CN105136951A - 一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法，其步骤：（1）将茶叶多糖用三氟乙酸水解；（2）将水解后的茶叶多糖样品用超纯水溶解得到水解多糖溶液，加入海藻糖作为内标物；（3）将含内标的水解多糖溶液用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化；（4）在水解多糖衍生化的同时进行标准单糖的衍生化；（5）进行高效液相色谱分析，得到各个单糖的含量。本方法所用高效液相检测系统条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相为按一定比例混合的缓冲溶液与有机溶剂，流速为1.0ml/min，紫外检测器，检测波长250nm。方法易行、快速方便、稳定，达到了在20min内进行单糖的分离与分析，提高了茶多糖单糖检测的准确度与精确度。

Description

一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法

技术领域

本发明属于茶叶化学领域，更具体涉及一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法。

背景技术

茶多糖是(TeaPolysaccharide)是茶叶中重要的活性物质，具有免疫、降血糖、防辐射、抗氧化、降血脂等多种功能。

茶多糖是一种酸性糖蛋白，其活性与分子量大小和单糖组成有着密切的联系。检测茶多糖的单糖组成对研究其生物活性有很大的帮助。多糖中单糖组成的检测方法主要包含显色法、毛细管电泳法、气相色谱法、薄层层析色谱法、液相色谱法等。苏冰霞(山苦茶多糖的分离和含量测定，2012，热带作物学报，Vol.33(3)：567-571)、傅博强(茶叶中多糖含量的测定，2001，食品科学，22(11)：69-73)等人的非专利文献表明，显色法只能测定茶多糖中总糖的含量，并不能定量分析茶多糖的单糖组成；丁侃(多糖类药物的毛细管电泳分析方法及其应用，1999，色谱，Vol.17(4)：346-252)、张丽芝(单糖组成分析方法的研究进展，2013，微生物学免疫学进展，Vol.41(1)77-81)等人的非专利文献表明，利用毛细管电泳分离多糖组成，多糖的分离度较差；丁婧思(茶叶酸性多糖的分离、纯化以及理化性质研究，2014，食品科学，Vol.35(23)：57-60)、陈海霞(高活性茶多糖的一级结构表征、空间构象及生物活性的研究，2002，华中农业大学)等人的非专利文献表明，气相色谱法中由于单糖并不易挥发，导致衍生化过程复杂且不稳定，衍生后容易产生异构体，且不能检测糖醛酸含量；颜军(TLC快速分析多糖的单糖组成，2006，食品科学，Vol.27(12)：603-607)等人的非专利文献表明，薄层析法灵敏度比较低，分析不精确；屠幼英(绿茶饮料中茶多糖的构成，2001，茶叶，Vol.27(2)：22-24)等人的非专利文献表明，普通液相色谱法分析要采用糖柱或氨基柱，价格昂贵且维护费用较高，而且需要很长时间来平衡。邓静(高效液相色谱法和化学计量学在白茶及其多糖质量控制中的应用，2014，南昌大学)、郭威(柱前衍生HPLC法分析普洱茶多糖的单糖组成，农业科学与技术，2013，Vol.14(4)：556-558)等人的非专利文献利用柱前衍生HPLC法分析白茶、普洱茶多糖的单糖组成，但分析时间在40min以上，且部分单糖间分离效果有待提高。显然，如何找到一种分析时间更快，分离效果更好的方法用于茶叶多糖中单糖组成的分析显得十分必要。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，是在于提供了一种茶叶多糖单糖组成的定量方法，方法易行、快速、方便、稳定，使其达到了在20min内进行单糖的分离与分析，分离效果及精密度明显优于现行方法，提高了茶多糖单糖检测的准确度。

为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法，其步骤包括现将茶多糖进行酸水解，然后进行衍生化，其步骤还包括以海藻糖为内标物，利用高效液相色谱仪进行分析与检测，在此过程中将所述的单糖快速分离与定量分析。

一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法，其步骤如下：

(1)将茶叶多糖置于安瓿管中，加入一定量的2.0mol/L的三氟乙酸，真空封管后于130℃下水解120分钟，冷却至室温后氮气吹干，得到水解多糖样品；

(2)将水解多糖用超纯水充分溶解，加入海藻糖作为内标物，得到含内标的水解多糖溶液；

(3)在含内标的水解多糖溶液100μL中按照体积比1：2：3的比例依次加入0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液200μL和0.3mol/L氢氧化钠溶液(NaOH)300μL，均匀混合后在70℃水浴反应60分钟进行衍生化，将反应液冷却至室温，用0.3mol/LHCL溶液300μL中和，得到衍生化多糖溶液；

(4)在多糖衍生化的同时进行标准单糖的衍生化，即先用超纯水配置0.1mol/L的单糖溶液，然后取等量单糖溶液混合成单糖标准品混合液，按照步骤(3)进行标准单糖和标准单糖混合液的衍生化，得到衍生化标准单糖和衍生化混合标准单糖溶液；

(5)在衍生化多糖、衍生化标准单糖和衍生化混合标准单糖溶液中分别加入氯仿萃取，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，得到HPLC分析样；

(6)HPLC分析条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相A选用磷酸二氢钾-三乙胺与乙腈组成的缓冲溶液；流动相B选用乙腈；洗脱过程采用梯度洗脱，从0-20分钟，流动相B相应的浓度为6％-12％；柱温35℃，流速为1.0ml/min，紫外检测器，波长250nm；

(7)根据图谱中各单糖保留时间进行茶叶多糖中所含单糖的定性分析，根据图谱中各单糖峰面积大小进行茶叶多糖中所含单糖的定量分析。

本发明与现有技术相比，具有以下积极效果：

1、提高单糖的分离效果：可一次性分离茶多糖中所含单糖，包括葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，各单糖峰峰型尖锐，分离效果显著。

2、分析时间缩短：利用本发明提供的HPLC分析条件，可在20min内完成单糖的分离与分析。

此外，所使用的设备比较常见，方法容易实现，检测成本较低。

通过查阅，经检索到与本发明相关的非专利文献10余篇，本发明与相关文献主要技术特征和实施效果的比较见表1—表4。技术方案不同，所达到的技术效果不一样，本发明通过现有技术相比，都远远高于现有技术的效果。利用本发明技术可以一次性完成茶叶多糖中单糖的组成分析，分离时间控制在20min内；各单糖组均分具有良好的线性关系，相关系数达到0.998以上；各单糖组分保留时间与峰面积CV％均小于3.75，精密度高；各单糖组分的回收率在93.6％-102.6％之间，准确度高。

附图说明

图1为一种标准单糖样品HPLC检测色谱图。

图2为一种茶叶多糖HPLC检测色谱图。

其中：1－甘露糖、2－核糖、3－鼠李糖、4－葡萄糖醛酸、5－半乳糖醛酸、6－葡萄糖、7－木糖、8－半乳糖、9－阿拉伯糖、10－海藻糖。

具体实施方式

实施例1：

一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法，其步骤如下：

(1)将茶叶多糖10mg置于安瓿管中，加入一定量的2.0mol/L的三氟乙酸，真空封管后于130℃下水解120分钟，冷却至室温后氮气吹干，得到水解多糖；

(2)将水解多糖用超纯水充分溶解，加入海藻糖作为内标物，得到含内标的水解多糖溶液；

(3)在含内标的水解多糖溶液100μL中按照体积比1：2：3的比例依次加入0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液200μL和0.3mol/LNaOH溶液300μL，均匀混合后在70℃水溶液中反应60分钟进行衍生化，将反应液冷却至室温，用0.3mol/LHCL溶液300μL中和，得到衍生化多糖溶液；

(4)在多糖衍生化的同时进行标准单糖的衍生化，即先用超纯水配置0.1mol/L的单糖溶液，然后取等量单糖溶液混合成单糖标准品混合液，按照上述方法(3)进行标准单糖和标准单糖混合液的衍生化，得到衍生化标准单糖和衍生化混合标准单糖溶液；

(5)在衍生化多糖、衍生化标准单糖和衍生化混合标准单糖溶液中分别加入1ml氯仿萃取3次，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，得到HPLC分析样；

(6)HPLC分析条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相A选用磷酸二氢钾-三乙胺与乙腈组成的缓冲溶液；流动相B选用纯乙腈；洗脱过程采用梯度洗脱，从0-20分钟，流动相B相应的浓度为6％-12％；柱温35℃，流速为1.0ml/min，紫外检测器，波长250nm；

(7)根据图谱中衍生化标准单糖和混合标准单糖保留时间进行多糖中所含单糖的定性，根据图谱中衍生化标准单糖和混合标准单糖峰面积大小定量。

在本实施例中所采用的仪器、试剂、色谱条件、标准溶液的制备、茶叶多糖样品溶液制备、方法学验证试验、分析条件的确定如下。

1、仪器与试剂：

1.1仪器：

Agilent1260HPLCsystem(美国安捷伦)；水浴锅HH-2(常州国华)；

AW-220电子天平(日本岛津)

1.2试剂：

超纯水；甲醇，乙腈均为色谱纯美国Fisherscientific公司；甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、海藻糖均为色谱纯美国Sigma公司；氯仿、甲醇、盐酸，NaOH、盐酸、三乙胺、三氟乙酸均为分析纯上海国药试剂；1-苯基-3-乙基-5-吡唑啉酮(PMP)分析纯为上海国药集团。

2、色谱条件：

色谱柱：TC-C18(4.6mm×250mm,5μm,Agilent,USA)；柱温35℃，波长250nm。

流动相：乙腈；0.045％磷酸二氢钾-0.05％三乙胺的10％的乙腈缓冲溶液。梯度洗脱。

3、标准溶液的制备：

3.1、单糖对照品混合溶液的配制：

分别精密称取甘露糖0.0180g,核糖0.0150g，鼠李糖0.0182g，葡萄糖0.0180g，木糖0.0150g，半乳糖0.0180g，阿拉伯糖0.0150g，葡萄糖醛酸0.0194g，半乳糖醛酸0.0212g，海藻糖0.0164g，置于10mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，摇匀，即得。

3.2、单糖标准品混合溶液的衍生：

取单糖混合溶液100μL于具塞试管中，依次加入0.5mol/LPMP甲醇溶液200μL和0.3mol/LNaOH溶液300μL，涡旋混合均匀后于70℃水浴反应60min，取出，冷却至室温，加入0.3mol/LHCL溶液300μL混合中和。然后加入氯仿1.0mL萃取，振荡，离心，弃去下层氯仿层，重复3次。取上层水相溶液经0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液进样分析。

4、茶叶多糖样品溶液制备：

4.1、样品的水解：

精确称取10mg茶叶多糖于安瓿管中，加入2.0mol/L的三氟乙酸溶液2.0ml，真空封管后130℃水解2h，冷却后氮气吹干，加入一定量的超纯水溶解备用。

4.2、茶叶多糖的衍生化：

衍生前将海藻糖作为内标物加入茶叶多糖水解溶液，所得溶液按“3.2”项下方法进行衍生化。

5、方法学验证试验如下：

(1)线性关系：

取适量“3.1”标准单糖混合样品，分别稀释至2.0μmol/L、1.6μmol/L、1.4μmol/L、1.2μmol/L、1.0μmol/L、0.8μmol/L、0.6μmol/L、0.4μmol/L溶液(其中海藻糖浓度均为1.0μmol/L)，分别进行“3.2”衍生化，经0.45μm微孔滤膜过滤，分别进样1.0μL，记录色谱图，以紫外测定的每种单糖的峰面积与海藻糖的峰面积的比值为纵坐标，以相应单糖的浓度为横坐标进行线性回归。结果表明各单糖的浓度(X)与峰面积比值(Y)有良好的线性关系，见下表1。

表1各单糖的标准曲线

单糖	标准曲线	相关系数
			甘露糖	y＝2593.1x-0.0496	0.9994
核糖	y＝2268.8x-0.0455	0.9994
			鼠李糖	y＝1875.1x-0.0287	0.9993
葡萄糖醛酸	y＝1997.6x-0.0957	0.9991
			半乳糖醛酸	y＝2174.9x-0.1579	0.9983
葡萄糖	y＝2097.8x+0.0139	0.9991
			木糖	y＝2577.2x-0.0259	0.9980
半乳糖	y＝2480.6x+0.0153	0.9994
			阿拉伯糖	y＝2436.6x+0.0211	0.9994

(2)精密度试验：

精密量取一定量的“3.1”标准单糖混合溶液，经“3.2”衍生化后，在“2”项色谱条件下，连续进样5次。记录色谱图，详细记录各单糖的保留时间与峰面积。每种单糖的保留时间与峰面积的CV％见下表2：

表2各单糖的精密度实验数据

单糖	保留时间	峰面积
			甘露糖	0.72	0.08
核糖	0.78	0.09
			鼠李糖	0.89	0.08
葡糖糖醛酸	0.13	1.93
			半乳糖醛酸	0.15	3.75
葡萄糖	0.36	0.08
			木糖	0.39	0.68
半乳糖	0.36	0.66
			阿拉伯糖	0.36	0.44
海藻糖	0.38	0.11

由表二可以看出，该方法的再现重复性很好，能满足实验中的分析要求。

(3)准确度试验：

为了检测该方法的准确性，向实际样品中分别加入一定量的标准单糖并用上述方法进行液相色谱分析，测定峰面积，计算回收率。

分别取20ml的“4.1”茶多糖水解样品A、B两组，A组加入20ml超纯水，经“3.2”衍生化后，在“2”项色谱条件下进样分析，进样量1.0μL，根据“表1”计算其单糖组成及含量；B组加入20ml稀释为0.1μmol/L的“3.1”标准单糖混合样品，经“3.2”衍生化后，在“2”项色谱条件下进样分析，进样量1.0μL，根据“表1”计算其单糖组成及含量。根据上述实验数据计算回收率。见下表3。

表3各单糖的回收率。

由表三可以看出，各单糖样品的回收率在93.6％-102.6％之间，能满足日常分析精度的要求，表明可以使用此测定条件做茶叶多糖单糖含量的分析方法。

(4)结果：

茶叶多糖样品水解并衍生后，经HPLC检测，各单糖含量为甘露糖0.28μM，核糖0.31μM，鼠李糖0.44μM，葡萄糖醛酸0.28μM，半乳糖醛酸0.78μM，葡萄糖2.00μM，木糖0.20μM，半乳糖1.93μM，阿拉伯糖1.82μM。

6、分析条件的确定：

6.1、色谱柱的选择：

分别选用ZORBAXEclipseXDB-C18液相色谱柱、ZORBAXSB-C18液相色谱柱、VenusilXBP-C18液相色谱柱、AgilentTC-C18液相色谱柱进行试验，试验表明，AgilentTC-C18液相色谱柱分离效果明显，分离效果最好。

6.2、流动相中缓冲溶液的确定：

分别采用磷酸氢二钾-磷酸二氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、磷酸二氢钾-三乙胺与有机溶剂组成流动相，恒比例洗脱，其中有机溶剂为乙腈，比例为10％。结果显示，使用磷酸二氢钾-三乙胺缓冲溶液效果较好。

6.3、流动相中有机溶剂的确定：

选用磷酸二氢钾-二乙胺与乙腈组成的缓冲溶液分别与甲醇、乙醇、乙腈按照80:20组成流动相，恒比例洗脱，结果表明使用乙腈的分离效果较好。

6.4、洗脱梯度的确定：

在恒比例洗脱条件下，各单糖的分离效果较差，所以采用梯度洗脱。从0-20分钟，乙腈乙腈相应的浓度为6％-12％。分离效果显著。

表4与现有技术相比本发明的主要效果的主要差别

Claims (1)

1.一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法，其步骤是：

（1）将茶叶多糖置于安瓿管中，加入一定量的2.0mol/L的三氟乙酸溶液，真空封管后于130℃下水解120分钟，冷却至室温后氮气吹干，得到水解多糖样品；

（2）将水解多糖样品用超纯水充分溶解，加入海藻糖作为内标物，得到含内标的水解多糖溶液；

（3）在含内标的水解多糖溶液100μL中按照体积比1：2：3的比例依次加入0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液200μL和0.3mol/LNaOH溶液300μL，均匀混合后在70℃水浴反应60分钟进行衍生化，将反应液冷却至室温，用0.3mol/LHCL溶液300μL中和，得到衍生化多糖溶液；

（4）在水解多糖衍生化的同时进行标准单糖的衍生化，先用超纯水配置0.1mol/L的单糖溶液，然后取等量单糖溶液混合成单糖标准品混合液，按照步骤（3）进行标准单糖和标准单糖混合液的衍生化，得到衍生化标准单糖和衍生化混合标准单糖；

（5）在衍生化多糖、衍生化标准单糖和衍生化混合标准单糖溶液中分别加入氯仿萃取，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，得到HPLC分析样；

（6）HPLC分析条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相A选用磷酸二氢钾-三乙胺与乙腈组成的缓冲溶液；流动相B选用纯乙腈；洗脱过程采用梯度洗脱，从0-20分钟，流动相B相应的浓度为6%-12%；柱温35℃，流速为1.0ml/min，紫外检测器，波长250nm；

（7）根据图谱中各单糖保留时间进行茶叶多糖中所含单糖的定性分析，根据图谱中各单糖峰面积大小进行茶叶多糖中所含单糖定量分析。