CN111272516A

CN111272516A - 单宁酸标准样品的制备方法

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Publication number: CN111272516A
Application number: CN202010264804.8A
Authority: CN
Inventors: 张亮亮; 汪康
Original assignee: Institute of Chemical Industry of Forest Products of CAF
Current assignee: Institute of Chemical Industry of Forest Products of CAF
Priority date: 2020-04-07
Filing date: 2020-04-07
Publication date: 2020-06-12

Abstract

本发明公布了一种单宁酸标准样品的制备方法，属于分析检测技术领域。它是将五倍子单宁酸经甲醇甲酸溶液溶解后，通过葡聚糖凝胶色谱柱分离，收集70％丙酮洗脱部分，减压蒸发去除丙酮，水相冷冻干燥得到单宁酸标准样品。该方法制备的单宁酸标准样品均匀性好、量值准确、纯度高，从而为单宁酸产品的质量检测提供了优质的标准品。

Description

单宁酸标准样品的制备方法

技术领域

本发明涉及一种单宁酸标准样品的制备方法，属于分析检测技术领域。

背景技术

单宁酸(Tannic acid)是以我国林特产品五倍子为原料进行加工的产品，具有很强的生物和药理活性，在医药、食品、日化等方面具有广泛的应用。以单宁酸为原料通过深加工可生产没食子酸、焦性没食子酸、没食子酸丙酯等多种林产精细化工产品，是在国民经济中占有重要地位的林化产品。我国从20世纪40年代开始生产单宁酸，目前产品结构也向多方面发展，除传统的工业单宁酸外，市场上已经开发出药用级单宁酸、食用级单宁酸等系列产品。工业级单宁酸的单宁含量为81％左右。其中除含主成分单宁酸外，尚含有与单宁酸有生源关系的酚酸和水解产物、多糖、树脂、色素、少量无机盐等杂质。工业单宁酸再经冷冻澄清、溶剂萃取、活性炭处理、树脂吸附等多种方法提纯后，可制得不同纯度规格的单宁酸产品，如药用单宁酸、食用单宁酸等。

从化学结构上看，单宁酸是由不同数目棓酰基和葡萄糖形成的酯的聚合物的一类天然多酚类化合物。因此，从化学成分上看单宁酸是由不同聚合度的棓酸组成的混合物。其中又以1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(PGG)含量为主要成分。目前，已有关于1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖标准样品的制备技术专利，但尚没有检索到单宁酸标准样品制备的相关技术专利。单宁酸含量是各种规格单宁酸产品的主要技术指标。此外，采用现代仪器分析技术进行植物化学研究时，常涉及单宁酸成分的定性和定量检测。这些测定方法均需要标准样品。本发明提供了一种单宁酸标准样品的制备技术，可作为测定单宁酸含量的标准参照物。

五倍子单宁酸的化学结构

发明内容

本发明的目的是提供一种单宁酸标准样品的制备方法。

本发明的技术方案为：一种单宁酸标准样品的制备方法，包括以下步骤：

(1)以单宁酸作为材料，将单宁酸按照单宁酸：甲醇甲酸溶液＝1:5g/mL的比例溶于甲醇甲酸溶液，水浴加热至溶解充分；

(2)反应结束后，上葡聚糖凝胶色谱柱，先用体积百分比为50％的甲醇甲酸溶液冲洗去杂，再用体积百分比浓度为70％的丙酮洗脱，收集丙酮洗脱部分，减压除去丙酮，得到粗提液，水相经干燥后得到单宁酸标准品，呈米白色粉末状固体。

步骤(1)中的单宁酸为以五倍子为原料，提取制备的单宁酸，含量为大于等于80％。

步骤(1)和(2)中的甲醇甲酸溶液中甲醇体积百分比浓度为50％，甲酸体积百分比浓度为1％。

步骤(2)中的色谱柱的填料是Sephadex LH-20葡聚糖凝胶色谱填料。

步骤(2)中的减压去除丙酮水浴加热的温度为40-45℃。

步骤(2)中所用丙酮溶液体积百分比浓度为70％。

步骤(2)中所述干燥方法为冷冻干燥，或真空干燥，或喷雾干燥，或微波干燥。

干燥为冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥、微波干燥中的任一种。

有益效果

本方法制备的单宁酸准样品均匀性好、量值准确、稳定性好，从而为单宁酸质量的检测、定量等提供优质的标准品。

附图说明

图1单宁酸标准样品的制备工艺路线。

图2单宁酸高效液相色谱图。

图3单宁酸紫外波长吸收扫描谱图。

具体实施方式

本具体实施例仅是对发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

本发明中的百分比浓度均为体积百分比浓度。

实施例1单宁酸标准样品的制备

单宁酸标准样品的制备工艺路线见图1所述。称取单宁酸10.0g置于100mL烧杯中，加入50mL体积百分比浓度为50％甲醇甲酸溶液(含1％体积浓度甲酸)于水浴中40℃加热至溶解充分，反应液上Sephadex LH-20葡聚糖凝胶色谱柱，先用1L体积百分比浓度为50％的甲醇溶液(含1％甲酸)冲洗去杂，再用500mL体积百分比浓度为70％的丙酮洗脱，收集丙酮洗脱部分，45℃减压蒸发除去丙酮，水相经冷冻干燥后得到米白色粉末状固体单宁酸标准样品3.24g。单宁酸标准样品成分经高效液相色谱仪分析，其色谱图见图2。其紫外吸收波长扫描谱图见图3，单宁酸标准样品的最大吸收波长为276nm。实施例2单宁酸标准样品的制备

称取单宁酸10.0g置于100mL烧杯中，加入50mL体积百分比浓度为50％甲醇甲酸溶液(含1％甲酸)于水浴中40℃加热至溶解充分，反应液上Sephadex LH-20葡聚糖凝胶色谱柱，先用1L体积百分比浓度为50％的甲醇溶液(含1％甲酸)冲洗去杂，再用500mL体积百分比浓度为70％的丙酮洗脱，收集丙酮洗脱部分，40℃减压蒸发除去丙酮，水相经冷冻干燥后得到米白色粉末状固体单宁酸标准样品4.08g。

实施例3单宁酸标准样品的制备

称取单宁酸100.0g置于1000mL烧杯中，加入500mL体积百分比浓度为50％甲醇甲酸溶液(含1％甲酸)于水浴中40℃加热至溶解充分，反应液上Sephadex LH-20葡聚糖凝胶色谱柱，先用10L体积百分比浓度为50％的甲醇溶液(含1％甲酸)冲洗去杂，再用5L体积百分比浓度为70％的丙酮洗脱，收集丙酮洗脱部分，40℃减压蒸发除去丙酮，水相经冷冻干燥后得到米白色粉末状固体单宁酸标准样品约40g。

实施例4单宁酸含量测定(UV法)

参照我国现行林业行业标准《单宁酸分析试验方法》(LY/T 1642-2005)测定单宁酸含量。

具体操作方法简述如下：

(1)溶液的配置：

单宁酸溶液的制备。称取烘干至恒量的单宁酸标准样品0.100g，溶于少量热水中，移入100mL容量瓶内，冷却至室温，用水稀释至刻度，摇匀。1mL溶液含约1mg单宁酸标准样品。

非单宁溶液的制备。吸取单宁酸溶液的制备液50mL，移入250mL广口瓶中，加入1.00g铬皮粉，加塞振荡6～7次后，在旋转振荡器上振荡10min；滤纸过滤，滤液用100mL三角瓶收集。

非单宁工作溶液的制备。吸取非单宁溶液的制备液2mL，移入200mL容量瓶内，用水稀释到刻度，摇匀。

单宁酸工作溶液的制备。吸取单宁酸溶液的制备液2mL，移入200mL容量瓶内，用水稀释到刻度，摇匀。

(2)测定程序：

采用紫外分光光度计，在波长276nm处，以蒸馏水作参比，用1cm比色皿，分别测定非单宁工作溶液和单宁酸工作溶液的吸光值。

(3)结果的表述：

单宁酸含量以干基质量百分数X计，数值以％表示。计算公式：

式中：Y—为电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP)检测的杂质的质量百分比；A₀—非单宁工作溶液的吸光度的数值；

A₁—单宁酸工作溶液的吸光度的数值。

(2)实验结果

结果得到待测单宁酸产品含量为99.54％。

实施例5标准品均匀性检验与结果评价

(1)均匀性评价

按GB/T 15000.3-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》的规定，对单宁酸标准样品进行均匀性检验，并采用F检验法多均匀性结果进行评价。从上述充分混均后分装的150瓶中，随机抽取15瓶，进行单宁酸标准品均匀性的含量检测，每瓶中称取4个样品，称样量为0.1g，定溶于100mL水中。利用高效液相色谱方法，测定各个样品的含量，测定值见表1。

表1 单宁酸标准样品含量均匀性检验数据表(含量值，％)

方差分析得到的结果见表2。

表2 单宁酸标准样品含量的瓶间均匀性研究的方差分析表

变差源	SS	自由度	MS
				瓶间	0.3784	14	0.027
瓶内	0.6593	45	0.015
				总和	1.0377	59

查F－分布表，F检验的临界值F_{0.05(14，45)}＝1.92。

表明在样品非均匀性影响的显著性α＝0.05的情况下，F检验的计算统计量1.80小于其临界值1.92，由此可以判定样品均匀性检验合格。确定试验中单宁酸标准样品的取样量0.1g为最小取样量。

(2)稳定性评价

1)检测方法的选取

从已通过均匀性检验的15瓶样品随机抽取3瓶作为原始样品，每瓶重复检测单宁酸含量4次，称样量为0.1g，定溶于100mL水中。含量测定方法与均匀性检验过程所用含量测定方法相同。

2)检验数据处理

选定贮存期(月)分别为t＝0、6、9、12、15(月)，进行单宁酸含量测定。检测结果见表3。本项抽检工作还将继续进行，以观察单宁酸标准品在更长时间的稳定性。

表3 样品稳定性检验结果(含量值，％)

3)稳定性检验和结果评价

依据GB/T15000.3-2008《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》的规定，进行稳定性研究。以直线作为经验模型。

直线斜率可用下式计算：

式中：

截距由下式计算：

直线上的点的标准偏差可由下式计算：

取其平方根s＝0.024656，与斜率相关的不确定度用下式计算：

自由度为n–2和p＝0.95(95％置信水平)的t分布因子等于3.18。

由于：|b₁|＜t_0.95,n-2·s(b₁)

故斜率变化是不显著的。因而未观测到不稳定性。检验结果表明单宁酸标准品在15个月内是稳定的。

4)定值步骤的描述定值方法：

采用4.1.2节所述皮粉吸收与紫外吸收相结合的方法，进行多实验室联合定值，测定单宁酸标准样品的含量。选取水平相当的6个实验室，向每个实验室提供2个单元单宁酸标准样品，采用统一的测试方法，每单元进行3次重复测量。

联合定值实验室的确定：

根据《标准样品工作导则》的原则要求，采用在6个水平相当的实验室(1.江苏省理化测试中心；2.南京市产品质量监督检验院；3.国家林业局林化产品质量监督检验站；4上海质量监督检验技术研究院；5.上海天祥质量技术服务有限公司；6.中国林业科学研究院林产化学工业研究所植物提取物研究室)，以皮粉吸收与紫外吸收相结合的方法进行测定。

数据统计处理与检验准则：

(1)对获得的数据进行Grubb’s检验，检验确定是否有提供不合格数据的实验室，不合格数据剔除。

(2)计算总平均值、实验室间平均值的标准偏差。

(3)扩展不确定度评估：通过均匀性、稳定性、联合定值及合成计算对特性值总不确定度的贡献。

定值数据：

对6个实验室的测定数据进行Grubb′s检验，检测数据都有效。本发明技术研制的单宁酸标准样品的含量定值结果为：

含量标准值：99.21％；

扩展不确定度(k＝2)：0.24％。

Claims

1.一种单宁酸标准样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.按照权利要求1的方法，其特征在于，步骤(1)中的单宁酸为以五倍子为原料，提取制备的单宁酸，含量为大于等于80％。

3.按照权利要求1所述的单宁酸标准样品的制备方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中的甲醇甲酸溶液中甲醇体积百分比浓度为50％，甲酸体积百分比浓度为1％。

4.按照权利要求1所述的单宁酸标准样品的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的色谱柱的填料是Sephadex LH-20葡聚糖凝胶色谱填料。

5.按照权利要求1所述的单宁酸标准样品的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的减压去除丙酮水浴加热的温度为40-45℃。

6.按照权利要求1所述的单宁酸标准样品的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所用丙酮溶液体积百分比浓度为70％。

7.按照权利要求1所述的单宁酸标准样品的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述干燥方法为冷冻干燥，或真空干燥，或喷雾干燥，或微波干燥。

8.按照权利要求1所述的单宁酸标准样品的制备方法，其特征在于，干燥为冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥、微波干燥中的任一种。