CN105388225A - 一种含胞磷胆碱钠的药物制剂中udpc的分析检测方法 - Google Patents

一种含胞磷胆碱钠的药物制剂中udpc的分析检测方法 Download PDF

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Abstract

一种含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的分析检测方法，其特征在于：该分析检测方法采用高效液相色谱法对含胞磷胆碱钠的药物制剂中杂质UDPC进行分析检测，色谱柱为Inersil？？ODS-3色谱柱；色谱柱的柱温为30~40℃；流动相为磷酸盐缓冲液-甲醇混合溶液，磷酸盐缓冲液的pH值为4.3~4.7；流动相的流速为0.9~1.1ml/min；使用紫外检测器，检测波长为276nm。本发明用高效液相色谱法，在一定色谱条件下有效分离胞磷胆碱钠及其各杂质，通过该方法能准确地测定胞磷胆碱钠中杂质UDPC的含量。

Description

一种含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的分析检测方法
技术领域
本发明属于药物分析化学领域，涉及对细胞代谢改善药胞磷胆碱钠注射液质量进行分析的方法，具体涉及一种胞磷胆碱钠注射液中尿苷二磷酸胆碱的分析检测方法，该分析检测方法主要采用液相色谱法(即HPLC)分离测定胞磷胆碱钠注射液中的杂质尿苷二磷酸胆碱。
背景技术
胞磷胆碱钠注射液的主要成分为胞磷胆碱钠(英文名：CiticolineSodium，CAS：33818-15-4)，化学名为胆碱胞嘧啶核苷二磷酸酯单钠盐。分子式为C14H25N4NaO11P2，分子量为510.31，其结构式如下：
胞磷胆碱是细胞膜结构性磷脂生物合成的中间物质。外源性给予胞磷胆碱，能通过增加磷脂的合成快速修复神经元细胞膜，促进乙酰胆碱和多巴胺的合成，稳定神经递质系统，并能够促进大脑的能量代谢。胞磷胆碱能增强上行性网状结构激活系统的功能，降低脑血管阻力，增加脑血流量，改善大脑血液循环，促进大脑物质代谢，功能恢复。
1956年Geiger在动物实验中发现胞磷胆碱能使脑损伤恢复。1957年Kennedy的研究证实其在脑磷脂质的合成中至关重要，1961年日本武田制药公司开发生产出此产品，并于1988年在我国注册。目前，该品种制剂上市剂型有片剂、胶囊剂及注射剂，依托我公司现有生产线，选择开发胞磷胆碱钠注射液剂型。国外上市的胞磷胆碱钠注射液规格有2ml：0.25g及5ml：0.5g；根据本品的用法用量及国内外上市产品的信息，确定我司研发的制剂规格为：胞磷胆碱钠注射液2ml：0.25g及5ml：0.5g。
胞磷胆碱钠注射液中的杂质UDPC(英文全称为Uridine5'-(trihydrogendiphosphate),P'-[2-(trimethylammonio)ethyl]ester,innersalt，CAS：99492-83-8，UDPC为英文简称)，化学名为尿苷二磷酸胆碱，分子式为C14H25N3O12P2，分子量为489.31，其结构式如下：
胞磷胆碱钠嘧啶环上的两个氮的孤对电子都没有共轭，在酸性条件下，它的氮被氢离子结合后有利于氨基离子(-NH3+)离去，水再作为亲核试剂取代，最后异构为杂质UDPC。
反应机理如下所示：
因此，实现胞磷胆碱钠及其杂质间的有效分离对测定胞磷胆碱钠和各杂质的量具有重大意义。目前，本领域仍然期待有用于控制胞磷胆碱钠注射液质量的有效方法，尤其是期待能够快速、准确地分析出胞磷胆碱钠注射液中杂质UDPC含量的方法。
发明内容
本发明目的是提供一种含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的分析检测方法，该分析检测方法是一种可用于控制胞磷胆碱钠质量的有效方法。用特定的色谱分析条件，包括使用C18色谱柱，以及使用磷酸盐缓冲液-甲醇分离测定胞磷胆碱钠注射液中相关杂质的高效液相色谱法，可以有效地实现胞磷胆碱钠中杂质UDPC的分离及测定。本发明人经过反复试验发现，用ODS-3(型号为C18，柱长×内径为150×4.6mm)色谱柱检测，以磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.5)等体积混合)]-甲醇(二者的体积比95：5)为流动相，可以将胞磷胆碱钠杂质UDPC进行有效分离，从而可以准确控制胞磷胆碱钠的质量。本发明的方法能简单、快速、准确地分离、检测出胞磷胆碱钠及其杂质含量。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的分析检测方法，该分析检测方法采用高效液相色谱法对含胞磷胆碱钠的药物制剂中杂质UDPC进行分析检测，包括以下步骤：
第一步，用高效液相色谱法分析系统适用性溶液，系统适用性溶液的进样量为20μl，记录色谱图中胞磷胆碱钠峰与5'-胞苷酸峰的分离度；
第二步，当所述第一步得到的胞磷胆碱钠峰与5'-胞苷酸峰的分离度大于1.5时，再用高效液相色谱法分析含胞磷胆碱钠的药物制剂样品溶液和对照溶液，药物制剂样品溶液和对照溶液的进样量均为10μl，记录色谱图至主成分保留时间的至少3倍，获得药物制剂样品溶液和对照溶液的高效液相色谱分析图，从中读取并计算杂质数量、杂质种类、杂质相对量、各色谱峰之间分离度中的至少一个信息；
第三步，将所述第二步中得到的高效液相色谱分析图中的峰面积值带入到公式中，计算出含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的含量，所述公式为UDPC的质量百分含量＝(药物制剂样品溶液中UDPC的峰面积÷对照溶液中胞磷胆碱钠的峰面积)×0.5％；
在所述第一步和第二步中，色谱条件为：
色谱柱为ODS-3色谱柱；色谱柱的柱温为30～40℃；流动相为磷酸盐缓冲液-甲醇混合溶液，其中磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95:5，磷酸盐缓冲液的pH值为4.3～4.7；流动相的流速为0.9～1.1ml/min；使用紫外检测器，检测波长为276nm。
上述技术方案中的有关内容解释如下：
1、上述方案中，含胞磷胆碱钠的药物制剂也可以指胞磷胆碱钠注射液。
2、上述方案中，所述系统适用性溶液的制备：将每100ml水中含有25mg的5'-胞苷酸对照品溶液与每100ml水中含有25mg的胞磷胆碱钠对照品溶液等体积混合，即得系统适用性溶液。
3、上述方案中，所述对照溶液的制备：精密量取所述药物制剂样品适量，用水定量稀释制成每1ml中含0.0125mg的溶液，作为对照溶液；
所述药物制剂样品溶液的制备：精密量取含胞磷胆碱钠的药物制剂样品适量，用水定量稀释制成每1ml中含胞磷胆碱钠2.5mg的溶液，即为药物制剂样品溶液。
“精密称取”系指称取重量应准确至所取重量的千分之一。
4、上述方案中，所述磷酸盐缓冲液是通过以下步骤获得的：将0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液等体积混合，即得磷酸盐缓冲液，其中，所述四丁基铵溶液取是通过用磷酸调节pH值至4.5的0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液得到的。
所述磷酸盐缓冲液具体是通过以下步骤获得的：取磷酸二氢钾13.6g，加1000ml水溶解；四丁基铵溶液的制备：取10％四丁基氢氧化铵26ml，加水至1000ml，用磷酸调节pH至6.5；取磷酸二氢钾溶液与四丁基铵溶液等体积混合，摇匀，即得。
5、上述方案中，所述色谱柱的柱温优选为35℃。
6、上述方案中，所述流动相的流速优选为1.0ml/min。
7、上述方案中，所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为4.45～4.55.
8、上述方案中，所述ODS-3色谱柱的生产厂商为日本GLSciences公司，该ODS-3色谱柱的填料粒径为4μm，色谱柱的内径4.6mm，色谱柱的柱长为150mm。以上型号参数可以简写为4μm，150×4.6mm，或简写为150mm×4.6mm×4μm，或其它类似简写方式。
9、上述方案中，所述磷酸盐缓冲液中还加入有离子对试剂，优选离子对试剂为10％四丁基氢氧化铵水溶液。发明人发现在流动相中加入离子对试剂，在不干扰两个已知杂质的前提下，能够更好地分离胞磷胆碱钠与杂质5′-胞苷酸和UDPC，并且有效改善峰形。
本发明设计特点是：本发明人发现，采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，即ODS-3(型号为C18，柱长×内径为150×4.6mm)色谱柱，能够有效分离胞磷胆碱钠中含有的两个已知杂质，即杂质5′-胞苷酸和UDPC；在柱箱温度为30～40℃的范围内具有相当好的分离效果，色谱峰的对称性良好；在pH值为4.3～4.7的范围内具有相当好的分离效果。
本发明方法针对胞磷胆碱钠中的杂质5′-胞苷酸和UDPC有良好的检测效果。另外，本发明采用等度条件对胞磷胆碱钠中的杂质进行分析，有如下优点：
(1)分析时间较短，快速，仅需15分钟左右即可完成胞磷胆碱钠中的杂质UDPC的分析检测。
(2)系统稳定，重现性较好。
(3)对高效液相色谱仪型号及性能要求不高，高效液相色谱仪可以使用岛津LCSolution/LabSolution，或安捷伦ChemStation，或其他色谱系统。
(4)对胞磷胆碱钠中的杂质UDPC更具有针对性和适用性，并且测定的准确度高。
附图说明
附图1为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.5)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为35℃，流速为1.0ml/min时的系统适用性HPLC图；
附图2为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.5)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为35℃，流速为1.0ml/min时的样品HPLC图；
附图3为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.3)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为35℃，流速为1.0ml/min时的系统适用性HPLC图；
附图4为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.3)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为35℃，流速为1.0ml/min时的样品HPLC图；
附图5为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.7)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为35℃，流速为1.0ml/min时的系统适用性HPLC图；
附图6为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.7)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为35℃，流速为1.0ml/min时的样品HPLC图；
附图7为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.5)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为30℃，流速为1.0ml/min时的系统适用性HPLC图；
附图8为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.5)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为30℃，流速为1.0ml/min时的样品HPLC图；
附图9为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.5)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为40℃，流速为1.0ml/min时的系统适用性HPLC图；
附图10为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.5)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为40℃，流速为1.0ml/min时的样品HPLC图；
附图11为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.5)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为35℃，流速为0.9ml/min时的系统适用性HPLC图；
附图12为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.5)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为35℃，流速为0.9ml/min时的样品HPLC图；
附图13为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.5)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为35℃，流速为1.1ml/min时的系统适用性HPLC图；
附图14为流动相为磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.5)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)，柱温为35℃，流速为1.1ml/min时的样品HPLC图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
以下各实施例和对照例使用的试剂可从市场上容易地购得。
实施例1
仪器及条件：
安捷伦1260高效液相色谱仪及安捷伦的ChemStation工作站：ODS-3色谱柱(C18，150×4.6mm)；以磷酸盐缓冲液[0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.5)等体积混合)]-甲醇(磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95：5)为流动相；检测波长276nm；柱温35℃；流速1.0ml/min；液相分析进样体积：10μl；运行时间：15分钟。
试验步骤：
称取5'-胞苷酸对照品25mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。称取胞磷胆碱钠对照品25mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。取上述两种溶液等量混合，摇匀，得到系统适用性溶液。
精密量取本品适量，用水定量稀释制成每1ml中含2.5mg的溶液，作为样品溶液。
精密量取所述药物制剂样品适量，用水定量稀释制成每1ml中含0.0125mg的溶液，作为对照溶液。
精密吸取系统适用性溶液20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图，结果见图1。
由图1可知，峰1为胞磷胆碱钠峰，峰2为5'-胞苷酸峰，胞磷胆碱钠峰与5'-胞苷酸峰的分离度应符合要求，即分离度应大于1.5。
精密吸取样品溶液10μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图，结果见图2。
实施例2
基本上与实施例1相同的方法，不同的是在配制缓冲盐溶液时，配制成不同的pH值，然后按照实施例1的方法对样品溶液进行检测，以检出杂质个数以及系统适用性中胞磷胆碱钠与5'-胞苷酸色谱峰之间的分离度值作为指标，考察不同pH值的缓冲盐溶液在色谱系统中的分离效果。结果如下：
缓冲盐的pH值 杂质个数 分离度
4.3 7 6.54
4.5 5 6.90
4.7 7 6.58
对于药物的高效液相色谱分析方法而言，本领域技术人员清楚，通常而言可接受的分离度一般需要在1.0以上，通常分离度大于1.5时认为可以满足质量控制方法要求的标准。本发明人出人意料地发现，当流动相C的pH值在4.3～4.7的范围内时，不但分离度均大于1.5，而且可以检测到杂质数目基本一致。因此在本发明一个特别优选的实施方案中，使用的磷酸盐缓冲液的pH值在4.5。
实施例3
基本上与实施例1相同的方法，不同的是在进行分离时，测定不同的色谱柱温度，然后按照实施例1的方法对样品溶液进行检测，以检出杂质个数以及系统适用性中胞磷胆碱钠与5'-胞苷酸色谱峰之间的分离度值作为指标，考察不同柱温在色谱系统中的分离效果。结果如下：
柱温(℃) 杂质个数 分离度
30 6 5.88
35 5 6.90
40 6 5.91
本发明人出人意料地发现，在使用等度洗脱过程中，当色谱柱的柱温在30～40℃的范围内时，不但分离度良好，而且可以检测到杂质数目基本一致。因此在本发明一个特别优选的实施方案中，使用的柱温为35℃。
实施例4
基本上与实施例1相同的方法，不同的是在进行分离时，采用不同的流速，然后按照实施例1的方法对样品溶液进行检测，以检出杂质个数以及系统适用性中胞磷胆碱钠与5'-胞苷酸色谱峰之间的分离度值作为指标，考察不同流速在色谱系统中的分离效果。结果如下：
流速(ml/min) 杂质个数 分离度
0.9 6 6.11
1.0 5 6.90
1.1 6 5.90
本发明人出人意料地发现，在使用等度洗脱过程中，当流动相的流速在0.9～1.1ml/min的范围内时，不但分离度良好，而且可以检测到杂质数目基本一致。因此在本发明一个特别优选的实施方案中，使用的流速为1.0ml/min的范围内。
实施例5
使用实施例1的方法，测定3批胞磷胆碱钠注射液，即测定实施例二、三、四中的样品溶液，根据高效液相色谱分析图中的峰面积值，计算出胞磷胆碱钠注射液中UDPC的含量，公式为UDPC的质量百分含量＝(药物制剂样品溶液中UDPC的峰面积÷对照溶液中胞磷胆碱钠的峰面积)×0.5％。按照药物分析领域对药品进行有关物质检查的一般要求进行测定，结果表明，实施例二、三、四中的样品溶液的UDPC的质量百分含量分别为0.15％、0.16％、0.15％。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的分析检测方法，其特征在于：该分析检测方法采用高效液相色谱法对含胞磷胆碱钠的药物制剂中杂质UDPC进行分析检测，包括以下步骤：
第一步，用高效液相色谱法分析系统适用性溶液，系统适用性溶液的进样量为20μl，记录色谱图中胞磷胆碱钠峰与5'-胞苷酸峰的分离度；
第二步，当所述第一步得到的胞磷胆碱钠峰与5'-胞苷酸峰的分离度大于1.5时，再用高效液相色谱法分析含胞磷胆碱钠的药物制剂样品溶液和对照溶液，药物制剂样品溶液和对照溶液的进样量均为10μl，记录色谱图至主成分保留时间的至少3倍，获得药物制剂样品溶液和对照溶液的高效液相色谱分析图，从中读取并计算杂质数量、杂质种类、杂质相对量、各色谱峰之间分离度中的至少一个信息；
第三步，将所述第二步中得到的高效液相色谱分析图中的峰面积值带入到公式中，计算出含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的含量，所述公式为UDPC的质量百分含量=（药物制剂样品溶液中UDPC的峰面积÷对照溶液中胞磷胆碱钠的峰面积）×0.5%；
在所述第一步和第二步中，色谱条件为：
色谱柱为Inersil?ODS-3色谱柱；色谱柱的柱温为30~40℃；流动相为磷酸盐缓冲液-甲醇混合溶液，其中磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为95:5，磷酸盐缓冲液的pH值为4.3~4.7；流动相的流速为0.9~1.1ml/min；使用紫外检测器，检测波长为276nm。
2.根据权利要求1所述的含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的分析检测方法，其特征在于：所述系统适用性溶液的制备：将每100ml水中含有25mg的5'-胞苷酸对照品溶液与每100ml水中含有25mg的胞磷胆碱钠对照品溶液等体积混合，即得系统适用性溶液。
3.根据权利要求1所述的含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的分析检测方法，其特征在于：所述对照溶液的制备：精密量取所述药物制剂样品适量，用水定量稀释制成每1ml中含胞磷胆碱钠0.0125mg的溶液，作为对照溶液；
所述药物制剂样品溶液的制备：精密量取含胞磷胆碱钠的药物制剂样品适量，用水定量稀释制成每1ml中含胞磷胆碱钠2.5mg的溶液，即为药物制剂样品溶液。
4.根据权利要求1所述的含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的分析检测方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液是通过以下步骤获得的：将0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基铵溶液等体积混合，即得磷酸盐缓冲液，其中，所述四丁基铵溶液取是通过用磷酸调节pH值至4.5的0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液得到的。
5.根据权利要求1所述的含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的分析检测方法，其特征在于：所述色谱柱的柱温优选为35℃。
6.根据权利要求1所述的含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的分析检测方法，其特征在于：所述流动相的流速优选为1.0ml/min。
7.根据权利要求1所述的含胞磷胆碱钠的药物制剂中UDPC的分析检测方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为4.45~4.55。
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