CN111257447B - 一种分析食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法 - Google Patents

一种分析食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种分析食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法，属于稳定同位素技术研究领域。该方法包括1)选择不可交换氢的稳定氢同位素比值已知的糖化合物作为工作标准，发酵，转化成乙醇，测定发酵液中乙醇的氢同位素比值；2)建立δ2H糖不可交换氢＝a*δ2H乙醇+b；3)测定待测食品发酵液中乙醇的氢同位素比值；4)将待测食品发酵液中乙醇的氢同位素比值代入上述关系模型中，得待测食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值。本发明所提出的方法主要用于食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的测定，操作简单，实验成本低，分析快速效率高，安全无风险，适合大批量蜂蜜样品的分析测试。

Description

一种分析食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法
技术领域
本发明属于稳定同位素技术研究领域，尤其涉及一种分析食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法。
背景技术
随着人们消费观念的日益提升，食品作为人们日常生活中不可缺少的一部分，食品产业正迅猛发展。含糖食品(如蜂蜜、果汁)由于味道甘甜深受大众喜爱，然而，部分不法商家为了提高食品的甜度，往往掺杂价格低廉，营养价值低的非食品本身成分的糖类物质。
稳定同位素分布特征能够指示物质的来源信息，通过测定食品总糖中氢同位素组成特征从而测定食品中是否掺杂了非食品本身成分的糖化合物成为食品领域科技工作者研究重点。糖分子中与碳直接相连的氢原子很稳定，不与其他的氢原子进行交换，被称为不可交换氢，其同位素比值(δ2H糖不可交换氢)的特征更具研究与应用价值。为了准确测定食品中糖的不可交换氢部分的同位素比值，需排除食品中水的干扰，还需排除糖中羟基氢的影响。
目前流行的测定食品中总糖不可交换氢部分同位素比值的方法为始创于1980s的点特异性分馏-核磁共振(SNIF-NMR)法。该方法中，需要①将食品(例如蜂蜜)稀释后经过酵母菌发酵转换成乙醇，将糖中的一些不可交换氢转移到乙醇的甲基位点上；②通过特定微蒸馏系统在保证无同位素分馏的情况下从发酵液中分离提取乙醇，③准确测定提取物中乙醇浓度并精确称量乙醇进样量，④使用大功率核磁共振波谱仪测定乙醇甲基上的氢同位素比值，记为食品中糖的不可交换氢的稳定氢同位素比值。
然而该技术存在两大缺点：①微蒸馏系统需要特别定制才能达到回收率高于96.5％、馏分中乙醇浓度大于95％v/v的要求，该微蒸馏系统为法国Eurofins公司的专利产品，单套需80万人民币，单次蒸馏的时间也需要4h以上，操作复杂；②核磁共振仪测定乙醇甲基的氢同位素比值，其原理是测定定量样品中甲基位点的氘的绝对含量，由于自然状态下氘的含量仅占氢原子的0.02％，因此，为得到足够的信噪比和稳定性，单一样品的测定时间长达5h以上。上述两个缺陷导致该项技术的分析效率很低。
于是，John Dunbar【Dunbar,J.,Schmidt,H.-.Measurement of the 2H/1Hratios of the carbon bound hydrogen atoms in sugars.Z.Anal.Chem.317,853–857(1981)doi:10.1007/BF00466937】等人提出了一种简单、成本低廉的分析方法，将葡萄酒中的糖进行硝化处理，用硝基取代蔗糖中的可交换氢，然后再燃烧成水，通过分析水的氢同位素比值进而得出糖中不可交换氢的氢同位素比值，但是该方法需要先从水、乙醇和有机酸中分离糖，并且涉及浓硝酸、乙酸酐等试剂的配制，存在安全风险，前处理过程依旧复杂。Simon Kelly等人提出将糖中的果糖分子用液相色谱分离收集后进行衍生处理，转化成六亚甲基四胺后用气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱分析，前处理过程仍需分离，且衍生化会引入了大量的非糖氢原子，难以准确测定，所得衍生物六亚甲基四胺的毒性较大，且该方法只适用于果糖分析，不能分析葡萄糖、蔗糖等糖类。因此长久以来均难以推广应用。
由于缺乏简单，易于长久使用的测定食品中糖的不可交换氢的稳定氢同位素特征的方法，SNIF-NMR方法在2000年被美国分析化学家协会(AOAC)采纳为官方标准。但近20年来，全球范围内能够熟练使用该方法并得到准确数据的实验室寥寥无几，我国至今尚无一单位能够运用该技术，这严重妨碍了我国在食品领域的一些研究与应用。
发明内容
本发明针对食品总糖中不可交换氢部分的稳定氢同位素比值难以分析的困境，开发了一种操作简单，分析快速效率高，安全无风险的分析食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法。
本发明提出一种分析食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法，包括如下步骤：
1)选择不可交换氢的稳定氢同位素比值已知的糖化合物作为工作标准，配制上述糖化合物的水溶液，发酵，转化成乙醇，测定发酵液中乙醇的氢同位素比值；
2)建立乙醇的氢同位素比值δ2H乙醇与作为工作标准的糖化合物中不可交换氢的稳定氢同位素比值δ2H糖不可交换氢的关系模型，得δ2H糖不可交换氢＝a*δ2H乙醇+b；
3)去除待测食品中水分，配制待测食品的水溶液，发酵，使得食品中糖分转变成乙醇，测定待测食品发酵液中乙醇的氢同位素比值；
4)将待测食品发酵液中乙醇的氢同位素比值代入上述关系模型中，计算，得待测食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值。
进一步地，步骤1)中，作为工作标准的糖类化合物至少为3个，且不可交换氢的稳定氢同位素比值互不相同。
进一步地，配制步骤1)中糖化合物的水溶液、配制步骤3)中待测食品的水溶液时，所使用的水来源相同，且水中氢同位素比值相同。
进一步地，步骤1)中糖化合物的水溶液中糖浓度、步骤3)中待测食品的水溶液中糖浓度相同；所述糖浓度为170g/L～280g/L。
进一步地，步骤1)、步骤3)中，发酵的条件相同；具体包括：向糖化合物的水溶液或待测食品的水溶液中加入活性干酵母，30±0.5℃厌氧发酵直至发酵结束。
进一步地，所述活性干酵母的添加量为0.5wt％。
进一步地，步骤3)中，去除待测食品中水分采用冷冻干燥方式。
进一步地，步骤2)、步骤4)中，乙醇的氢同位素比值用气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱仪测定。
任选地，确认气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱系统的工作环境、气密性、离子室的真空度均符合要求，检验仪器测定δ2H的精密度和稳定性，必要时调整离子源参数值。
进一步地，所述总糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖。可用于检测国标GB5009.8-2016中规定的中的5种糖。
进一步地，所述食品包括蜂蜜、果汁；所述果汁包括苹果汁、橙汁；所述蜂蜜包括椴树蜜、槐树蜜、枣花蜜。
本发明具有以下优势：
本发明基于代谢过程中的同位素分馏机理，选择不可交换氢的氢同位素比值已知的糖化合物作为工作标准，将其转化成乙醇后，测定乙醇中氢同位素比值特征，二者(已知的糖化合物氢不可交换氢的稳定氢同位素比值、转化成的乙醇中氢同位素比值)之间建立关系模型；待测食品去除水分后发酵将糖转化成乙醇，测定乙醇的氢同位素比值，将该结果代入关系模型中计算得待测食品中不可交换氢的稳定氢同位素比值。
本发明操作简单，实验成本低，分析快速效率高，安全无风险，适合大批量样品的分析测试。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。
实施例1建立作为工作标准的糖化合物发酵液中乙醇的δ2H乙醇与糖中不可交换氢δ2H糖不可交换氢的关系模型
1)选择三个糖化合物工作标准物质，其不可交换氢的δ2H糖不可交换氢值分别为-125.35‰、-101.25‰和-80.63‰；其中，工作标准的糖化合物优选葡萄糖，其不可交换氢的δ2H糖不可交换氢值通过John Dunbar等人所提出的方法测得。
2)将三个作为工作标准的糖化合物分别配制成170g/L的糖水溶液，加入0.5g活性干酵母后，30±0.5℃进行酒精发酵；
3)发酵液离心后取澄清液，用气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱仪测定发酵液中乙醇的δ2H乙醇值，结果见表1。
表1糖与乙醇的δ2H对比结果
Figure BDA0002380504050000041
根据表1数据可得，发酵液乙醇的δ2H乙醇与糖中不可交换氢的δ2H糖不可交换氢的关系模型：δ2H糖不可交换氢值＝0.9848*δ2H乙醇+241.88。其中，R2＝0.9854。
实施例2分析洋槐蜜中总糖不可交换氢的氢同位素比值
取1种洋槐蜜为研究对象，通过冷冻干燥的方式去除蜂蜜中的水分，再将固体粉末配制成170g/L的糖水溶液后，向100g溶液样品中加0.5g活性干酵母进行酒精发酵，测定发酵液中乙醇的δ2H乙醇测定值，该过程重复进行3次，结果见表2。
表2洋槐蜜样品发酵乙醇的δ2H乙醇测定值的重复性测定结果
指标 重复-1 重复-2 重复-3
δ<sup>2</sup>H<sub>乙醇测定</sub>(‰) -315.88 -311.26 -310.33
三次重复分析的结果的标准偏差为2.97‰，符合稳定同位素分析的要求(优于3‰)。
将表2各数据代入实施例1的关系模型中，计算得待测蜂蜜中总糖的不可交换氢的δ2H糖不可交换氢计算值，结果见表3。
表3洋槐蜜中总糖的不可交换氢的δ2H糖不可交换氢计算值
指标 重复-1 重复-2 重复-3
δ<sup>2</sup>H<sub>糖不可交换氢计算</sub>(‰) -69.20 -64.65 -63.73
实施例3分析椴树蜜中总糖不可交换氢的氢同位素比值
取3个椴树蜜为研究对象，通过冷冻干燥的方式去除蜂蜜中的水分，再将固体粉末分别配制成170g/L的糖水溶液后，向100g溶液样品中加0.5g活性干酵母进行酒精发酵，测定发酵液中乙醇的δ2H乙醇测定值，结果见表4。
表4椴树蜜转化的乙醇的δ2H乙醇测定测定结果
指标 椴树蜜-1# 椴树蜜-2# 椴树蜜-3#
δ<sup>2</sup>H<sub>乙醇测定</sub>(‰) -321.42 -310.05 -305.43
将表4各数据代入实施例1所得关系模型中，计算得出糖的不可交换氢的δ2H糖不可交换氢计算值，结果见表5。
表5椴树蜜中糖的不可交换氢的δ2H糖不可交换氢计算值计算结果
指标 椴树蜜-1# 椴树蜜-2# 椴树蜜-3#
δ<sup>2</sup>H<sub>糖不可交换氢计算</sub>(‰) -74.65 -63.46 -58.91
由表5和表3数据可知，本发明方法能够用于洋槐蜜、椴树蜜等各类蜂蜜中糖的不可交换氢的稳定氢同位素比值的分析。
实施例4分析橙汁中总糖不可交换氢的氢同位素比值
取1瓶鲜榨橙汁为研究对象，冷冻干燥去除水分，得到固体粉末后配制成170g/L的糖水溶液后，加活性干酵母进行酒精发酵，测定发酵液中乙醇的δ2H乙醇测定值，该过程重复进行3次，结果见表6。
表6橙汁发酵乙醇的δ2H乙醇测定值测定结果
指标 重复-1 重复-2 重复-3
δ<sup>2</sup>H<sub>乙醇测定</sub>(‰) -275.19 -278.24 -277.11
三次重复分析的结果的标准偏差为1.54‰，符合稳定同位素分析的要求(优于3‰)。
将表6各数据代入实施例1的关系模型中，计算得出糖的不可交换氢的δ2H糖不可交换氢计算值，结果见表7。
表7橙汁中总糖的不可交换氢的δ2H糖不可交换氢计算值
指标 重复-1 重复-2 重复-3
δ<sup>2</sup>H<sub>糖不可交换氢计算</sub>(‰) -29.14 -32.14 -31.02
实施例5分析测定果汁中总糖不可交换氢的氢同位素比值
为验证该该方法分析果汁样品的可推广特征，取2瓶鲜榨橙汁、1瓶鲜榨苹果汁和1瓶鲜榨葡萄汁为研究对象，测定发酵液中乙醇的δ2H乙醇测定值，结果见表8。
表8待测果汁发酵的乙醇的δ2H乙醇测定测定结果
指标 橙汁-1# 橙汁-2# 苹果汁 葡萄汁
δ<sup>2</sup>H<sub>乙醇测定</sub>(‰) -275.19 -291.27 -336.47 -313.85
将表8各数据代入实施例1的关系模型中，计算得出糖的不可交换氢的δ2H糖不可交换氢计算值，结果见表9。
表9果汁中糖的不可交换氢的δ2H糖不可交换氢计算值计算结果
指标 橙汁-1# 橙汁-2# 苹果汁 葡萄汁
δ<sup>2</sup>H<sub>糖不可交换氢计算</sub>(‰) -29.14 -44.97 -89.48 -67.21
由表7和表9数据可知，本发明方法能够用于各类果汁中糖的不可交换氢的同位素比值的分析。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种分析食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法，包括如下步骤：
1)选择不可交换氢的稳定氢同位素比值已知的糖化合物作为工作标准，配制上述糖化合物的水溶液，发酵，转化成乙醇，测定发酵液中乙醇的氢同位素比值；其中，作为工作标准的糖类化合物至少为3个，且不可交换氢的稳定氢同位素比值互不相同；糖化合物的水溶液中糖浓度、步骤3)中待测食品的水溶液中糖浓度相同；所述糖浓度为170g/L~280g/L；
2)建立乙醇的氢同位素比值δ2H乙醇与作为工作标准的糖化合物中不可交换氢的稳定氢同位素比值δ2H糖不可交换氢的关系模型，得δ2H糖不可交换氢=a*δ2H乙醇+b；
3)去除待测食品中水分，配制待测食品的水溶液，发酵，使得食品中糖分转变成乙醇，测定待测食品发酵所得发酵液中乙醇的氢同位素比值；
4)将待测食品发酵所得发酵液中乙醇的氢同位素比值代入上述关系模型中，计算，得待测食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值；
其中，步骤1)中糖化合物的水溶液、步骤3)中待测食品的水溶液配制过程所使用的水来源相同，且水中氢同位素比值相同；
步骤3)中，去除待测食品中水分采用冷冻干燥方式；
步骤2)、步骤4)中，乙醇的氢同位素比值用气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱仪测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)、步骤3)中，发酵的条件相同；具体包括：向糖化合物的水溶液或待测食品的水溶液中加入活性干酵母，30±0.5℃厌氧发酵直至发酵结束。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述总糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述食品包括蜂蜜、果汁；所述果汁包括苹果汁、橙汁；所述蜂蜜包括椴树蜜、槐树蜜、枣花蜜。
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