CN102539611B

CN102539611B - 一种全反式虾青素含量测定方法

Info

Publication number: CN102539611B
Application number: CN 201110437754
Authority: CN
Inventors: 龙祥; 万庆家; 胡志祥; 张秋玲; 史晓晨; 杨瑜
Original assignee: YUNNAN GREEN-A BIOENGINEERING Co Ltd
Current assignee: YUNNAN GREEN-A BIOENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2011-12-23
Filing date: 2011-12-23
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2031-12-23
Also published as: CN102539611A

Abstract

本发明提供一种全反式虾青素含量测定方法，该方法包括采用反相C18色谱柱，以丙酮-水作为流动相测定(3S，3′S)-全反式虾青素的含量。该方法适用范围广，适用于雨生红球藻、雨生红球藻提取物及雨生红球藻制剂(含提取物制剂)中(3S，3′S)-全反式虾青素含量测定，测定结果准确性高，针对性强。

Description

一种全反式虾青素含量测定方法

技术领域

本发明涉及一种雨生红球藻、雨生红球藻提取物及雨生红球藻制剂(含提取物制剂)中(3S，3′S)-全反式虾青素含量的测定方法。

背景技术

虾青素由中央多聚烯链和位于两侧的六元环组成，环上有α-羟基酮结构，是一种抗氧化能力很强的类胡萝卜素。3位和3′位上的羟基可与脂肪酸成酯，虾青素酯较游离虾青素更稳定。

虾青素的分子结构中含多个共轭双键，存在272种可能的几何异构体，常见的有四种：全反式、9Z、13Z、15Z，其中以全反式异构体最稳定。虾青素的分子结构中3位和3′位为手性碳原子，虾青素存在三种立体异构体(3S，3′S)、(3R，3′S)、(3R，3′R)，其构型影响其在体内的吸收、生物学功能和组织中的分布，其中以(3S，3′S)-全反式虾青素稳定性最高，活性最强。具体性质见表1。

表1虾青素的理化性质

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、团藻目(Volvocales)、红球藻科(Haematococcaceae)、红球藻属(Haematococcus)。营自养生活，运动细胞呈绿色，具2条顶生、等长、约等于体长的鞭毛，通过前端的叉状胶质管伸出细胞壁；细胞由广卵型到广椭圆形，宽15～20μm，长20～25μm；原生质体呈卵形，色素体杯状，成熟时呈网状或颗粒状；具有多个不规则排列的蛋白核，细胞壁和原生质体间由许多分枝或不分枝的细胞质连丝相连，伸缩泡多个，不规则地分散在原生质体内；储藏物质为淀粉。遇不良环境，运动细胞失去鞭毛，原生质体变圆，胶被逐步消失，并形成厚厚的囊壳，成为厚壁孢子，直径增大到25～50μm，其中积累大量的虾青素而呈红色、深红色。雨生红球藻粉(Haematococcus algae)为雨生红球藻经破壁、喷雾干燥或真空干燥而得的。目前，雨生红球藻被公认为自然界中生产天然虾青素的主要来源。

雨生红球藻中的虾青素大部分与脂肪酸结合成酯，其中以单酯占主导地位，少量以双酯形态存在。雨生红球藻中的大部分虾青素与虾青素酯为(3S，3′S)-全反式构型，其含量达到总虾青素含量的75％以上。且在雨生红球藻所有构型的虾青素中也以全反式构型的含量最高、稳定性最高、活性最强，故测定(3S，3′S)-全反式虾青素的含量对于有效评价及控制雨生红球藻及其提取物及其制剂的质量具有重要意义。

目前检测虾青素含量的方法主要采用分光光度法或HPLC法对样品中总虾青素进行测定，所测得的含量为虾青素的总含量，不能对其中占主导地位的含量高、稳定性高、活性强的(3S，3′S)-全反式虾青素开展专属性测定研究，检测的准确性存在缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定雨生红球藻、雨生红球藻提取物及雨生红球藻制剂(含提取物制剂)中(3S，3′S)-全反式虾青素含量的方法，以达到能准确检测出样品中占主导地位的(3S，3′S)-全反式虾青素的含量，并且准确性高、针对性强。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。

一种采用高效液相色谱法测定雨生红球藻、雨生红球藻提取物及雨生红球藻制剂(含提取物制剂)中(3S，3′S)-全反式虾青素含量的方法，该方法包括用二氯甲烷-正己烷溶液提取雨生红球藻、雨生红球藻提取物或制剂供试样品，并进行水解，然后采用反相C18色谱柱，以丙酮-水作为流动相，通过梯度洗脱来测定雨生红球藻、雨生红球藻提取物或制剂供试样品中(3S，3′S)-全反式虾青素的含量。

优选地，所述洗脱条件包括以下步骤：

在0至8分钟内流动相中所含丙酮的体积百分比为81％，水的体积百分比为19％；再于另外的15分钟内丙酮的浓度由81体积％匀速变化至89体积％，水的浓度由19体积％匀速变化至11体积％。

优选地，所述雨生红球藻、雨生红球藻提取物或雨生红球藻制剂(含提取物制剂)供试样品的制备包括以下步骤：

1)以二氯甲烷-正己烷(7∶3)溶液提取样品中的游离虾青素及虾青素酯，得到提取液；

2)将步骤1)得到的提取液以氮气吹干后用丙酮溶解，然后添加体积比为0.2％的羧基酯脂肪酶溶液，在氮气保护下进行酶水解处理，即可。

优选地，所述羧基酯脂肪酶溶液为0.2μg/mL的羧基酯脂肪酶溶液。

优选地，所述高效液相色谱法采用紫外检测器，检测波长为476nm。

优选地，所述流动相的流速为0.8mL/min。

优选地，所述反相C18色谱柱为YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm L.DS-5μm色谱柱，检测柱温为20℃。

优选地，所述采用HPLC高效液相色谱测定(3S，3′S)-全反式虾青素含量的方法包括以下步骤：

步骤1：取(3S，3′S)-全反式虾青素标准品进行高效液相色谱检测，作为(3S，3′S)-全反式虾青素的标准曲线；

步骤2：将由雨生红球藻、雨生红球藻提取物或雨生红球藻制剂(含提取物制剂)提取制得的供试样品进行高效液相色谱检测；

步骤3：将步骤2所得的高效液相色谱图谱与步骤1所得(3S，3′S)-全反式虾青素的标准曲线对比，计算得出雨生红球藻、雨生红球藻提取物或雨生红球藻制剂(含提取物制剂)中(3S，3′S)-全反式虾青素的含量。

优选地，所述采用HPLC测定(3S，3′S)-全反式虾青素含量还包括根据标准曲线计算样品中全反式虾青素的浓度。

优选地，所述采用HPLC测定(3S，3′S)-全反式虾青素含量还包括根据下式计算样品中全反式虾青素的含量：

X = \frac{(C \times 250) \times 100 %}{m \times 1000000}

其中，X表示(3S，3′S)-全反式虾青素的含量％(w/w)；C表示根据标准曲线计算出的样品中(3S，3′S)-全反式虾青素的浓度(μg/mL)；m表示样品的取样量(g)。

以下是本发明的详细描述。

本发明提供一种测定雨生红球藻、雨生红球藻提取物及雨生红球藻制剂(含提取物制剂)中(3S，3′S)-全反式虾青素含量的方法，该方法采用HPLC来测定(3S，3′S)-全反式虾青素的含量。

所述采用HPLC测定(3S，3′S)-全反式虾青素含量包括如下步骤：

1)对样品进行处理

以二氯甲烷-正己烷(7∶3)溶液提取样品中的游离虾青素及虾青素酯，得到提取液；将得到的提取液以氮气吹干后用丙酮溶解，然后添加羧基酯脂肪酶溶液在氮气保护下进行酶水解处理，即可；

2)在如下色谱条件下对以上经过处理的样品进行检测：

色谱柱：YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm L.D S-5μm；

流动相：丙酮(流动相A)和水(流动相B)，梯度洗脱；

流速：0.8mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：476nm；

柱温：20℃。

梯度洗脱条件：所述洗脱条件包括以下步骤：

3)根据下式计算样品中(3S，3′S)-全反式虾青素的含量：

X = \frac{(C \times 250) \times 100 %}{m \times 1000000}

该检测方法的原理是：虾青素酯经酶水解，会完全转化成游离虾青素，且几何构型不会发生变化。采用适宜流动相可以将游离全反式虾青素和顺式虾青素的色谱峰分开(分离度α＞1.5)。因此，采用HPLC法，用(3S，3′S)-全反式虾青素标准品作对照，可检测雨生红球藻中占主导地位的(3S，3′S)-全反式虾青素含量。

通过二氯甲烷-正己烷(7∶3)溶液对样品中的游离虾青素及虾青素酯进行提取，提取液用氮气吹干后用丙酮溶解，添加适量的羧基酯脂肪酶溶液在氮气保护、避光条件下进行水解处理，处理完毕后过滤，用HPLC色谱仪进行检测，计算含量。

在本发明的一个实施方案中，本发明采用HPLC测定(3S，3′S)-全反式虾青素含量包括如下步骤：

(1)供试品溶液制备

取样品0.025g精密称定，加二氯甲烷-正己烷(7∶3)溶液研磨，上清液转移至具塞试管中。重复上述操作至溶液无明显红色，合并上清液并用氮气吹干。残渣用丙酮溶解转移至10mL棕色容量瓶中，加50μL羧基酯脂肪酶溶液，用丙酮定容至刻度。摇匀后充氮保护，在室温下避光孵育10分钟，转移至25mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，摇匀即得。

(2)标准品溶液制备

①标准贮备液

精密称取(3S，3′S)-全反式虾青素标准品10mg，置10mL棕色容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，摇匀即得(3S，3′S)-全反式虾青素含量为1mg/mL的标准贮备液。

②标准溶液

分别精密吸取0.2、0.5、1、1.5、2mL标准贮备液于5个10mL棕色容量瓶中，分别用丙酮定容至刻度，摇匀即得(3S，3′S)-全反式虾青素含量分别为0.02、0.05、0.1、0.15、0.2mg/mL的系列标准溶液。

标准品溶液需临用时新配。

(3)标准曲线

分别精密吸取系列标准溶液各3μL，注入HPLC色谱仪，在如下色谱条件下进行测定：

色谱柱：YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm L.D S-5μm；

流动相：丙酮(流动相A)和水(流动相B)，按表2所示进行梯度洗脱；

流速：0.8mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：476nm；

柱温：20℃。

梯度洗脱条件：见表2，并以峰面积对虾青素浓度作标准曲线：y＝13065x-223(r＝0.9993)。

表2梯度洗脱条件

(4)样品测定

精密吸取供试品溶液3μL，注入HPLC色谱仪，测定，从标准曲线求得(3S，3′S)-全反式虾青素含量。

(5)结果计算

根据下式计算样品中(3S，3′S)-全反式虾青素的含量：

X = \frac{(C \times 250) \times 100 %}{m \times 1000000}

本发明检测雨生红球藻粉中(3S，3′S)-全反式虾青素含量的方法具有以下有益效果：

本发明通过样品前处理，将样品中的虾青素酯水解为游离的虾青素，采用HPLC与(3S，3′S)-全反式虾青素标准品进行对照，测定样品中(3S，3′S)-全反式虾青素的含量。该方法能准确检测出样品中(3S，3′S)-全反式虾青素含量，适用于雨生红球藻、雨生红球藻提取物及雨生红球藻制剂(含提取物制剂)中(3S，3′S)-全反式虾青素含量测定，样品经酶水解处理和特定的梯度洗脱，杂质少，测定结果准确性高，针对性强。

附图说明

图1参考文献中雨生红球藻粉皂化前的HPLC色谱图；

图2参考文献中雨生红球藻粉皂化后的HPLC色谱图；

图3本发明雨生红球藻粉供试样品酶水解前的HPLC色谱图；

图4本发明雨生红球藻粉供试样品酶水解后的HPLC色谱图；

图5(3S，3′S)-全反式虾青素标准品的HPLC色谱图

图6HPLC测定(3S，3′S)-全反式虾青素的线性关系。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1采用HPLC测定雨生红球藻粉中全反式虾青素的含量

1测定方法

1.1仪器与药品

仪器：HPLC色谱仪(美国安捷伦1100)；

试剂：常用试剂为分析纯，HPLC色谱仪流动相为色谱纯。丙酮：色谱纯；甲醇：分析纯；

二氯甲烷-正己烷(7∶3)溶液：取二氯甲烷70mL、正己烷30mL，摇匀即得；

Tris-HCl(0.025M pH 7.0)溶液配制方法如下：准确称取Tris粉6.057g溶解于800mL去离子水中，用稀盐酸调pH值至7.0，将调好pH值的Tris-HCl溶液转移至2000mL容量瓶中，用纯化水定容至刻度摇匀即得；

来源于小鼠骨髓瘤细胞株的羧基酯脂肪酶(R&D Systems公司产品，型号：5658CE)，其溶液(0.2μg/mL)配制方法如下：取1μg羧基酯脂肪酶，用Tris-HCl(0.025M pH 7.0)溶液溶解并转移至5mL容量瓶中，加Tris-HCl(0.025M pH 7.0)溶液稀释至刻度，摇匀即得。

氮气：氮气含量≥98.5％；

测试样品：雨生红球藻粉(采收雨生红球藻孢子，经破壁、干燥等工艺制成，藻种由中科院武汉植物园提供)；雨生红球藻粉由雨生红球藻制得，并可进一步制成雨生红球藻提取物和制剂。

(3S，3′S)-全反式虾青素标准品：购自德国Dr.Ehrenstorfer gmbh公司，编号：A9335-250mg，含量＞95％；

电子天平：美国METTLER公司，AES260型(十万分之一)。

1.2测定方法

以下测定方法需要在避光条件下进行，试验环境温度不宜超过25℃，样品处理过程均需氮气保护。

1.2.1色谱条件

色谱柱：YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm L.D S-5μm；

流动相：丙酮(流动相A)和水(流动相B)，按上述表2规定进行梯度洗脱；

流速：0.8mL/min；

检测器：紫外检测器；

检测波长：476nm；

柱温：20℃。

1.2.2供试品溶液制备

取样品0.025g精密称定，加二氯甲烷-正己烷(7∶3)溶液研磨，上清液转移至具塞试管中。重复上述操作至溶液无明显红色，合并上清液并用氮气吹干。残渣用丙酮溶解转移至10mL棕色容量瓶中，加50μL羧基酯脂肪酶溶液，用丙酮定容至刻度，摇匀后充氮保护，在室温下避光孵育10分钟，转移至25mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，摇匀即得。

1.2.3标准品溶液制备

①标准贮备液

②标准溶液

分别精密吸取0.2、0.5、1、1.5、2mL标准贮备液于5个10mL棕色容量瓶中，分别用丙酮定容至刻度，摇匀即得全反式虾青素含量分别为0.02、0.05、0.1、0.15、0.2mg/mL的系列标准溶液。

标准品溶液需临用时新配。

1.2.4测定

1.2.4.1标准曲线：分别精密吸取系列标准液各3μL，注入液相色谱仪，测定，以峰面积对虾青素浓度作标准曲线：y＝13065x-223(r＝0.9993)。

1.2.4.2样品测定：精密吸取供试品溶液3μL，注入液相色谱仪，测定。从标准曲线求得全反式虾青素含量。

1.2.5结果计算

根据下式计算样品中(3S，3′S)-全反式虾青素的含量：

X = \frac{(C \times 250) \times 100 %}{m \times 1000000}

计算出测试样品中全反式虾青素的含量见表3。

表3(3S，3′S)-全反式虾青素的含量

编号	(3S，3′S)-全反式虾青素质量百分比(％)
		1	1.01
2	1.21
		3	1.35
4	1.01
		5	1.15
6	1.26

1.3(3S，3′S)-全反式虾青素峰指认

雨生红球藻粉含有游离虾青素和虾青素酯，由于结合成酯的脂肪酸不同，虾青素酯种类繁多、存在形态各异，不可能对其进行逐一含量测定。在氮气保护、低温、避光条件下，雨生红球藻粉中的虾青素酯在酶溶液中水解成游离虾青素，水解过程不会破坏虾青素的结构与构型。

Yuan JianPing等(请参见Jian-Ping Yuan，Feng Chen.ChromatographicSeparation and Purification of trans-Astaxanthin from the Extracts ofHaematococcus pluvialis[J].Agric.Food Chem.1998，46，3371-3375，该文献在此全部引入作为参考)用0.05mol/L氢氧化钠甲醇溶液对雨生红球藻粉进行皂化，皂化前后的HPLC图谱分别见图1与图2，峰指认见表4。皂化后，面积最大的峰为1号峰——(3S，3S′)-全反式虾青素，保留时间大于15min的虾青素酯的峰(11～14，16～30，32号峰)基本消失。

表4参考文献中雨生红球藻粉皂化前后的HPLC色谱图峰指认

本发明用羧基酯脂肪酶溶液对雨生红球藻中的虾青素酯水解后进行HPLC检测。未经水解的雨生红球藻的HPLC谱图见图3，图中虾青素酯峰(保留时间大于12min的峰)较多。经羧基酯脂肪酶溶液水解后的雨生红球藻的HPLC谱图见图4。水解后(3S，3′S)-全反式虾青素(保留时间为7.6min左右的峰)增高为最高峰，虾青素酯峰基本消失。试验结果与参考文献基本一致。

本发明采用的(3S，3′S)-全反式虾青素标准品购自德国Dr.Ehrenstorfergmbh公司(编号：A9335-250mg，含量＞95％)，其HPLC图谱见图5。图5中的色谱峰与图1、2中的(3S，3S′)-全反式虾青素色谱峰的保留时间一致。因此，确认所采用标准品为(3S，3S′)-全反式虾青素标准品。

2方法学研究

2.1准确度试验

取已知含量的本品，分别精密称取适量(约相当于(3S，3′S)-全反式虾青素0.2mg)9份，按加样回收率测定法的标准，加入适量(3S，3′S)-全反式虾青素标准品(稀释后用刻度吸管滴加)，按含量测定项下方法测定。结果见表5。

表5准确度试验结果

结论：平均回收率为96.99％，RSD＝1.16％(n＝9)，准确度符合要求。

2.2精密度试验

2.2.1重复性

取同一份样品，按含量测定项下方法重复测定6次。结果见表6。

表6重复性试验结果

结论：RSD＝0.65％(n＝6)，重复性试验符合要求。

2.2.2中间精密度

取同一份样品，按含量测定项下方法，在不同时间，由不同分析人员重复测定6次。结果见表7。

表7中间精密度试验结果

结论：RSD＝0.94％(n＝12)，中间精密度试验符合要求。

2.3阴性对照

取不含全反式虾青素的阴性对照样品6份，按含量测定方法项下方法测定。结果见表8。

表8阴性对照试验结果

样品编号	样品量(g)	(3S，3′S)-全反式虾青素含量(％)
			1	0.02417	0
2	0.02611	0
			3	0.02536	0
4	0.02522	0
			5	0.02548	0
6	0.02532	0

结论：阴性对照样品未检出全反式虾青素，检测方法专属性符合要求。

2.4线性

以丙酮配制(3S，3′S)-全反式虾青素母液，分别吸取0.8、2、4、6、8mL于10mL棕色容量瓶中，用丙酮定容至刻度。摇匀，测定。结果见表9和图6。

表9线性试验结果

结论：线性实验相关系数0.9993，线性相关良好，线性满足标准要求。

2.5耐用性

2.5.1提取次数

通过对已精确测量出含量的样品，在2、3、4次二氯甲烷-正己烷(7∶3)溶液提取情况下测定样品中(3S，3′S)-全反式虾青素含量。结果见表10。

表10耐用性试验1结果

次数	2次	3次	4次
				样品1	1.05％	1.15％	1.16％
样品2	1.13％	1.23％	1.23％

结论：提取3次已经能满足要求，且满足耐用性要求。

2.5.2溶液稳定性

按前处理方法处理后的样品，在实验室摆放24h后按含量测定方法项下方法测定。结果见表11。

表11耐用性试验2结果

样品编号	处理后检测	摆放24h后检测
			1	1.15％	1.13％
2	1.34％	1.32％
			3	1.23％	1.21％

结论：样品溶液稳定性良好，24h内测量检测结果无显著差异。

耐用性结论：前处理及样品溶液稳定性均能满足耐用性要求。

试验证明，本发明所述(3S，3′S)-全反式虾青素含量测定方法准确度试验、精密度试验、专属性试验、线性试验、耐用性试验均符合要求。

Claims

1.一种测定（3S,3′S）-全反式虾青素含量的方法，其特征在于，所述方法为采用高效液相色谱法测定雨生红球藻及其提取物和制剂中（3S,3′S）-全反式虾青素含量的方法，该方法包括用二氯甲烷-正己烷溶液提取雨生红球藻、雨生红球藻提取物或制剂供试样品，并进行水解，然后采用反相C18色谱柱，以丙酮-水作为流动相，通过梯度洗脱测定雨生红球藻、雨生红球藻提取物或制剂供试样品中的（3S,3′S）-全反式虾青素的含量；所述梯度洗脱条件包括以下步骤：

在0至8分钟内流动相中所含丙酮的体积百分比为81％，水的体积百分比为19%；再于另外的15分钟丙酮的浓度由81体积%匀速变化至89体积%，水的浓度由19体积%匀速变化至11体积%。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述雨生红球藻、雨生红球藻提取物或雨生红球藻制剂供试样品的制备包括以下步骤：

1）以体积比为7：3的二氯甲烷-正己烷溶液提取样品中的游离虾青素及虾青素酯，得到提取液；

2）将步骤1）得到的提取液以氮气吹干后用丙酮溶解，然后添加体积比为0.2%的羧基酯脂肪酶溶液在氮气保护下进行水解处理，即可。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述羧基酯脂肪酶溶液为0.2μg/mL的羧基酯脂肪酶溶液。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用紫外检测器，检测波长为476nm。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8mL/min。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述反相C18色谱柱为YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm L.D S-5μm色谱柱，检测柱温为20℃。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述采用HPLC高效液相色谱测定（3S,3′S）-全反式虾青素含量的方法包括以下步骤：

步骤1：取（3S,3′S）-全反式虾青素标准品进行高效液相色谱检测，作为（3S,3′S）-全反式虾青素的标准曲线；

步骤2：将由雨生红球藻、雨生红球藻提取物或雨生红球藻制剂制得的供试样品进行高效液相色谱检测；

步骤3：将步骤2所得的高效液相色谱图谱与步骤1所得（3S,3′S）-全反式虾青素的标准曲线对比，计算得出雨生红球藻、雨生红球藻提取物或雨生红球藻制剂中（3S,3′S）-全反式虾青素的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述采用高效液相色谱法测定（3S,3′S）-全反式虾青素含量还包括根据下式计算样品中（3S,3′S）-全反式虾青素的含量：

X = \frac{(C \times 250) \times 100 %}{m \times 1000000}

其中，X表示（3S,3′S）-全反式虾青素的含量w/w%；C表示根据标准曲线计算出的样品中（3S,3′S）-全反式虾青素的浓度，所述浓度单位为μg/mL；m表示样品的取样量，所述m以g计。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法应用于雨生红球藻、雨生红球藻提取物及雨生红球藻制剂中（3S,3′S）-全反式虾青素含量测定。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述雨生红球藻制剂含雨生红球藻提取物制剂。