CN105181842A

CN105181842A - 一种银杏内酯b残留溶剂的检测方法

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Publication number: CN105181842A
Application number: CN201510570049.5A
Authority: CN
Inventors: 胡林森; 孙蓉; 刘斐; 吕署一; 肖志勇; 李丁
Original assignee: SHANGHAI SINE PROMD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI SINE PROMD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2015-09-09
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明公开了一种银杏内酯B残留溶剂的检测方法，包括以下步骤：(1)色谱条件与系统适用性试验；(2)对照品溶液的制备；(3)供试品溶液的制备；(4)测定：分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液各适量，直接进样注入气相色谱仪，测定，外标法计算甲醇、乙醇和乙酸乙酯的含量，最终计算出银杏内酯B中各有机溶剂残留量。本发明经方法学验证表明，分离效果良好，检测限、定量限、线性、稳定性、加样回收率等均符合要求，可以用于银杏内酯B中甲醇、乙醇和乙酸乙酯的残留量检测。该方法灵敏度高、重复性好，采用直接进样方法，处理简单，操作方便，适于工业化生产使用，有较大的应用价值。

Description

一种银杏内酯B残留溶剂的检测方法

技术领域

本发明涉及中药，具体涉及中药提取物残留溶剂的检测方法，尤其涉及一种检测银杏内酯B残留溶剂的检测方法。

背景技术

银杏叶为银杏科银杏属植物的叶子，主要化学成分为黄酮类和萜类内酯化合物，具有重要的药用价值和市场价值，市场上已开发了许多银杏叶系列产品。随着社会的进步和经济的发展，银杏叶萜类内酯的重要性越来越受人们的关注，其中银杏内酯B作为天然特异性血小板活化因子(PAF)拮抗剂，对治疗脑卒中具有显著的疗效，其药理作用和治疗价值已引起制药工业的极大兴趣。银杏内酯B是以银杏叶或银杏叶提取物为原料，经提取分离纯化而得到，但是，由于使用有机溶剂后的残留溶剂含量过高，影响药品的稳定性，也会对人体产生致崎、致癌作用。因而，多国药典均有控制产品中残留溶剂的相关要求，银杏内酯B作为药用原料也需要对残留溶剂进行检测，加以监控，使其符合规定。

目前报道的有机溶剂残留的检测方法均为部分相关溶剂检测，如检测罗红霉素中甲醇的残留量(《毛细管气相色谱法测定罗红霉素中的溶剂残留》，王建等，医药导报，2010,29(3)：369)；检测银杏内酯B中甲醇和乙酸乙酯的残留量(《银杏内酯B中有机溶剂残留的毛细管GC测定》，张现涛等，今日药学，2011,21(7)：400)；检测双氢青蒿素哌喹片中乙醇的残留量(《顶空气相色谱法测定双氢青蒿素哌喹片中乙醇残留含量》，木书林，2013,32(9)：504)。也有报道使用气相方法同时检测原料中多种溶剂残留量的方法，如《毛细管气相色谱法测定13种有机溶剂残留》，陆烨等，复旦学报(医学版)2013(3)，40(2)：222。提供了检测合成原料氟代紫杉醇的13种残留溶剂，但该方法中使用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，进样方式是顶空进样，对仪器要求较高，而且，DMSO虽然可以溶解样品，但当温度较低时，DMSO发生凝固，无法准确取样检测，限制其应用。目前未见报道同时检测银杏内酯B产品中甲醇、乙醇和乙酸乙酯残留量的方法，因而需要进一步研究设计。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种能够简便、快速、准确的检测银杏内酯B溶剂残留的分析方法。

本发明提供了一种银杏内酯B残留溶剂的检测方法。

本发明采用的技术方案：取银杏内酯B适量加入乙腈超声溶解，配成浓度为40mg/ml的溶液，过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液；另外，分别精密称取色谱级甲醇、乙醇、乙酸乙酯适量，加乙腈制成每1mL各含0.3mg、0.5mg、0.3mg的混合溶液，作为对照品溶液，直接进样注入气相色谱仪检测，以外标法定量计算出供试品甲醇、乙醇和乙酸乙酯的含量，最终计算出银杏内酯B中各有机溶剂残留量。

具体的，本发明方法包括以下步骤：

(1)色谱条件与系统适用性试验：色谱柱为6％-氰丙基苯基-94％-二甲基硅氧烷共聚物毛细管柱，载气为高纯氮气，检测器为氢离子火焰(FID)检测器，对照品溶液和供试品溶液直接进样，进样口温度150-200℃，检测器温度200-280℃，柱温30-200℃，程序升温，甲醇、乙醇、乙酸乙酯峰分离度大于1.5，各峰对称性良好；

(2)对照品溶液的制备：分别精密称取色谱级甲醇、乙醇、乙酸乙酯适量，加乙腈制成每1mL各含约0.3mg、0.5mg、0.3mg的混合溶液，作为对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取银杏内酯B适量，精密称定，加乙腈超声使溶解，使银杏内酯B浓度为40mg/ml，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；

(4)测定：分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液各适量，直接进样注入气相色谱仪，测定，外标法计算甲醇、乙醇和乙酸乙酯的含量，最终计算出银杏内酯B中各有机溶剂残留量。

本发明方法所述步骤(1)色谱柱为6％-氰丙基苯基-94％-二甲基硅氧烷共聚物毛细管柱，柱长30m，柱内径0.53mm，薄膜厚度3μm。

所述进样口温度160℃～190℃，柱温为35℃～180℃，程序升温35℃保持10min，再以20℃/min的升温速率升至180℃，保持3min；检测器温度为230℃～260℃

本发明人对于本检测方法的各种重要条件经过了研究、设计和改进试验，突破了本领域的常规：(1)溶剂的选择：气相检测通常会使用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，虽然DMSO可以溶解大多数样品，但环境温度较低时，DMSO凝固，无法准确取样检测，限制其应用。本发明人选择乙腈作为溶剂，不仅能溶解样品，而且还不受温度影响，样品处理简单方便。(2)柱温箱条件的选择：通常提高柱温可以使保留时间减少，加快分析速度，使样品中的组分完全流出，但是分离效果不好。而降低柱温，样品有较大的分配系数，选择性高，有利于分离，但是温度过低，容易引起峰形拖尾或前伸，并且分析时间长。本发明人采用根据固定液的使用温度极限和样品组分沸点来调节柱温，使用甲醇、乙醇、乙酸乙酯达到和溶剂峰乙腈的分离。并且通过由低到高改变柱温，研究相应柱温下的分离度，选择了比较理想的柱温，同时将每个样品分析时间控制在20分钟以内，使其达到简便、快速、准确的效果。

这样，本发明采用毛细管气相色谱法同时测定甲醇、乙醇和乙酸乙酯残留量，以乙腈作为溶剂，就可以完全溶解样品，且不受温度影响，样品处理简单方便，直接进样检测溶剂残留，结果准确可靠。

本发明检测方法对于用同样方法制备但是在制备中溶剂的加入量不相同得到的银杏内酯B进行了检测，准确地检测到银杏内酯B中各有机溶剂残留量。(见实施例1-3)

本发明检测方法经方法学验证表明，甲醇、乙醇、乙酸乙酯和溶剂峰乙腈的分离效果良好，在检测限、定量限、线性、稳定性、加样回收率等方法学的考察方面，均符合定量测定的要求。适于工业化生产使用，有较大的应用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例以举例的方式给出，并不构成对本发明的限制。

以下实施例所用原料和试剂通过市售得到。

实施例1样品检测及检测方法重复性实验

银杏内酯B的制备：

取市售银杏叶提取物浸膏(含量标准为总内酯含量≥6％，总黄酮含量≥24％，银杏酸含量≤10ppm)1000g，用水2000mL稀释至0.5g生药/mL，加入1000ml乙酸乙酯进行萃取，共萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，于45℃减压浓缩至无溶剂，加入10％乙醇100ml使浓缩液浓度约为0.5g/mL，湿法装柱，使药液通过MCI树脂，先用30％乙醇洗脱树脂除杂，以除去水溶性和大极性杂质，共洗脱3BV，洗脱速度1BV/h，再用40％乙醇以同样流速洗脱树脂，收集后3BV洗脱液，于45℃减压浓缩至1g/ml的浸膏，加入500ml70％甲醇，加热至溶解，4℃冰箱静置24h析晶，析出晶体后，抽滤，得到银杏内酯B的粗品2.07g，将得到的银杏内酯B粗品加80％乙醇50ml，加热至溶解，于4℃静置24h，析出结晶，抽滤，结晶于80℃烘干最终得到银杏内酯B1.86g。检测银杏内酯B中甲醇、乙醇和乙酸乙酯溶剂残留。

(1)供试品溶液的制备：取银杏内酯B0.2g，精密称定，平行取6份样品，加乙腈5ml超声使溶解，使银杏内酯B浓度为40mg/ml，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；

(3)测定：

仪器：岛津GC-2010气相色谱仪，岛津GCsolution工作站，上海全浦QPT-300G型氮氢空一体机，梅特勒·托利多AL204电子天平。

色谱条件：色谱柱为6％-氰丙基苯基-94％-二甲基硅氧烷共聚物毛细管柱，柱长30m，柱内径0.53mm，薄膜厚度3μm；载气为高纯氮气；检测器为氢离子火焰(FID)检测器；进样口温度190℃，柱温35-180℃，程序升温，35℃保持10min，以20℃/min的升温速率升至180℃，保持3min；检测器温度250℃。

测定方法：分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液各0.5μL，直接进样注入气相色谱仪，测定，外标法计算甲醇、乙醇和乙酸乙酯的含量，最终计算出银杏内酯B中各有机溶剂残留量。

表1供试品甲醇、乙醇和乙酸乙酯残留量(％)的检测结果及方法重复性结果

序号	甲醇	乙醇	乙酸乙酯
				1	0.101	0.132	未检出
2	0.105	0.135	未检出
				3	0.102	0.129	未检出

4	0.103	0.134	未检出
				5	0.102	0.131	未检出
6	0.102	0.133	未检出
				平均值	0.103	0.132	——
RSD	1.3％	1.6％	——

结果表明：银杏内酯B的6个平行样品中，乙酸乙酯残留量太低，未检出，甲醇、乙醇残留量均值分别为0.103％，0.132％，RSD分别为1.3％，1.6％，均小于2％，表明本方法重复性好，准确度高，可用于银杏内酯B溶剂残留的检测。

实施例2银杏内酯B样品检测

银杏内酯B的制备：取市售银杏叶提取物浸膏(含量标准为总内酯含量≥6％，总黄酮含量≥24％，银杏酸含量≤10ppm)1000g，用水溶液稀释至0.5g生药/mL，加入1000ml乙酸乙酯进行萃取，共萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，于45℃减压浓缩至无溶剂，加入10％乙醇100ml使浓缩液浓度为0.5g/mL，湿法装柱，使药液通过MCI树脂，先用30％乙醇洗脱树脂除杂，以除去水溶性和大极性杂质，共洗脱3BV，洗脱速度1BV/h，再用40％乙醇以同样流速洗脱树脂，收集后3BV洗脱液，于45℃减压浓缩至1g/ml的浸膏，加入500ml80％甲醇，加热至溶解，4℃冰箱静置24h析晶，析出晶体后，抽滤，得到银杏内酯B的粗品1.76g，将得到的银杏内酯B粗品加70％乙醇45ml，加热溶解后，于4℃静置24h，析出结晶，抽滤，结晶于80℃烘干最终得到银杏内酯B1.62g。检测银杏内酯B中甲醇、乙醇和乙酸乙酯溶剂残留。

对照品溶液同实施例1；

供试品溶液：取银杏内酯B0.2g，精密称定，平行取3份样品，加乙腈5ml超声使溶解，使银杏内酯B浓度约为40mg/ml，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；

色谱条件同实施例1；

表2供试品甲醇、乙醇和乙酸乙酯残留量(％)的检测结果

序号	甲醇	乙醇	乙酸乙酯
				1	0.121	0.139	未检出
2	0.125	0.141	未检出
				3	0.123	0.142	未检出
平均值	0.123	0.141	——
				RSD	1.6％	1.1％	——

。

实施例3银杏内酯B样品检测

银杏内酯B的制备：取市售银杏叶提取物浸膏(含量标准为总内酯含量≥6％，总黄酮含量≥24％，银杏酸含量≤10ppm)1000g，用水溶液稀释至0.5g生药/mL，加入1000ml乙酸乙酯进行萃取，共萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，于45℃减压浓缩至无溶剂，加入10％乙醇100ml使浓缩液浓度为0.5g/mL，湿法装柱，使药液通过MCI树脂，先用35％乙醇洗脱树脂除杂，以除去水溶性和大极性杂质，共洗脱3BV，洗脱速度1BV/h，再用40％乙醇以同样流速洗脱树脂，收集后3BV洗脱液，于45℃减压浓缩至1g/ml的浸膏，加入500ml80％甲醇，加热至溶解，4℃冰箱静置24h析晶，析出晶体后，抽滤，得到银杏内酯B的粗品2.17g，将得到的银杏内酯B粗品加80％乙醇55ml，加热溶解后，于4℃静置24h，析出结晶，抽滤，结晶于80℃烘干最终得到银杏内酯B1.99g。检测银杏内酯B中甲醇、乙醇和乙酸乙酯溶剂残留。

对照品溶液同实施例1；

供试品溶液：取银杏内酯B约0.2g，精密称定，平行取3份样品，加乙腈5ml超声使溶解，使银杏内酯B浓度约为40mg/ml，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；

色谱条件同实施例1；

表3供试品甲醇、乙醇和乙酸乙酯残留量(％)的检测结果

序号	甲醇	乙醇	乙酸乙酯
				1	0.127	0.159	未检出
2	0.126	0.158	未检出

3	0.128	0.157	未检出
				平均值	0.127	0.158	——
RSD	0.8％	0.6％	——

。

实施例4本发明银杏内酯B溶剂残留检测系统适用性试验

对照品溶液的制备：分别精密称取色谱级甲醇、乙醇、乙酸乙酯适量，加乙腈制成每1mL各含约0.3mg、0.5mg、0.3mg的混合溶液，作为对照品溶液；

测定方法：精密量取对照品溶液0.5μL，直接进样注入气相色谱仪，记录色谱图，色谱图中出峰顺序依次为甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯，峰形对称，分离度良好，均达到1.5以上。

实施例5检测方法检测限实验

配制对照品溶液，使甲醇、乙醇和乙酸乙酯的浓度分别为0.001mg/ml，0.002mg/ml，0.001mg/ml，取0.5μL进样检测，各峰信噪比大于3。

表4检测限结果

对照品成分	浓度(mg/ml)	信噪比	检测量(μg)
				甲醇	0.001	＞3	0.0005
乙醇	0.002	＞3	0.001
				乙酸乙酯	0.001	＞3	0.0005

信噪比结果表明，进样量为0.5μL时，供试品中甲醇、乙醇和乙酸乙酯的含量不低于0.0005μg，0.001μg，0.0005μg即可被检出，同理，银杏内酯B取样量为200mg时，甲醇、乙醇和乙酸乙酯的残留量大于0.0025％，0.005％，0.0025％即可被检出。

实施例6检测方法定量限实验

配制对照溶液，使甲醇、乙醇和乙酸乙酯的浓度分别为0.005mg/ml，0.01mg/ml，0.005mg/ml，取0.5μL进样检测，各峰信噪比大于10。

表5定量限结果

对照品成分	浓度(mg/ml)	信噪比	检测量(μg)
				甲醇	0.005	＞10	0.0025
乙醇	0.01	＞10	0.005
				乙酸乙酯	0.005	＞10	0.0025

信噪比结果表明，进样量为0.5μL时，供试品中甲醇、乙醇和乙酸乙酯的含量不低于0.0025μg，0.005μg，0.0025μg即可适合定量计算，同理，银杏内酯B取样量为200mg时，甲醇、乙醇和乙酸乙酯的残留量大于0.0125％，0.025％，0.0125％即适合定量计算。

实施例7检测方法的线性实验

配制混合对照品母液(每1ml中含甲醇1006μg，乙醇1268μg，乙酸乙酯1028μg，)。从混合对照品母液中精密移取5、2、l、0.5、0.2ml，分别置10ml量瓶中，同时精取对照品母液0.2ml置100ml量瓶，以乙腈稀释并定容至刻度，作为各标准曲线样品，色谱条件同实施例1，分别取0.5μl直接进样，记录色谱图，量取峰面积，以峰面积为纵坐标(y)，浓度C(μg/ml)为横坐标(x)进行线性回归。结果见表l，可见各组分在其浓度范围内线性关系良好。

表6标准曲线线性回归表

成分	线性方程	r值	浓度范围(μg/ml)
				甲醇	y＝3987.9x-14003	0.9999	2.0～503.0
乙醇	y＝5220.1x-7457.7	0.9999	2.5～634.0
				乙酸乙酯	y＝4321.8x-1743.7	0.9999	2.1～514.0

实施例8检测方法回收率实验

采用空白加样回收法，按低、中、高三个浓度分别加入甲醇、乙醇和乙酸乙酯，乙腈溶解稀释至10ml，作为供试品，每种浓度3个平行，对照溶液和检测方法同实施例1。

表7加样回收率实验结果

通过空白加样回收率实验数据可知：本方法回收率好，甲醇、乙醇、乙酸乙酯的平均回收率分别为99.6％，99.9％，99.6％，RSD值分别为0.61％，0.43％，0.21％。

实施例9仪器精密度实验

取实施例1的对照品溶液，色谱条件和检测方法同实施例1，连续6次进样检测，甲醇、乙醇、乙酸乙酯峰面积的RSD分别为0.74％，0.17％，0.48％，均小于2％，表明仪器精密度良好，适合该方法检测。

表8仪器精密度试验结果

序号	甲醇	乙醇	乙酸乙酯
				1	1156093	2611230	1367419
2	1142637	2600321	1365682
				3	1165231	2601589	1356896
4	1146342	2599874	1359542

5	1159851	2601698	1362358
				6	1158563	2599987	1375203
均值	1154786	2602450	1364517
				RSD％	0.74％	0.17％	0.48％

实施例10检测方法的稳定性实验

取实施例1中的对照品溶液分别于第0,2,4,6,8,24h取0.5μL检测，色谱条件和检测方法同实施例1，测定峰面积，甲醇、乙醇、乙酸乙酯峰面积的RSD％分别为0.72％，1.4％，0.53％，表明样品放置24h稳定性良好，可满足检测需要。

表9稳定性检测峰面积结果

Claims

1.一种银杏内酯B残留溶剂的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)色谱条件与系统适用性试验：色谱柱为6％-氰丙基苯基-94％-二甲基硅氧烷共聚物毛细管柱，载气为高纯氮气，检测器为氢离子火焰检测器，对照品溶液和供试品溶液直接进样，进样口温度150-200℃，检测器温度200-280℃，柱温30-200℃，程序升温，甲醇、乙醇、乙酸乙酯峰分离度大于1.5，各峰对称性良好；

2.根据权利要求1所述一种银杏内酯B残留溶剂的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)色谱柱为6％-氰丙基苯基-94％-二甲基硅氧烷共聚物毛细管柱，柱长30m，柱内径0.53mm，薄膜厚度3μm。

3.根据权利要求1所述一种银杏内酯B残留溶剂的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)进样口温度160℃～190℃，柱温为35℃～180℃，程序升温35℃保持10min，再以20℃/min的升温速率升至180℃，保持3min。

4.根据权利要求1所述一种银杏内酯B残留溶剂的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)检测器温度为230℃～260℃。