JPH0394697A - キチン、キトサンの脱アセチル化度の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、キチン、キトサンの脱アセチル化度の測定法
に関するものである． （従来の技術及び問題点） キチンは、カニ、エビなどの甲殻類、カブトムシ、コオ
ロギなどの昆虫類や菌体の細胞壁等に含まれるＮ−アセ
チルグルコサミンがβ−（１−４）結合で連なった構造
を有する多糖類の一種である．一方、キトサンはキチン
を濃アルカリで処理することによって脱アセチル化した
キチン誘導体で、グルコサミンがβ−（１−４）結合し
た多糖類である．しかし、一般的には、キチンは１０−
　２０％脱アセチル化され、またキトサンも完全に脱ア
セチル化されたものは少なく、キチンから脱アセチル化
処理によって得られるキトサンは、通常７０−　９５％
の脱アセチル化物である。このように、一概にキチン、
キトサンといっても、その脱アセチル化度は多種多様で
ある．この脱アセチル化度は、キチン、キトサンやその
誘導体の物理化学的な特性に影響を与えるだけでなく、
これらの物質を素材とした種々の製品の品質に大きな影
響を与えるちのである。

また、キチン，キトサンの持つ生理活性機能に対しても
脱アセチル化度が大きく影響することが知られている．
従って、キチン、キトサンの脱アセチル化度を正確に求
めることはこれらの物質の特性を知る上で重要な因子で
ある． 従来から、キチン、キトサンの脱アセチル化度の測定に
ついては、種々の方法が考案されている．例えば、ポリ
ビニル硫酸カリウムによるコロイド滴定法、赤外吸収ス
ペクトルを利用する方法（ＩＲ法）、キチン、キトサン
を加水分解したときに生成する酢酸を定量する方法（加
水分解法）などが代表的な脱アセチル化度の測定法とし
てあげられる．しかしながら，これらの従来法は，いく
つかの問題点を含んでいる．コロイド滴定法は簡便な定
量法ではあるが、希酸に溶解するキトサンにしか適用で
きずその精度にも問題が残る．ＩＲ法は、精度の高い脱
アセチル化法でキチン、キトサンのいずれにも適用でき
る方法であるが、サンプルの調製に熟練を要し、また多
数のサンプルを測定する場合には長時間を必要とするな
ど必ずしも簡便な方法とは言えない．加水分解法では、
直接酢酸を定量できるので精度の高い方法であるが、実
験操作が煩雑で長時間を要するなどの難点がある．（問
題を解決するための手段） 本発明者らは、キチン、キトサンを酵素を用いてそれら
の構成成分であるＮ−アセチルグルコサミンとグルコサ
ミンに完全に加水分解する方法について鋭意研究を重ね
た結果、キトサン才リゴ糖やキトサンに作用し単糖のグ
ルコサミンを遊離するエキソ型のβ一Ｄ−グルコサミニ
ダーゼとキチン才リゴ糖やキチンに作用し単糖のＮ−ア
セチルグルコサミンを遊離する酵素を組み合わせること
によって、またこれらの酵素にキチナーゼやキトサナー
ゼを共存させることによりさらにキチン、キトサンをよ
り効果的にＮ−アセチルグルコサミンとグルコサミンに
まで完全に分解できることを見いだし本発明を完成する
に至った．（発明の構成） 本発明に使用する酵素としては、キトサンオリゴ糖やキ
トサンを分解しグルコサミンを遊離するエキソ型のβ一
Ｄ−グルコサミニダーゼ、キチン才リゴ糖やキチンに作
用しＮーアセチルグルコサミンを生成する゛β一Ｎ−ア
セチルヘキソサミニダーゼ（あるいはβ−Ｎ−アセチル
グルコサミニダーゼ）、キトサンをキトサンオリゴ糖に
まで分解するキトサナーゼ、キチンをキチンオリゴ糖に
分解するキチナーゼやリゾチームなどがあげられる。こ
れらの酵素のうち、β一Ｎ−アセチルへキソサミニダー
ゼ、キトサナーゼ、キチナーゼやりゾチームは、一Ｍに
市販されている酵素を使用することができる。例えば、
β一Ｎ−アセチルへキソサミニダ〜ゼ（あるいはβ一Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼ）は、アスパラギルス・
ニガーやジャック・ビーン由来のものが、キトサナーゼ
では、バチルスＲ−４やバチルス・バミラス起源のもの
が、キチナーゼでは、ストレプトマイセス・グリセウス
、セラチア・マルセッセンス、アエロモナス・ハイドロ
フィラ起源のものがあげられる．リゾチームは、卵白由
来のものが一般的である。

その他、これらの酵素を生産する微生物を培養すること
によっても調製可能である．本発明に使用するキトサン
才リゴ糖やキトサンを分解しグルコサミンを遊離するエ
キソ型のβ−Ｄ−グルコサミニダーゼは、後述の調製例
に従って調製することができる． キチン、キトサンの酵素による分解は、これらの物質を
完全に分解することが必須であることから、少なくとも
エキソ型のβ−Ｄ−グルコサミニダーゼとβ一Ｎ−アセ
チルへキソサミニダーゼ（あるいはβ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼ）の両酵素を用いることが不可欠であ
る．さらに、分解をより速やかにするためキトサンでは
キトサナーゼを、キチンではキチナーゼを併用すること
が好ましく、また必要とあらばキトサナーゼ、キチナー
ゼの両方を併用することもできる．これらの酵素は、キ
チン、キトサンの分解に際し同時に添加するが、別々に
添加することも可能である。酵素反一応は、キチン、キ
トサンを完全に単糖であるＮ−アセチルグルコサミンと
グルコサミンに分解できる条件であれば特に規定する必
要はないが、より迅速な操作を行うことのできるｐＨ、
温度、酵素濃度条件等を設定することが好ましい． キチンあるいはキトサンを完全に加水分解後、生成した
Ｎ−アセチルグルコサミンとグルコサミンの定量は、高
速液体クロマトグラフィーによる方法や比色定量法で測
定することができる． 調製例一二キソ型のβ一Ｄ−グルコサミニダーゼの調製
一 グルコース１％、ペブトンｌ％、リン酸二水素カリウム
０．０３％、リン酸一水素カリウム０．０７％と硫酸マ
グネシウム０．０５％を含む培養液（ｐＨ７．０　）　
５００騙２を５００ｍＪ２用三角フラスコにｌｏｏ＋＊
［ずつ入れ、これにノカルディア・オリエンタリスＩＦ
Ｏ−１２８０６株を接種し、３０℃で２日間振どう培養
した。次に、キトサン１％、酵母エキス０．Ｏｌ％、と
上記と同じ組成の無機塩を含む培養液４．５　１２を含
むジャーファーメンターに、上記の培養液を移し３０℃
で４日間通気撹拌培養した．培養液を遠心分離して菌体
を除去し、上清液に８０％飽和となるように固形硫安を
加えタンパク質を沈澱させた。この沈澱を少量の２５ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解後、同緩衝液で平衡
化したセファデックスＧ−２５カラムに展開して脱塩し
、粗酵素液とした。

この粗酵素液を上記の緩衝液で平衡化したＣＭ−セファ
デックスＣ−５０カラムに供しイオン交換クロマトグラ
フィーを行った．カラムを同緩衝液で洗浄後、０から０
．６Ｍ塩化ナトリウムを含む酢酸緩衝液による直線濃度
勾配を用いて目的とする酵素を溶出した。β−Ｄ−グル
コサミニダーゼ活性を有する画分を集め硫安塩析した．
生じた沈澱を５０＋ｎＭ酢酸緩衝液（ｐｌ｛５．５１に
溶解し、これを同緩衝液で平衡化したトーヨーバールＨ
Ｗ−５５Ｓカラムに展開した．タンパク質を上記緩衝液
で溶出し活性画分を集めた．次に、この画分を５０ｍＭ
酢酸緩衝液で平衡化したキトトリイトールーセファロー
スＣＬ−４Ｂカラムに供しアフィニティークロマトグラ
フイーな行った．カラムを上記緩衝液で洗浄後、目的酵
素を２ｍＭキトトリイトールを含む同緩衝液で溶出した
．活性画分を集め硫安塩析でタンパク質を沈澱させた。

この沈澱物を少量のＳＯＩＩＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５
）に溶解後、同緩衝液で透析して精製酵素標品を得た． 本発明においては，粗酵素液と精製酵素のいずれを用い
てもよい． 以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが
、かかる説明によって本発明が何ら限定されるものでは
ないことは勿論である． （実施例） あらかじめポリビニル硫酸カリウムを用いたコロイド滴
定法によって脱アセチル化度を測定した５種類のキトサ
ン（Ａ−Ｅ）各１．５ｇを０．２％酢酸３００ｍｓｎに
溶解した．少量の不溶物を除去後、このキトサン溶液２
ｍ！２に対して、エキソーβ−グルコサミニダーゼ、β
一Ｎ−アセチルへキソサミニダーゼ及びキトサナーゼを
５単位ずつ添加した．試料ＤとＥは、脱アセチル化度が
比較的低かったためさらにキチナーゼ５単位を添加した
。反応液を４０℃で１２時間保った後、反応液１ｍＩ２
を凍結乾燥した．残りの反応液は、その一部をとりグル
コサミンとＮ−アセチルグルコサミンを分別比色定量し
た．定量法は、グルコサミンに対してインドールー塩酸
法を、Ｎ−アセチルグルコサミンに対してはライシッヒ
らの法を用いた．凍結乾燥した試料は、これを０．ｌｍ
ｆｆの水に溶解した後、高速液体クロマトグラフィ−　
（ＨＰＬＣ）でグルコサミンとＮ−アセチルグルコサミ
ンを分離定量した，ＨＰＬＣでの分析条件は下記に示し
た．また、代表例として試料Ａ（表−１参照）のＨＰＬ
Ｃによる分析パターンを添付の図に示した。

また、表−１には，本発明の原理に基づいて各試料の脱
アセチル化度を比色定量法及び｝｛ＰＬＣ法で測定した
値と従来のコロイド滴定法で測定した結果を示した． なお、各試料の酵素分解は各々３回行った。

インドールー塩酸法（グルコサミンの定量）試料０．５
ｍＩ２（グルコサミン、１０−２００ｕ　ｇ）に、５％
亜硝酸ナトリウム溶液０．５ＩＩＩ２と・３３％酢酸０
．５ｍｎを加え、十分に撹拌してｌＯ分間放置し脱アミ
ノ化反応を行う．次に、１２．５％スルファミン酸アン
モニウム溶液０．５一Ｃを加えときどき撹拌しながら３
０分間放置し、過剰の亜硝酸を消去する．これに５％塩
酸２ｍｊ２と１％インドール（エタノール溶液）　０．
２ａ＋ｊ２を加えて沸騰湯浴中で５分間加熱する．冷却
後．２＋１１２のエタノールを加え，４９２ｎａ＋の吸
光度を測定する。

ライシッヒ（　Ｒｅｉｓｓｉｇ）らの方法（Ｎ−アセチ
ルグルコサミンの定量） 試料０．５＋ａＪ２　（　Ｎ−アセチルグルコサミン、
５−３０μｇ）に、ホウ酸塩溶液０．ｌｍβを加え沸騰
湯浴中で正確に５分間加熱する．流水で冷却後、ｐ−ジ
メチルアミノペンズアルデヒド（ＤＭＡＢ）試薬３１Ｉ
Ｉ２を加えて十分に混合する。３７℃に２０分間正確に
保った後室温まで冷却し、５８５ｎｍの吸光度を測定す
る。

ホウ酸塩溶液−０．８Ｍホウ酸一水酸化カリウム溶液（
　ｐＨ９．　１１ ＤＭＡＢ試薬 ＩＯＮ塩酸を１２．５％濃度で含む酢酸１０ｈｎにＤＭ
ＡＢＩＯｇを溶解し、使用直前に酢酸でさらにｌＯ倍希
釈して用いる． ＨＰＬＣ分析条件 カラム；　ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　　ＰＡ−０３移動相：ア
セトニトリル：水＝３＝１ 流　速：　０．　ｌｍｌ２７ｍｉｎ 検　出：示差屈折計 温　度：室温 （以下余白） 表−１ 水分解した後に生成したグルコサミンとＮ−アセチルグ
ルコサミンを高速液体クロマトグラフィーで分析したと
きのパターンを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. キチンまたはキトサンを、酵素により完全に構成単糖で
   あるＮ−アセチルグルコサミンとグルコサミンにまで分
   解した後、生成した単糖類を定量することを特徴とする
   キチン、キトサンの脱アセチル化度の測定法。