CN113092600B - 一种高效液相色谱串联质谱法测定白坚木皮醇的方法 - Google Patents

一种高效液相色谱串联质谱法测定白坚木皮醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱串联质谱法测定白坚木皮醇的方法。所述的高效液相色谱串联质谱测定白坚木皮醇的色谱分离柱选择为氨基色谱分离柱。本发明的色谱分离柱选择氨基柱，流动相配方包括水和乙腈按照不同比例进行梯度洗脱，可实现白坚木皮醇的良好分离效果，并有较高的柱效。本发明提供的高效液相色谱串联质谱测定白坚木皮醇的方法，可简单、快速、高效地对白坚木皮醇进行定性和定量检测，有效提高白坚木皮醇的检测灵敏度，在0.005～1mg/L浓度范围内表现出良好的线性，线性相关系数为0.9993，峰型良好，加标回收率高。

Description

一种高效液相色谱串联质谱法测定白坚木皮醇的方法
技术领域
本发明属于质谱分离小分子化合物领域，具体涉及一种高效液相色谱串联质谱法测定白坚木皮醇的方法。
背景技术
白坚木皮醇［2-甲氧基-L-(－) -手性-肌醇］，又称白雀木醇，是植物维持渗透压的主要成分。研究表明，白坚木皮醇具有一定的冷冻保护能力，可作为鹰嘴豆和菠菜的植物保护剂。白坚木皮醇是荔枝光合作用主要产物和韧皮部碳水化合物运输的主要形式，是大型木本荔枝低耗、节能和高抗生物胁迫的碳素代谢策略。白坚木皮醇也是一种具有旋光活性的药用天然化合物，可作为治疗、保健等药物，如在美容护肤膏、洗发香波、洗澡香皂中加入一定量的白坚木皮醇，使用后可令人体肌肤滋润、光泽、去皱纹和增加弹性；此外，白坚木皮醇还具有清除氧自由基的特殊功效。白坚木皮醇可减轻6-羟多巴胺对老鼠胎儿中脑细胞悬浮系的毒性，抑制血小板的凝集，还可以作为前体合成无毒、无害而有特效的手性药物，用于治疗癌症、早期痴呆症、糖尿病和艾滋病等疾病及美容保健。近年来白坚木皮醇被广泛应用于医药原料和保健品，其质量控制直接影响医药和保健品的质量水平。因此，白坚木皮醇含量的测定方法尤为重要。
由于白坚木皮醇属于强极性的亲水化合物，分子量小、紫外吸收弱，很难用GC、GC-MS、HPLC等仪器检测。已有报道采用高效液相色谱法配示差折光检测器、二极管阵列检测器、蒸发光散射检测器以及GC-MS分析白坚木皮醇，液相色谱的传统反相色谱柱（C18柱）很难达到良好的分离效果，尽管有报道采用ZIC-HILIC色谱柱可实现白坚木皮醇分离，但检出限仅为10～80mg/L，完全达不到微量检测目的；使用气质联用仪检测需要预先将样品进行复杂的衍生化反应，费时费力。目前缺乏一种快速、方便、准确地检测白坚木皮醇含量的仪器方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、快速、准确的检测白坚木皮醇含量，线性关系良好，加标回收率高，并可获得白坚木皮醇的良好峰型的高效液相色谱串联质谱法。
本发明的高效液相色谱串联质谱法测定白坚木皮醇的方法，包括以下步骤：
所述的高效液相色谱串联质谱测定白坚木皮醇的色谱分离柱选择为氨基色谱分离柱。
优选，所述的高效液相色谱串联质谱测定白坚木皮醇，其流动相为：
A相：水；
B相：乙腈。
其中，梯度洗脱程序如下：在0～1.0min内，流动相水和乙腈的体积比为10:90；在2～5min内，流动相水和乙腈的体积比由10:90匀速渐变至85:15；在5～6min内，流动相水和乙腈的体积比由85:15匀速渐变至10:90，保持2min。
优选，所述的质谱，其质谱条件为：选择质核比m/z=84.9和m/z=161.0作为定性定量离子对；流速为0.7mL/min；柱温为35℃；ESI离子源负模式，雾化气流量2.0mL/min，干燥气和加热气流量均为10.0mL/min，接口温度300°C，脱溶剂温度526°C，加热块温度400°C，雾化气为氮气，碰撞气为氩气，碰撞能量分别为22v、12v。
本发明的色谱分离柱选择氨基柱，流动相配方包括水和乙腈按照不同比例进行梯度洗脱，可实现白坚木皮醇的良好分离效果，并有较高的柱效。本发明提供的高效液相色谱串联质谱测定白坚木皮醇的方法，可简单、快速、高效地对白坚木皮醇进行定性和定量检测，有效提高白坚木皮醇的检测灵敏度，在0.005～1mg/L浓度范围内表现出良好的线性，线性相关系数为0.9993，峰型良好，加标回收率高。
附图说明
图1是采用Agilent Infinitylab poroshell 120 SB-C18作为色谱柱的色谱图。
图2是采用Agilent Zorbax Extend-C18作为色谱柱的色谱图。
图3是采用Agilent Zorbax SB-Aq C18作为色谱柱的色谱图。
图4是采用岛津Shim-pack GIST-HP C18作为色谱柱的色谱图。
图5是白坚木皮醇0.005mg/L标样谱图。
图6是白坚木皮醇0.01mg/L标样谱图。
图7是白坚木皮醇0.05mg/L标样谱图。
图8是白坚木皮醇0.1mg/L标样谱图。
图9是白坚木皮醇0.5mg/L标样谱图。
图10是白坚木皮醇1mg/L标样谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一：
一、一种高效液相色谱串联质谱法测定白坚木皮醇的方法，包括以下步骤：
1、取白坚木皮醇26.75mg，精确到0.01mg，置于空容量瓶中，用超纯水定容至25mL，涡旋混合3～5min，超声提取5min，逐级稀释，过0.22μm滤膜，进样（高效液相色谱-串联质谱联用仪）对样品中白坚木皮醇进行检测；
2、高效液相色谱-串联质谱联用仪的色谱分离柱为：
A、不同类型C18色谱柱
①Agilent Infinitylab poroshell 120 SB-C18、
②Agilent Zorbax Extend-C18、
③Agilent Zorbax SB-Aq C18、
④岛津Shim-pack GIST-HP C18）；
B、氨基色谱分离柱，其是以氨基键合硅胶为固定相的高效液相色谱柱，色谱柱柱长250mm，柱内径4.6mm，粒径5μm；
高效液相色谱-串联质谱联用仪的流动相为：
A相：水；
B相：乙腈
水和乙腈进行梯度洗脱，梯度洗脱过程如下：在0～1.0min内，流动相水和乙腈的体积比为10:90；在2～5min内，流动相水和乙腈的体积比由10:90匀速渐变至85:15；在5～6min内，流动相水和乙腈的体积比由85:15匀速渐变至10:90，保持2min；
高效液相色谱-串联质谱联用仪的数据采集模式为多反应监测模式MRM，选择质核比m/z=84.9和m/z=161.0作为定性定量离子对；高效液相色谱-串联质谱联用仪的流速为0.7mL/min；高效液相色谱-串联质谱联用仪的柱温为35℃；高效液相色谱-串联质谱联用仪的进样体积为10μL；高效液相色谱-串联质谱联用仪的质谱条件为ESI离子源负模式，雾化气流量3.0mL/min，干燥气和加热气流量均为10.0mL/min，接口温度300°C，脱溶剂温度526°C，加热块温度400°C，雾化气为氮气，碰撞气为氩气，碰撞能量分别为12v、22v。
从色谱图1-4中可以看出C18柱分离白坚木皮醇标准溶液的效果较差，峰型分叉，且不同浓度含量的白坚木皮醇在C18柱上的峰面积积分没有差异。因此，C18柱并不适合强极性亲水化合物白坚木皮醇的分离。从色谱图图5～10中可以看出，对白坚木皮醇标准溶液的分离度较好，柱效高，峰型对称，适于白坚木皮醇的分离。
因此选用氨基色谱分离柱进行分离。
二、线性实验：
称取白坚木皮醇标准品约28.94mg于25mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度。用超纯水将白坚木皮醇标准品溶液稀释配制成一系列标准溶液，进样分析，参数参见步骤一。以白坚木皮醇标准品溶液浓度为横坐标、定量离子峰面积为纵坐标作图，得到线性方程和相关系数。具体实验数据见下表1。
表1 白坚木皮醇系列标准溶液的线性方程和回归系数
如表1所示，为白坚木皮醇的各稀释标准溶液的保留时间、峰面积及其他相关参数。白坚木皮醇在0.005～1mg/L浓度范围内表现出良好的线性关系，相关系数为0.999，满足检测要求。
三、精密度：
选取0.1mg/L白坚木皮醇标准品浓度进行精密度实验，重复5次进样分析，参数参见步骤一（用氨基色谱分离柱），具体数据见下表2。
表2 白坚木皮醇0.1mg/L标准品精密度实验数据
如表2所示数据可以看出，实验的精密度可达到检测要求。
四、加标回收率：
取已知浓度的白坚木皮醇标准液，分别按照低、中和高（0.01mg/L、0.1mg/L、1.0mg/L）3个浓度水平添加，每个添加样品5次重复（参数参见步骤一，用氨基色谱分离柱），计算加标回收率，结果如表3所示。结果显示：白坚木皮醇的平均回收率为100%～103%，相对标准偏差（RSD）为2.79%～3.62%。由此可知，白坚木皮醇的回收率和精密度均符合要求。
表3 添加回收率
以上所述的实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种高效液相色谱串联质谱法测定白坚木皮醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
所述的高效液相色谱串联质谱测定白坚木皮醇的色谱分离柱选择以氨基键合硅胶为固定相的高效液相色谱柱，色谱柱柱长250mm，柱内径4.6mm，粒径5μm；
取白坚木皮醇，置于空容量瓶中，用超纯水定容，涡旋混合，超声提取，逐级稀释，过滤膜，进样高效液相色谱-串联质谱联用仪，进样体积为10μL，对样品中白坚木皮醇进行检测；
所述的高效液相色谱串联质谱测定白坚木皮醇，其流动相为：
A相：水；
B相：乙腈；
其中，梯度洗脱程序如下：在0～1.0min内，流动相水和乙腈的体积比为10:90；在2～5min内，流动相水和乙腈的体积比由10:90匀速渐变至85:15；在5～6min内，流动相水和乙腈的体积比由85:15匀速渐变至10:90，保持2min；流速为0.7mL/min；柱温为35℃；
所述的质谱，其质谱条件为：数据采集模式为多反应监测模式MRM，选择质核比m/z=84.9和m/z=161.0作为定性定量离子对；ESI离子源负模式，雾化气流量3.0mL/min，干燥气和加热气流量均为10.0mL/min，接口温度300°C，脱溶剂温度526°C，加热块温度400°C，雾化气为氮气，碰撞气为氩气，碰撞能量分别为22v、12v。
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