CN107102091B - 应用Asta-E-H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的方法 - Google Patents

应用Asta-E-H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明应用Asta‑E‑H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的方法，涉及一种天然植物中有效成分含量测定的方法。其目的是为了提供应用Asta‑E‑H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的方法，该方法采用脂肪酶催化水解经吐温80乳化后的雨生红球藻萃取物中的虾青素酯，然后采用高效液相色谱法对其中的虾青素进行测定。本发明的方法包括以下步骤：虾青素标准液的配制；磷酸盐缓冲液的配制；雨生红球藻萃取物样品液的制备；高效液相色谱法测定虾青素含量。本发明的方法酶解过程中不产生虾红素副产物及顺式游离态虾青素，检出限低，加样回收率高，线性关系良好，且成本低廉，易于推广应用。

Description

应用Asta-E-H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的 方法
技术领域
本发明涉及一种天然植物中有效成分含量测定的方法，特别是涉及一种借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料的方法。
背景技术
在人体内，虾青素可发挥多种健康功能，如：抗氧化、光保护、抗癌、增强免疫、维护眼睛健康和维护中枢神经系统健康等。因此，在保健食品、功能性食品添加剂、普通食品和饲料中具有广阔的应用前景。
雨生红球藻是目前已知的自然界中虾青素积累水平最高的生物资源，是天然虾青素的主要来源。雨生红球藻中的虾青素主要以虾青素酯的形式存在，其中，单酯占多数。
目前，雨生红球藻已经在我国被批准为新食品原料，在食品中合法使用。其中虾青素的含量成为以虾青素为功效因子或标志性成分的保健食品和食品添加剂产品的主要质量控制指标。因此，雨生红球藻及其萃取物和产品中虾青素含量的测定方法被越来越多地关注。目前，已报导的检测方法有四类：(1)国标GBT 31520-2015中记载的方法。在检测雨生红球藻及萃取物中虾青素的含量时，首先将虾青素酯皂化，使虾青素酯水解成游离态的虾青素，而后采用外标法在C30-HPLC上进行定量。该方法存在的问题是皂化可能产生副产物—虾红素，同时由于虾青素的生物活性，在碱皂化过程中损失量极大，对检测结果产生影响。(2)另一类方法是将虾青素酯酶促水解成游离态的虾青素，而后再采用外标法在C30-HPLC上进行定量。该方法中使用的水解酶为胆固醇酯水解酶。该方法源于美国药典，日本的富士化学株式会社、青岛森淼生物技术有限公司、云南爱尔发虾青素生物技术有限公司等企业的企业标准中均采用此方法。但是胆固醇酯酶是一种针对于胆固醇酯的水解酶，对虾青素的专一性较差，检测过程中重复性较差，在反应中易产生顺式游离态虾青素，影响检测结果，且胆固醇酯水解酶的价格较高，不易推广。(3)第三类方法是不经过水解，以UV-VIS法为基础，测定萃取物中总类胡萝卜素的吸光值，推断其中游离态虾青素的含量，详见惠伯棣等人的报导，该方法检出限太高，线性关系较差，且对分析人员的要求极高，一般人员很难做到详细分析。(4) 此外，还有一些方法专注于光学异构体的检测，更难于应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种应用Asta-E-H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的方法，该方法采用源于毕赤酵母突变株的新型脂肪酶Asta-E-H为水解用酶，催化水解雨生红球藻萃取物中的虾青素酯，将虾青素酯乳化后，溶解于磷酸盐缓冲体系中，并将脂肪酶溶解于磷酸盐缓冲液中，在特定的反应条件下，完成虾青素酯的水解，然后将水解产物用正己烷萃取后，再采用高效液相色谱法对其中的虾青素进行测定。
本发明涉及一种应用Asta-E-H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)虾青素标准液的配制：称取0.95～1.05mg(精确至0.00001g)虾青素标准品，记为 MB，用丙酮定容至10mL，取1mL用丙酮定容至5mL；虾青素标准液的浓度为CAst：
Figure BDA0001323217520000021
(2)磷酸盐缓冲液的配制：11.411g磷酸氢二钾溶解于500mL水中，得到0.05mol/L磷酸氢二钾溶液；6.8045g磷酸二氢钾溶解于500mL水中得到0.05mol/L磷酸二氢钾溶液；将61.5mL的0.05mol/L磷酸氢二钾溶液与38.5mL的0.05mol/L磷酸二氢钾溶液混合，得到0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7；
(3)雨生红球藻萃取物样品液的制备：
a、雨生红球藻供试液的配制：研钵中加入45～55mg吐温80，再加入45～55mg(精确至 0.00001g)雨生红球藻萃取物，记为MS，研磨乳化混匀后，加入3～5mL磷酸盐缓冲液溶解，之后用磷酸盐缓冲液定容至10mL，制得雨生红球藻供试液；
b、雨生红球藻萃取物的酶促水解：称取1g脂肪酶Asta-E-H粉剂，加入2～3mL磷酸盐缓冲液混匀，然后加入0.1mL步骤a中制得的雨生红球藻供试液，之后用磷酸盐缓冲液定容至5mL，31℃水浴5h，得到反应液；
酶粉的加入量：以雨生红球藻萃取物中每μg总类胡萝卜素加入1000～1500UAsta-E-H 脂肪酶粉剂；上述Asta-E-H脂肪酶催化水解虾青素酯的反应如图1所示；
c、反应液的前处理：取0.4mL步骤b制得的反应液，加入0.8mL蒸馏水混匀，加入1mL丙酮混匀，再加入1mL丙酮混匀，加入0.8mL正己烷混匀，静置30s后3000r/min离心5min；离心后的混合溶液分层，用移液枪移出上相液体，再重复用0.8mL正己烷萃取下相，静置离心，移出上相的操作，直至上相液体无色；合并上相萃取液，用氮气浓缩，最终吹干在1.5mL 的离心管中；
d、雨生红球藻萃取物样品液：向步骤c的离心管中加入0.1mL丙酮，超声30s后10000 r/min离心5min，得到用于高效液相色谱法分析的雨生红球藻萃取物样品液S；
(4)采用高效液相色谱法测定步骤(1)配制的虾青素标准液峰面积PB及步骤(3)制得的雨生红球藻萃取物样品液的峰面积PS，根据所得峰面积和虾青素标准液的浓度计算雨生红球藻萃取物中虾青素的含量。
优选地，所述步骤(3)中Asta-E-H脂肪酶粉剂的酶活为30000U/g～50000U/g。
优选地，所述步骤(4)高效液相色谱法测定虾青素含量中采用的色谱柱：YMC-Carotenoid S5 4.6*250m，流速：1mL/min；进样量：20μL；检测波长：470nm；柱温：25℃。
6.优选地，所述步骤(4)中高效液相色谱条件中流动相采用的梯度洗脱程序为：
0min时，流动相A：流动相B＝83:17；
15min时，流动相A：流动相B＝68:32；
23min时，流动相A：流动相B＝18:82；
27min时，流动相A：流动相B＝83:17；
35min时，流动相A：流动相B＝83:17；
上述流动相A为甲醇，流动相B为甲基叔丁基醚，上述比例为体积比。
优选地，所述雨生红球藻萃取物中虾青素的含量按下式进行计算：
Figure BDA0001323217520000031
式中：
X：雨生红球藻萃取物中虾青素的含量，％；
CAst：虾青素标准液浓度，mg/mL；
PS：雨生红球藻萃取物样品液的峰面积，mAU·S；
PB：虾青素标准液峰面积，mAU·S；
MS：雨生红球藻萃取物质量，mg。
本发明应用Asta-E-H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的方法与现有技术不同之处在于：
1、采用本发明的方法检测雨生红球藻萃取物中虾青素的含量，优点是不产生虾红素副产物及顺式游离态虾青素，检出限低，加样回收率高，线性关系良好，且成本低廉，易于推广应用。
2、经验证，本发明方法的RSD达到2.63％，加样回收率为100.08％，检出下限为40ng/mL，线性范围为0.04～25μg/mL。
附图说明
图1为应用Asta-E-H脂肪酶催化水解虾青素酯反应的化学方程式；
图2为虾青素标准品的C30-HPLC色谱图
图3为雨生红球藻萃取物水解前的C30-HPLC色谱图；
图4为雨生红球藻萃取物酶促水解物(即步骤(3)制得的样品)的C30-HPLC色谱图；
图5为验证试验质谱分析中水解产物的总离子流图；
图6为验证试验质谱分析中保留时间为9.61分组分的质谱图。
图7为验证试验质谱分析中保留时间为10.01分组分的质谱图；
图8为验证试验质谱分析中保留时间为9.61分组分的电子吸收光谱图；
图9为验证试验质谱分析中保留时间为10.01分组分的电子吸收光谱图。
具体实施方式
通过以下实施例和验证试验对本发明的应用Asta-E-H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的方法作进一步的说明。
以下实施例和验证试验中雨生红球藻萃取物为雨生红球藻超临界二氧化碳萃取物，购自云南麟珑微藻养殖有限公司。酶粉为Asta-E-H脂肪酶(粉剂)由秦皇岛惠恩生物技术有限公司提供。酶活为38000U/g(以橄榄油为底物)。虾青素参比样品购自Sigma(C/N：SML0982-50MG)，纯度：HPLC≥98％(W/W)。乙腈、乙酸乙酯均为色谱纯试剂，购自迪马科技(Dikma Technologies,USA)。吐温80、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、丙酮、正己烷、甲醇均为AR试剂，购自北京化工厂。配制流动相所用的水为经过逆流渗透处理的超纯水。氮气 (纯度：99.96％)购自北京气体公司。
所用设备：高效液相色谱仪购自岛津(中国)有限公司(Shimadzu,China)，型号为LC-20AB，配备SPD-M20A检测器。液质联机仪器由Thermo U-3000双三元液相色谱仪与Thermo LTQ Orbit rap XL高分辨质谱仪组成，离子源：大气压化学电离(Atmosphericchemical ionization，ACPI)，配有Xcalibur数据处理系统，购自美国Thermo FisherScientific公司。
实施例
本实施例的应用Asta-E-H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的方法按以下步骤进行：
(1)虾青素标准液的配制：称取1.03mg虾青素标准品，记为MB，用丙酮定容至10mL，取1mL用丙酮定容至5mL；虾青素标准液的浓度为CAst＝0.020188mg/mL：
Figure BDA0001323217520000051
(2)磷酸盐缓冲液的配制：11.411g磷酸氢二钾溶解于500mL水中，得到0.05mol/L磷酸氢二钾溶液；6.8045g磷酸二氢钾溶解于500mL水中得到0.05mol/L磷酸二氢钾溶液；将61.5mL的0.05mol/L磷酸氢二钾溶液与38.5mL的0.05mol/L磷酸二氢钾溶液混合，得到0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7；
(3)雨生红球藻萃取物样品液的制备：
a、雨生红球藻供试液的配制：研钵中加入50mg吐温80，再加入50.40mg雨生红球藻萃取物，记为MS，混匀后加入3～5mL磷酸盐缓冲液进行乳化，之后用磷酸盐缓冲液定容至10mL，制得雨生红球藻供试液；
b、雨生红球藻萃取物的酶促水解：称取1g脂肪酶Asta-E-H粉剂，加入2～3mL磷酸盐缓冲液混匀，然后加入0.1mL步骤a中制得的雨生红球藻供试液，之后用磷酸盐缓冲液定容至5mL，31℃水浴5h，得到反应液；
c、反应液的前处理：取0.4mL步骤b制得的反应液，加入0.8mL蒸馏水混匀，加入1mL丙酮混匀，再加入1mL丙酮混匀，加入0.8mL正己烷混匀，静置30s后3000r/min离心5min；离心后的混合溶液分层，用移液枪移出上相液体，再重复用0.8mL正己烷萃取下相，静置离心，移出上相的操作，重复萃取五次后上相液体无色；合并上相萃取液3.8mL，用氮气浓缩，最终吹干在1.5mL的离心管中；
d、雨生红球藻萃取物样品液：向步骤c的离心管中加入0.1mL丙酮，超声30s后10000 r/min离心5min，得到用于高效液相色谱法分析的雨生红球藻萃取物样品液S；
(4)采用高效液相色谱法测定步骤(1)配制的虾青素标准液峰面积PB为498.50mAu·S 及步骤(3)制得的雨生红球藻萃取物样品液的峰面积PS为335.52mAu·S，根据所得峰面积和虾青素标准液的浓度计算雨生红球藻萃取物中虾青素的含量为3.37％。
所得色谱图分别如图2和图4所示；
高效液相色谱条件为：采用的色谱柱为YMC-Carotenoid S5 4.6*250m，流速：1mL/min；进样量：20μL；检测波长：470nm；柱温：25℃。梯度洗脱程序如表1所示。
表1本实施例中的梯度洗脱程序(流动相A为甲醇，流动相B为甲基叔丁基醚)
Figure BDA0001323217520000061
图2为虾青素标准品的C30-HPLC色谱图，该组分保留时间为9.61分，图4雨生红球藻萃取物酶促水解后组分的保留时间与虾青素标准品的保留时间一致，证明雨生红球藻萃取物经Asta-E-H脂肪酶水解后的产物为游离虾青素；
图3为雨生红球藻萃取物水解前的C30-HPLC色谱图，结果显示：雨生红球藻萃取物中游离态虾青素的含量很少，大部分为虾青素酯。图4为雨生红球藻萃取物酶促水解后的C30-HPLC色谱图，结果显示，经Asta-E-H脂肪酶水解后，雨生红球藻萃取物中的虾青素酯消失，而游离虾青素的量明显增加。图3和图4的对比证实了：在Asta-E-H脂肪酶的催化下，萃取物中虾青素酯完全水解为游离态虾青素。
验证试验1
对雨生红球藻萃取物水解产物(即步骤(3)制得的样品)进行质谱分析。
HPLC-MS条件
离子源：大气压化学电离(APCI)，正离子模式扫描，毛细管温度为275℃，APCI雾化器温度为450℃，离子源电压为6.0KV，毛细管电压为35V，Tube lens为125V，鞘气为 50arb，辅助气为5arb，吹扫气为5arb，扫描范围为100-2000，扫描分辨率为30000。二级质谱数据采集为数据依赖型扫描(Data dependent zoom scan)，CID碰撞，碰撞归一化能量为35％。记录含类胡萝卜素发色团结构组分(即类胡萝卜素衍生物组分)。在一级质谱图上，记录各组分的分子离子峰m/z值。
在质谱条件建立的过程中，对离子化条件的变化对分子碎片形成的影响进行了系统的验证，以准确鉴定每个片段的分子离子峰。
所得结果如图5、图6、图7所示。图5为水解产物的总离子流图；图6为保留时间为9.61分组分的质谱图。图7为保留时间10.01分组分的质谱图。图6中荷质比为597.40(m/z)的片段为该组分的分子离子峰[M-H-]，与相同质谱条件下虾青素参比样品的分子离子峰荷质比相同。图7中荷质比为632.64(m/z)的片段为该组分的分子离子峰[M-H-]。
雨生红球藻萃取物水解产物的电子吸收光谱和质谱特征如图8、图9所示。图8为保留时间为9.61分组分的电子吸收光谱图。图9为保留时间为10.01分组分的电子吸收光谱图。图8显示：该组分的最大吸收波长为475nm，与虾青素参比样品的电子吸收光谱特征一致。图9显示：该组分的最大吸收波长为470nm。
经过与参比样品的色谱行为、电子吸收光谱特征(最大吸收波长)及质谱分子离子峰荷质比的比较，保留时间为9.61分的组分为全反式游离态虾青素。
保留时间为10.01分的组分不是虾青素。与已公布的国标(GB/P31521-2015红球藻中虾青素的测定液相色谱法)与企标(雨生红球藻粉：Q/SGY 0001S-2015[S].云南省卫生和计划生育委员会，2015：1-14.)相比，采用本方法在水解产物中未检出顺式异构体。
验证试验2
虾青素标准曲线的制作与虾青素的检测下限和线性范围
虾青素参比样品储备液的配制：准确(至0.00001克)称取虾青素参比样品1.03mg，加入1mL丙酮溶解，转移至10mL棕色容量瓶中，用丙酮定容，配制成103μg/mL的储备液，充氮后保存于-20℃冰箱中。用于HPLC分析。
质量浓度-峰面积回归曲线：采用逐级稀释的方式，并用丙酮定容，配制成14个不同质量浓度的标准样品液，分别为：0.00、0.02515、0.0503、0.1006、0.2012、0.40235、0.8047、 1.6094、3.21875、6.4375、12.875、25.75、51.5、103μg/mL。各取20L进样，在每个色谱图上，对虾青素组分峰积分，得到峰面积，做线性回归，得到质量浓度-峰面积线性回归曲线和线性方程，计算R2值。
在色谱图上按信噪比为2计算检出下限。根据质量浓度-峰面积回归曲线的范围确定虾青素的线性范围。
结果：
在C30-HPLC上，测定10个不同质量浓度的参比样品，得到线性回归曲线，回归方程： y＝24693x，R2＝0.9994，线性区间为：0.00～25.75μg/mL，检出下限为40ng/mL。
验证试验3
游离态虾青素定量分析的精确度和准确性的验证
水解产物(即步骤(3)制得的样品)中游离态虾青素的定性和定量分析
根据其色谱行为、电子吸收光谱和质谱特征与参比样品的比较，鉴定虾青素组分。根据组分的峰面积，从参比样品的质量浓度-峰面积回归曲线计算样品中虾青素的含量。
雨生红球藻萃取物中虾青素的含量按下式进行计算：
Figure BDA0001323217520000081
式中：
X：雨生红球藻萃取物中虾青素的含量，％；
CAst：虾青素标准液浓度，mg/mL；
PS：雨生红球藻萃取物样品液的峰面积，mAU·S；
PB：虾青素标准液峰面积，mAU·S；
MS：雨生红球藻萃取物质量，mg。
游离态虾青素定量分析结果的重复性
研究中所采用的HPLC系统和条件稳定，重复用参比样品进样6次以上，计算所得虾青素含量结果的平均值和RSD值。HPLC设备以及色谱条件的精密度良好。检测结果如表2所示。
表2样品重复性检测结果
Figure BDA0001323217520000082
表2结果显示，所测样品中虾青素平均含量为3.24[％W/W]。6次重复性实验的RSD为 2.63[％W/W]。这一结果证明该方法具有良好的精密度。
游离态虾青素的加样回收
分别准确(至0.00001g)称取6个48～56mg的样品，在每个样品乳化前加入1mg虾青素参比样品，按照上述方法测定其中虾青素的含量。最终，每个HPLC样品中游离态虾青素参比样品的添加量为2％。根据各样品实测虾青素含量与样品源虾青素的平均含量计算添加虾青素参比样品的回收率。结果如表3所示。
表3加样回收率检测结果
Figure BDA0001323217520000091
注：
Figure BDA0001323217520000092
表3结果显示，在6次平行添加实验中，游离态虾青素参比样品的平均回收率为100.08[％ W/W]。这一实验结果证明，该方法具有良好的准确度。
上述实施例和验证试验表明，采用Asta-E-H脂肪酶水解雨生红球藻萃取物中的虾青素酯可以达到良好的效果。在萃取物中，在游离态虾青素的分析中应用这种酶，取得了良好效果。在此基础上建立了良好的方法，具有良好的准确度和精确度。考虑到该酶的低廉成本，该方法有望在今后的相关产业的产品质量控制和检测中得到广泛的应用。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种应用Asta-E-H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(1)虾青素标准液的配制：称取0.95～1.05mg虾青素标准品，记为MB，用丙酮定容至10mL，取1mL用丙酮定容至5mL；虾青素标准液的浓度为CAst：
Figure FDA0002551732610000011
(2)磷酸盐缓冲液的配制：11.411g磷酸氢二钾溶解于500mL水中，得到0.05mol/L磷酸氢二钾溶液；6.8045g磷酸二氢钾溶解于500mL水中得到0.05mol/L磷酸二氢钾溶液；将61.5mL的0.05mol/L磷酸氢二钾溶液与38.5mL的0.05mol/L磷酸二氢钾溶液混合，得到0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为7；
(3)雨生红球藻萃取物样品液的制备：
a、雨生红球藻供试液的配制：研钵中加入45～55mg吐温80，再加入45～55mg雨生红球藻萃取物，记为MS，研磨乳化混匀后，加入3～5mL磷酸盐缓冲液溶解，之后用磷酸盐缓冲液定容至10mL，制得雨生红球藻供试液；
b、雨生红球藻萃取物的酶促水解：称取1g脂肪酶Asta-E-H粉剂，加入2～3mL磷酸盐缓冲液混匀，然后加入0.1mL步骤a中制得的雨生红球藻供试液，之后用磷酸盐缓冲液定容至5mL，31℃水浴5h，得到反应液；
c、反应液的前处理：取0.4mL步骤b制得的反应液，加入0.8mL蒸馏水混匀，加入1mL丙酮混匀，再加入1mL丙酮混匀，加入0.8mL正己烷混匀，静置30s后3000r/min离心5min；离心后的混合溶液分层，用移液枪移出上相液体，再重复用0.8mL正己烷萃取下相，静置离心，移出上相的操作，直至上相液体无色；合并上相萃取液，用氮气浓缩，最终吹干在1.5mL的离心管中；
d、雨生红球藻萃取物样品液：向步骤c的离心管中加入0.1mL丙酮，超声30s后10000r/min离心5min，得到用于高效液相色谱法分析的雨生红球藻萃取物样品液S；
(4)采用高效液相色谱法测定步骤(1)配制的虾青素标准液峰面积PB及步骤(3)制得的雨生红球藻萃取物样品液的峰面积PS，根据所得峰面积和虾青素标准液的浓度计算雨生红球藻萃取物中虾青素的含量。
2.根据权利要求1所述的应用Asta-E-H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的方法，其特征在于：所述步骤(3)中Asta-E-H脂肪酶粉剂的酶活为30000U/g～50000U/g。
3.根据权利要求1所述的应用Asta-E-H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的方法，其特征在于：所述步骤(4)中高效液相色谱条件为：采用的色谱柱为YMC-CarotenoidS54.6*250m；流速：1mL/min；进样量：20μL；检测波长：470nm；柱温：25℃；
所述步骤(4)中高效液相色谱条件中流动相采用的梯度洗脱程序为：
0min时，流动相A：流动相B＝83:17；
15min时，流动相A：流动相B＝68:32；
23min时，流动相A：流动相B＝18:82；
27min时，流动相A：流动相B＝83:17；
35min时，流动相A：流动相B＝83:17；
上述流动相A为甲醇，流动相B为甲基叔丁基醚，上述比例为体积比。
4.根据权利要求1-3中任意一项权利要求中所述的应用Asta-E-H脂肪酶定量检测雨生红球藻萃取物中虾青素的方法，其特征在于：所述雨生红球藻萃取物中虾青素的含量按下式进行计算：
Figure FDA0002551732610000021
式中：
X：雨生红球藻萃取物中虾青素的含量，％；
CAst：虾青素标准液浓度，mg/mL；
PS：雨生红球藻萃取物样品液的峰面积，mAU·S；
PB：虾青素标准液峰面积，mAU·S；
MS：雨生红球藻萃取物质量，mg。
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