的混合液；流动相B：0.05M KH₂PO₄溶液，用磷酸调pH至3.5；流速：1.0 ml/min；紫外检测波长：350nm；柱温：35℃；进样量：30μl；梯度洗脱程序为：

时间（min）	A/%	B/%
			0.0	10	90
15.0	80	20
			23.0	80	20
23.1	10	90
			28.0	10	90

取试样液一注入色谱仪，得到如图1所示的色谱图，按照面积归一化法计算GABA含量为4.014 μg/mL。

实施例2

（a）柱前衍生：

取待衍生样品二500μl，加入40μl 0.05mol/L NaH₂CO₃溶液和300μl 质量百分数为0.2%的2,4-二硝基氟苯，混匀，60℃水浴，反应30min，冷却至室温，用甲醇-水（V:V=1:1）定容至1mL，得到试样液二。

（b）HPLC分析和紫外检测：

色谱条件为：色谱柱：Zorbax SB-C18柱，柱长250mm×内径4.6mm×粒径6μm；流动相A：体积比1:1的乙腈和水的混合液；流动相B：0.05M KH₂PO₄溶液，用磷酸调pH至3.7；流速：0.8 ml/min；紫外检测波长：350nm；柱温：30℃；进样量：40μl；梯度洗脱程序同实施例1。取试样液二注入色谱仪，得到如图2所示的色谱图，按照面积归一化法计算GABA含量为3.541 μg/mL。

实施例3

（a）柱前衍生：

取待衍生样品三500μl，加入60μl 0.05mol/L NaH₂CO₃溶液和100μl 质量百分数为0.2%的2,4-二硝基氟苯，混匀，40℃水浴，反应50min，冷却至室温，用甲醇-水（V:V=1:1）定容至1mL，得到试样液三。

（b）HPLC分析和紫外检测：

色谱条件为：色谱柱：Zorbax SB-C18柱，柱长250mm×内径4.6mm×粒径4μm；流动相A：体积比1:1的乙腈和水的混合液；流动相B：0.05M KH₂PO₄溶液，用磷酸调pH至3.3；流速：1.2 ml/min；紫外检测波长：350nm；柱温：40℃；进样量：40μl；梯度洗脱程序同实施例1。取试样液三注入色谱仪，得到如图3所示的色谱图，按照面积归一化法计算GABA含量为3.071 μg/mL。

实施例4

（a）柱前衍生：

取待衍生样品四500μl，加入50μl 0.05mol/L NaH₂CO₃溶液和300μl 质量百分数为0.2%的2,4-二硝基氟苯，混匀，50℃水浴，反应30min，冷却至室温，用甲醇-水（V:V=1:1）定容至1mL，得到试样液四。

（b）HPLC分析和紫外检测：

色谱条件为：色谱柱：Zorbax SB-C18柱，柱长250mm×内径4.6mm×粒径5μm；流动相A：体积比1:1的乙腈和水的混合液；流动相B：0.05M KH₂PO₄溶液，用磷酸调pH至3.5；流速：0.8 ml/min；紫外检测波长：350nm；柱温：35℃；进样量：30μl；梯度洗脱程序同实施例1。取试样液四注入色谱仪，得到如图4所示的色谱图，按照面积归一化法计算GABA含量为4.205 μg/mL。

实施例5

（a）柱前衍生：

取待衍生样品五500μl，加入60μl 0.05mol/L NaH₂CO₃溶液和300μl 质量百分数为0.2%的2,4-二硝基氟苯，混匀，50℃水浴，反应50min，冷却至室温，用甲醇-水（V:V=1:1）定容至1mL，得到试样液五。

（b）HPLC分析和紫外检测：

色谱条件为：色谱柱：Zorbax SB-C18柱，柱长250mm×内径4.6mm×粒径5μm；流动相A：体积比1:1的乙腈和水的混合液；流动相B：0.05M KH₂PO₄溶液，用磷酸调pH至3.3；流速：1.0 ml/min；紫外检测波长：350nm；柱温：40℃；进样量：40μl；梯度洗脱程序同实施例1。取试样液五注入色谱仪，得到如图5所示的色谱图，按照面积归一化法计算GABA含量为4.867 μg/mL。

实施例6

（a）柱前衍生：

取待衍生样品六500μl，加入50μl 0.05mol/L NaH₂CO₃溶液和100μl 质量百分数为0.2%的2,4-二硝基氟苯，混匀，40℃水浴，反应30min，冷却至室温，用甲醇-水（V:V=1:1）定容至1mL，得到试样液六。

（b）HPLC分析和紫外检测：

色谱条件为：色谱柱：Zorbax SB-C18柱，柱长250mm×内径4.6mm×粒径4μm；流动相A：体积比1:1的乙腈和水的混合液；流动相B：0.05M KH₂PO₄溶液，用磷酸调pH至3.7；流速：1.0 ml/min；紫外检测波长：350nm；柱温：35℃；进样量：30μl；梯度洗脱程序同实施例1。取试样液六注入色谱仪，得到如图6所示的色谱图，按照面积归一化法计算GABA含量为3.541 μg/mL。

实施例7

（a）柱前衍生：

取待衍生样品七500μl，加入50μl 0.05mol/L NaH₂CO₃溶液和200μl 质量百分数为0.2%的2,4-二硝基氟苯，混匀，50℃水浴，反应40min，冷却至室温，用甲醇-水（V:V=1:1）定容至1mL，得到试样液七。

（b）HPLC分析和紫外检测：

色谱条件为：色谱柱：Zorbax SB-C18柱，柱长250mm×内径4.6mm×粒径5μm；流动相A：体积比1:1的乙腈和水的混合液；流动相B：0.05M KH₂PO₄溶液，用磷酸调pH至3.5；流速：1.0 ml/min；紫外检测波长：350nm；柱温：35℃；进样量：30μl；梯度洗脱程序同实施例1。取试样液七注入色谱仪，得到色谱图，按照面积归一化法计算GABA含量为3.624 μg/mL。

实施例8 本发明测定样品中GABA含量的方法学考察

1 回归方程和线性关系

（a）储备液的配制

精密称取GABA标准品0.100g，用1:1（V/V）甲醇-水溶解，定容至100mL，即GABA储备液浓度为1mg/mL。

（b）标准液的配制

移取25mL GABA储备液，用1:1甲醇-水稀释至100mL容量瓶中，此标准液浓度为GABA 250μg/mL。

（c）标准液系列的配制

分别移取适量上述标准液，用1:1甲醇-水配制成GABA浓度分别为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL标准液系列。

（d）标准工作液衍生

分别移取上述标准液系列200μL，加入200μL乙腈，50μL 0.05M NaH₂CO₃和200μL 质量百分数为0.2% 衍生试剂2,4-二硝基氟苯，混匀，50℃反应40min，反应结束后，冷却至室温，用1:1（V/V）甲醇-水定容至1mL，上机分析。标准工作液浓度见表1。

表1 标准工作液浓度

GABA 10μg/mL标样的色谱图如图7所示。以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算得到：GABA线性范围为0.05-10μg/mL，回归方程为Y=260.88290X-12.68598，相关系数为0.99997，其中，X代表浓度（含量），Y代表峰面积。

2 方法检出限

推算得到该方法的最低检出限为GABA：12 mg/kg。

3 标准品平均回收率和精密度

在实施例7的样品七内加标，测定峰面积，计算平均回收率和精密度，结果见表2。由表2可以看出，该色谱系统精密度良好，回收率较高。

表2 平均回收率和精密度实验结果

4 方法重复性实验

实施例1-7各重复5次，记录GABA的峰面积，计算变异系数，结果见表3。由表3可以看出重复实验的变异系数均较小，表明该方法重复性较好。

表3 重复性实验变异系数

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种样品中氨基丁酸的高效液相色谱分析方法，其特征在于，它包括以下步骤：

应，得到可紫外吸收的衍生产物；

（b）对衍生产物进行高效液相色谱分析和紫外检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的衍生化反应是在500μl的待衍生样品中加入40-60μl的0.05mol/L的NaH₂CO₃溶液和100-300μl的质量百分数为0.2%的2,4-二硝基氟苯，40-60℃下反应30-50min，冷却，用甲醇-水定容至1ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的衍生化反应是在500μl的待衍生样品中加入50μl的0.05mol/L的NaH₂CO₃溶液和200μl的质量百分数为0.2%的2,4-二硝基氟苯，50℃下反应40min，冷却，用甲醇-水定容至1ml。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的甲醇-水是体积比为1:1的甲醇和水的混合溶液。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的待衍生样品是大脑样品中加入甲醇-水，旋窝混合，超声提取，离心取上清，于上清中加入乙腈，混匀，离心，最终收集得到的上清液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的色谱分析的条件是：色谱柱是C18柱，柱长250mm×内径4.6mm×粒径4-6μm；流动相A是体积比1:1的乙腈和水的混合液；流动相B是0.05M KH₂PO₄，pH=3.3-3.7；流速为0.8-1.2ml/min；柱温为30-40℃；进样量是20-40μl。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的色谱柱的粒径为5μm，所述的流动相B的pH是3.5，所述的流速为1 ml/min，所述的柱温为35℃，所述的进样量为30μl。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述的流动相B是用磷酸调节pH至3.3-3.7。

9.根据权利要求1、2或6所述的方法，其特征在于，所述的紫外检测的紫外波长是350nm。