CN101893612A - 色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法 - Google Patents

Abstract

一种色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法，采用BIO-3X填料的凝胶净化柱；淋洗剂为乙酸乙酯∶环己烷＝1∶1，收集7.48～12.60min的馏分；净化后在二氯甲烷和甲醇的溶剂中低温皂化，使虾青素酯完全转化为游离虾青素；采用YMC-Carotenoid C30色谱柱；以甲醇、叔丁基甲基醚和1％的磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；流速1.0mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长为474nm；确定虾青素的三种同分异构体，并采用三个峰面积的加和定量。本发明凝胶色谱柱使南极磷虾油中的脂肪和虾青素得到较好分离，采用C30-反相高效液相色谱法可以准确测定虾青素的含量，客观真实地评价南极磷虾油质量的优劣。

Description

色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法

技术领域：

本发明涉及一种色谱检测的方法，具体涉及一种用凝胶渗透色谱净化-高效液相色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法，即一种采用凝胶渗透色谱净化，C30-反相高效液相色谱分离，紫外检测器测定南极磷虾油中虾青素含量的方法。

背景技术：

凝胶渗透色谱作为一种样品的净化手段之一，在国外应用的已较普遍，在我国，GPC在农药残留前处理分离、净化方面的应用将越来越普遍，尤其是在富含脂肪、色素等大分子的样品分离净化方面，具有明显的净化效果。

高效液相色谱法应用范围广，对被测物质活性影响小，几乎可以测定食品中所有的非挥发性物质，在化学分析中发挥着重要作用。色谱柱是色谱仪起分离作用的关键部件，其核心是优质的色谱填料。进行特定的色谱分离工作，首先要有性能良好的色谱柱，选择在确定的分离条件下分离效率高和分析时间短的色谱柱。

虾青素(Astaxanthin，3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素)，分子式为C₄₀H₅₂O₄，相对分子质量为596.86，是一种类胡萝卜素衍生物，具有很强的抑制肿瘤发生和生长、抑制多元不饱和脂肪酸的氧化、抵御紫外线的作用；具有代维生素A活性、增强人体免疫功能、改善视力、色素形成和神经连通以及改善生育的作用，同时还具有清除二氧化氮、硫化物、二硫化物和降低脂质过氧化作用，因此在化妆品、保健品和医药工业中具有广泛的应用前景。

南极磷虾中含有丰富的ω-3不饱和脂肪酸、磷脂和虾青素等活性物质。从南极磷虾中提取的虾油中的虾青素含量与加工工艺密切相关，是评价南极磷虾油质量优劣的重要指标。而南极磷虾油中的虾青素主要以虾青素酯的形式存在，游离虾青素占的比例较少，由于虾青素酯和游离虾青素的同分异构体种类较多，难以同时对各组分进行分离测定。而虾青素酯经皂化或酶解后可以完全转化为游离的虾青素，游离的虾青素主要有三种同分异构体：全反式虾青素，9-顺-虾青素，13-顺-虾青素，通过对游离虾青素的三种同分异构体进行分离测定，可以用于南极磷虾油中虾青素含量的测定。目前，能否准确测定南极磷虾油中的虾青素含量是亟待解决的现实问题。

虾青素的分析方法主要为分光光度法和高效液相色谱法，其中液相色谱法更加准确、有效。但是，液相色谱法测定虾青素主要是以全反式虾青素的定量为主，由于只有全反式虾青素的制备较容易，可是结果不够准确。Jian-Ping Yuan等(香港大学，Food Chemistry，68(2008)：443-448)采用Waters Symmetry C18色谱柱分离分析了雨生红球藻中的虾青素，并采用全反相半制备柱分离纯化了虾青素的同分异构体，但没有定量方法。目前，还没有关于南极磷虾油中虾青素测定方法的文献。

发明内容：

本发明的目的在于提供了一种用凝胶渗透色谱净化-高效液相色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法，凝胶色谱柱使南极磷虾油中的脂肪和虾青素得到较好分离，采用C30-反相高效液相色谱法可以客观真实地反映其含量。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

凝胶渗透色谱净化-高效液相色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法，包括以下步骤：

a、采用BIO-3X填料的凝胶净化柱(定量线圈：5mL，玻璃柱：25mm*600mm)对南极磷虾油进行净化；

b、磷虾油的淋洗剂为乙酸乙酯和环己烷，乙酸乙酯∶环己烷＝1∶1，收集7.48～12.60min的馏分；

c、磷虾油经净化后旋转蒸干，用二氯甲烷∶甲醇(V∶V，25∶75，含1％BHT)溶解后，定量加入0.2M NaOH甲醇溶液，充氮后在5℃冰箱中反应过夜(12h以上)，使虾青素酯完全转化为游离虾青素；

d、采用YMC-Carotenoid C30色谱柱(250mm×4.6mm×5μm)对虾青素进行分离测定；

e、以甲醇(A)、叔丁基甲基醚(B)和1％的磷酸水溶液(C)为流动相，梯度洗脱程序为0min～15min，81％～66％A，15％～30％B，4％C；15min～23min，66％～16％A，30％～80％B，4％C；23min～27min，16％～81％A，80％～15％B，4％C；27min ～30min，81％A，15％B，4％C；

f、流动相的流速为1.0mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长为474nm，进样量为20μL，柱温为30℃；

g、确定虾青素的三种同分异构体，即：全反式虾青素，9-顺-虾青素，13-顺-虾青素，并采用三个峰面积的加和定量。

与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：

1、本发明的凝胶色谱柱能使南极磷虾油中的脂肪和虾青素得到较好分离，采用C30-反相高效液相色谱法可以客观真实地反映虾青素的含量，方法简单、灵敏、准确、重现性好。

2、线性试验及检测限试验结果表明，在一定浓度范围内，峰强度与质量浓度的线性关系良好(r＞0.99)；方法的定量限为20mg/kg。

3、方法的加标回收率范围为95.2％～106.7％，相对标准偏差为3.3％～13.5％。

附图说明：

图1：是虾青素的光谱图。

图2：NaOH甲醇溶液添加体积对虾青素皂化效率的影响。

图3：不同皂化时间对虾青素皂化效率的影响。

图4：南极磷虾油样品皂化前后色谱图，其中a为皂化前，b为皂化后。

图5：为虾青素标准溶液的选择离子图(1μg/mL)(质谱定性)。

图6：虾青素标准溶液皂化后色谱图。

具体实施方式：

本发明为一种用凝胶渗透色谱净化-高效液相色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法，具体出峰顺序为全反式虾青素，9-顺-虾青素，13-顺-虾青素。虾青素酯经皂化后可以完全转化为游离的虾青素，采用C30-反相高效液相色谱法可以客观真实地反映出游离虾青素的含量。

通过考察不同的试验参数进行了大量的反复比较试验，最终选用了最佳的净化条件、皂化条件和色谱条件。

下面以具体实施例并结合附图，进一步详细叙述本发明测定南极磷虾油中虾青素含量的技术方法。

一凝胶渗透色谱净化条件的建立及皂化条件的考察

仪器：Accuprerp MPS^TM自动凝胶色谱系统(GPC，美国J2 Scientific公司)，美国Agilent 1100高效液相色谱仪，配紫外检测器。

试剂：甲醇、二氯甲烷和叔丁基甲基醚均为色谱纯，2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)为化学纯。

采用BIO-3X填料的凝胶净化柱(定量线圈：5mL，玻璃柱：25mm*600mm)；

GPC淋洗曲线：样品运行前，须对自动凝胶色谱系统的淋洗条件进行选择。采用推荐流速5.0mL/min洗脱，淋洗剂为乙酸乙酯和环己烷，乙酸乙酯∶环己烷＝1∶1，以紫外检测器检测虾青素标液的流出时间以确定组分收集。由紫外吸收图可见(见图1)，虾青素的流出时间在7.48-12.60min之间。在溶剂洗脱条件下，以一定浓度标液进样，重复5次，虾青素的回收率分别为：95.3％、96.2％、95.8％、97.1％、95.1％，均大于95％，以此确定了本方法的洗脱曲线。

皂化条件考察：对不同的皂化溶剂、不同碱浓度和皂化时间对虾青素酯的皂化效率的影响进行了考察。

考察了丙酮(含1％BHT)、二氯甲烷(含1％BHT)、二氯甲烷∶甲醇(V∶V，25∶75，含1％BHT)、乙腈∶甲醇(V∶V，75∶25，含1％BHT)作为皂化溶剂对南极磷虾油中虾青素酯皂化效率的影响。三次平行实验的结果见表1。从表中可以看出，二氯甲烷：甲醇作为皂化溶剂的皂化效果最好。

表1不同溶剂对虾青素皂化效率的影响(n＝3)

不同浓度的NaOH甲醇溶液会影响虾青素的皂化效率，当浓度低时皂化不完全，浓度过高又会导致虾青素容易被氧化成虾红素，并且浓度过高会破坏虾青素而使得皂化效率降低。本文考察了0.2mol·L-1NaOH甲醇溶液添加体积从0.3-3mL的皂化效率，如图2所示。结果表明添加体积为0.5-1.2mL时，虾青素含量都大于4.1mg/kg，但是少于0.7mL时，在21.5～25.1min仍会出现少量虾青素酯的色谱峰，因此取1mL作为NaOH甲醇溶液添加量。

在上述最优条件下对不同的皂化时间进行了考察，结果如图3所示。从结果可以看到当皂化时间大于12h后虾青素便已经皂化完全。因此取12h作为最佳皂化时间。

试验表明，以二氯甲烷∶甲醇(V∶V，25∶75，含1％BHT)为溶剂，经1mL 0.2M NaOH甲醇溶液在5℃下皂化12h，能够使虾青素酯完全转化为游离虾青素，色谱图见图4。

二液相色谱条件的建立及样品检测：

色谱柱的选择：对不同规格的液相色谱柱：Agilent XDB-C18(250mm×4.6mm×5μm)、Agilent SB-C18(250mm×4.6mm×5μm)、YMC-Carotenoid C30(250mm×4.6mm×5μm)进行了考察，发现两种C18柱都不能很好的分离虾青素的顺式异构体，而YMC-Carotenoid C30色谱柱能够较好的分离虾青素的三种同分异构体；

检测器为紫外检测器，检测波长为474nm，进样量为20μL，柱温为30℃；

流动相的选择：对不同配比的流动相：甲醇、甲醇∶水、乙腈∶水、甲醇∶叔丁基甲基醚∶1％的磷酸水溶液进行了考察，经过多次试验后，发现以甲醇(A)、叔丁基甲基醚(B)和1％的磷酸水溶液(C)为流动相，流动相流速为1.0mL/min，梯度洗脱程序为0min～15min，81％～66％A，15％～30％B，4％C；15min～23min，66％～16％A，30％～80％B，4％C；23min～27min，16％～81％A，80％～15％B，4％C；27min～30min，81％A，15％B，4％C时效果较佳，不仅游离虾青素的三种同分异构体能够很好的分离，而且能够同时保证虾青素酯的出峰；

定性、定量方式：通过质谱定性确定虾青素的三种同分异构体(见图5)，利用相对保留时间及添加标准物质法定性，并采用虾青素反式体、顺式体三个峰面积之和来进行定量。

标准曲线和相关系数：分别配制浓度为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，5.0mg/L的虾青素标准工作液，皂化后供高效液相色谱分析，标液皂化后的谱图见图6。以虾青素三种同分异构体目标物色谱峰面积为纵坐标，以相应的浓度为横坐标，绘制标准曲线，拟合，求标准曲线方程和相关系数。

Y＝199182X+7.2942，R2＝0.9998。

加标回收率、精密度、准确度实验：准确称取南极磷虾油进行加标回收率实验，分别在样品中加入高、中、低3个水平的混合标样，每组重复进样6次，测定其回收率，并计算含量的相对标准偏差(RSD)；对一定浓度的标液进行日内和日间实验，日内连续进样5次，日间每隔1d进样1次并连续3d，计算RSD(见表2)。

表2方法的加标回收率、方法的精密度和准确度

样品中含量的测定：称取0.2-0.5g南极磷虾油样品，加入4mL乙酸乙酯-环己烷(1∶1，V/V)，涡旋混匀，通过5mL样品环注入GPC柱，泵流速5.0mL/min，弃去0-7.48min流分，收集7.48-12.60流分，12.60-20min冲洗GPC柱。洗脱液为乙酸乙酯-环己烷混合溶液。将收集的流分旋转蒸发浓缩至干，加入约2mL二氯甲烷-甲醇(V∶V，25∶75，含1％BHT)，转移于5mL容量瓶中，重复一次，合并提取液，再准确加入1mL 0.2mol/L NaOH甲醇溶液，涡旋混匀，用上述二氯甲烷-甲醇溶液定容，充氮密封，在5℃冰箱中反应过夜(12h以上)，过0.45μm滤膜后进入高效液相色谱仪分析。

本发明建立了一种用凝胶渗透色谱净化-高效液相色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法，凝胶色谱柱使南极磷虾油中的脂肪和虾青素得到较好分离，采用C30-反相高效液相色谱法可以客观真实地反映虾青素的含量，为定量、准确的评价南极磷虾油中虾青素的含量提供了依据。

Claims (1)

1.一种色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

a、采用定量线圈：5mL、玻璃柱：25mm*600mm、BIO-3X填料的凝胶净化柱对南极磷虾油进行净化；

b、磷虾油的淋洗剂为乙酸乙酯和环己烷，乙酸乙酯∶环己烷＝1∶1，收集7.48～12.60min的馏分；

c、磷虾油经净化后在含1％BHT、体积比25∶75的二氯甲烷∶甲醇的溶剂中皂化，使虾青素酯转化为游离虾青素；

d、采用250mm×4.6mm×5μm规格的YMC-Carotenoid C30色谱柱对虾青素进行分离测定；

e、以A：甲醇、B：叔丁基甲基醚和C：1％的磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱程序为0min～15min，81％～66％A，15％～30％B，4％C；15min～23min，66％～16％A，30％～80％B，4％C；23min～27min，16％～81％A，80％～15％B，4％C；27min～30min，81％A，15％B，4％C；

f、流动相的流速为1.0mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长为474nm，进样量为20μL，柱温为30℃；

g、确定虾青素的三种同分异构体，即：全反式虾青素，9-顺-虾青素，13-顺-虾青素，并采用三个峰面积的加和定量。

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