CN106153801A - 一种同时检测白酒原辅料中七种真菌毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测白酒原辅料中七种真菌毒素的方法，采用改良的QuEChERS方法进行提取，无需进一步净化，利用高效液相色谱实现真菌毒素的分离，联用四级杆‑静电场轨道阱质谱（Q‑Orbitrab），将高效的母离子选择性和高分辨的精确分子质量（质量数可精确到小数点后5位）相结合，能够准确定性定量白酒及原辅料中的真菌毒素，基质外标法定量。真菌毒素可在9min内实现全部有效分离,真菌毒素在各自的线性响应范围内线性关系良好，相关系数R2>0.999，最低定量限低于1.0μg/L，最低检测限低于0.1μg/L，回收率介于为70%‑120%之间，相对标准偏差（RSD）为0.5%‑4%。而本发明与国标法相对比具有快速、简便、经济、高效、安全等特点，可适用于白酒及原辅料样品中各真菌毒素的分离和定量检测。

Description

一种同时检测白酒原辅料中七种真菌毒素的方法
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种同时检测白酒原辅料中七种真菌毒素的方法。
背景技术
真菌毒素是由各种真菌在适宜的环境温度和湿度条件下繁殖而产生的一系列次级有毒代谢产物。目前报道的真菌毒素已多达400余种，大部分真菌毒素具有很高的生物毒性，可以抑制免疫系统，具有致癌、致畸、影响生长发育等不良健康效应。真菌毒素广泛存在于粮食中，而中国传统白酒是以高粱、小麦、大麦、玉米、大米等粮食作为主要原料的，麸皮和稻壳为辅料，作为主要微生物来源和酶制剂的酒曲，也是由大麦、小麦、豌豆等粮食制成。因此制曲和酿酒过程中均有多种属霉菌的参与，在淀粉质的水解中发挥了不可取代的作用，在酿酒生产中增加了真菌毒素产生的风险。国标GB 2761-2011中规定了食品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、展青霉素、赭曲霉毒素A及玉米赤霉菌烯酮的限量指标，对于粮食及其制品做了明确限量。随着我国经济快速发展，人民群众物质文化生活水平不断提高，对食品安全的关注进一步提高，食品安全的风险防控和预警工作显得尤为重要。
随着各国对食品中真菌毒素危害认识不断加深，其检测技术也在不断发展。目前检测方法主要包括生物鉴定法、免疫分析法、化学分析法和仪器分析法。生物鉴定法对样品纯度要求较低，主要为定性分析，专一性不强，灵敏度较低，费用较高，实验周期较长，一般只作为化学分析法的佐证。免疫分析法具有高特异性、高灵敏度以及稳定、快速、简便等特点，而且可以在组织、细胞和分子等不同层次、不同水平上应用，但由于有些真菌毒素难与载体蛋白质偶联，而且结构相似物较多，交叉反应普遍，该方法存在一定的假阳性，不能作为最终的确证方法。因此，迫切需要建立一套快速、准确、稳定的检测白酒及其原辅料中真菌毒素的检测方法体系，对于白酒及其原辅料的食品安全风险防控、行业相关标准的制定和行业的良性发展都具有十分重要的实践意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种同时检测白酒原辅料中七种真菌毒素的方法，具有前处理简便、分析时间短、样品无损失、检测限低、回收率高、稳定性好等优点，可同时检测白酒原辅料中七种真菌毒素的含量。
本发明通过以下技术方案实现：
一种同时检测白酒原辅料中七种真菌毒素的方法，包括以下步骤：
1）待测样品的制备：称取均质后的待测样品，80%乙腈水溶液萃取后过0.22μm微孔滤膜，待测；
2）真菌毒素混标制备：配制呕吐毒素、赭曲霉素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2七种毒素混标，用纯甲醇溶解并定容至刻度，其中玉米赤霉烯酮浓度为50mg/L，其余浓度均为10mg/L，配制的标准储备溶液于-20℃下避光保存备用；
按步骤1）方法制成空白样品提取液，用空白样品提取液将标准储备溶液配成浓度1-500 ppb溶液范围内至少6个点的基质混合标准溶液，待测；
3）步骤1）样品和步骤2）混标分别采用高分辨Q-Exactive液质联用仪进行真菌毒素分离、检测，色谱条件为：
色谱柱：HypersilGOLDC18色谱柱（100mm×2.1mm，3μm）；流动相：A：5mm甲酸铵水溶液，B：甲醇；流速：0.30mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；梯度洗脱程序：
时间（min） 0 0.5 5 7 9
A% 90 90 10 10 90
B% 10 10 90 90 10
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：Full-MS/t-MS2模式；鞘气压力：35arb；辅助气压力：10arb；毛细管电压：3.80kv（+），3.20kv（-）；毛细管温度：350℃；探针温度：300℃；分辨率：70，000；扫描范围：56-840m/z，Full-MS扫描模式；HCD碰撞能量：50eV；
4）通过ToxID软件中真菌毒素数据库的精确质量数和保留时间筛选混标中和样品中真菌毒素，然后对比样品与标品Full-MS模式检测的一级碎片离子定性以及t-MS2模式检测的二级碎片离子定性，得到色谱图后采用自动积分，通过拟合标准曲线计算得到测定液中待测组分的浓度为C，单位为µg/L，样品中真菌毒素定量按照公式进行计算:X=,其中X为样中待测组分的含量，单位mg/kg；C为测定液中待测组分的浓度，单位为µg/L；V为加入乙腈的体积，单位为ml；M为样品称样量，单位为g。
本发明进一步改进方案是，步骤1）中准确称取均质后的待测样品2g入离心管中，加入体积比乙腈：水等于80：20的乙腈水20ml，超声提取10min后，再加入2g无水硫酸镁、0.5氯化钠，涡旋振荡3min，以9000r/min离心10min，取上层溶液，过0.22μm微孔滤膜，直接上机检测。
本发明与现有技术相比，具有以下明显优点：
一、本发明采用改良的QuEChERS方法进行提取，无需进一步净化，节约时间，提高效率。
二、利用QE液质联用仪可同时检测不同的真菌毒素，实现高效分离；带有四级杆-静电场轨道阱质量分析器的质谱仪检测，根据对比一级碎片、二级碎片中标品、样品中相应真菌毒素的精确质量数和保留时间进行离子定性，然后再根据色谱图中的峰面积计算出样品中真菌毒素定量。与国标法相比，可实现成本最低化，并具有快速、高效、简便、安全等特点。
附图说明
图1为真菌毒素混标色谱图。
图2为样品色谱图。
图3为AFB1真菌毒素的二级离子色谱图产生的二级碎片结构式。
图4为AFB2真菌毒素的二级离子色谱图产生的二级碎片结构式。
图5 为AFG1真菌毒素的二级离子色谱图产生的二级碎片结构式。
图6 为AFG2真菌毒素的二级离子色谱图产生的二级碎片结构式。
图7 为DON真菌毒素的二级离子色谱图产生的二级碎片结构式。
图8 为ZEN真菌毒素的二级离子色谱图产生的二级碎片结构式。
图9 为OTA真菌毒素的二级离子色谱图产生的二级碎片结构式。
图10 为红粮基质+50PPB混标液质谱图。
图11为 CH3OH+50PPB混标液质谱图。
图12为真菌毒素标品标准曲线图。
具体实施方式
本发明建立了一种超高效液相色谱联用四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱检测白酒及原辅料中真菌毒素的方法，结合以下实例来说明具体实施方法。
1）待测样品的制备：样品选取今世缘公司生产所需的玉米，取均匀样品约50g玉米，利用实验室小型粉碎机进行粉碎，贴标签保存。取粉碎后样品2.0g置于50 mL离心管中；加入乙腈/水(80∶20，v/v)提取液 20 mL，超声提取10min后；再加入2g无水硫酸镁和0.5g氯化钠；涡旋振荡3min，以9000r/min离心10min；直接取上层溶液，过0.22μm微孔滤膜，待仪器分析测定；
2）真菌毒素标品制备：分别：呕吐毒素（又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇，DON）、赭曲霉素（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2（AFB2）、黄曲霉毒素G1（AFG1）、黄曲霉毒素G2（AFG2）（纯度均≥99.5%），用纯甲醇溶解并定容至刻度，其中玉米赤霉烯酮浓度为50mg/L，其余浓度均为10mg/L，配制的标准储备溶液于-20℃下避光保存备用；
按步骤1）方法制成空白样品提取液，用空白样品提取液将标准储备溶液配成浓度1-500 ppb溶液范围内至少6个点的基质混合标准溶液，待测；
3）步骤1）样品和步骤2）标品分别采用高分辨Q-Exactive液质联用仪进行真菌毒素分离、检测，色谱条件为：
色谱柱：HypersilGOLDC18色谱柱（100mm×2.1mm，3μm）；流动相：A：5mm甲酸铵水溶液，B：甲醇；流速：0.30mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；梯度洗脱程序：
时间（min） 0 0.5 5 7 9
A% 90 90 10 10 90
B% 10 10 90 90 10
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：Full-MS/t-MS2模式；鞘气压力：35arb；辅助气压力：10arb；毛细管电压：3.80kv（+），3.20kv（-）；毛细管温度：350℃；探针温度：300℃；分辨率：70，000；扫描范围：56-840m/z，Full-MS扫描模式；HCD碰撞能量：50eV；
4）通过ToxID软件中真菌毒素数据库的精确质量数和保留时间筛选混标中和样品中真菌毒素，然后对比样品与标品Full-MS模式检测的一级碎片离子定性以及t-MS2模式检测的二级碎片离子定性，得到色谱图后采用自动积分，通过拟定标准曲线计算得到测定液中待测组分的浓度为C，单位为µg/L。样品中真菌毒素定量按照公式进行计算: X=,其中X为样中待测组分的含量，单位mg/kg；C为测定液中待测组分的浓度，单位为µg/L；V为加入乙腈的体积，单位为ml；M为样品称样量，单位为g。
图1为真菌毒素混标色谱图。
图2为样品色谱图。
本发明实施条件的选定：
一、提取和净化条件的优化
在QuEChERS提取方法中，加入无水硫酸镁和氯化钠能产生盐析效应，降低基质中亲水性成分的溶解度从而提高了提取效率。同时，盐析效应降低了提取液中的水分含量，使得后续的去溶剂步骤更加快速节约了实验时间。传统的QuEChERS方法中，除了加入混合盐，通常还要加入C18、 乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA）等吸附剂来吸附色素或油脂。而在加入吸附剂是否会造成部分目标物的损失进行实验。选取5种毒素进行净化处理加标回收实验。
分别称取5份2g磨碎的玉米，编号为1，2，3，4，5。1作为空白对照，向其中2，3，4，5中加入浓度为100 μg/L的5种真菌毒素的混标200μL，使其浓度为10 μg/kg。为对比净化结果，净化处理分为不净化（2），只加C18粉末（3），只加PSA粉末（4）和C18和PSA粉末都加 （5），定量用标准品配制于甲醇中，测定结果如下。
表1玉米中真菌毒素加标定量结果（单位：µg/kg）
由表1可知，玉米空白样品中，均无检测到5种真菌毒素，加标样品中均能检测到，说明QuEChERS法能够提取玉米中的真菌毒素，但回收率很低。对于AFL B1、 AFL B2、AFL G1、AFLG2、OTA未加净化剂时回收率较高，都介于50%-60%之间，而加C18和PSA粉末净化时回收率都很低，回收率介于10%-50%之间。因此，本方法采用乙腈提取后直接上机检测。
二、浓缩与直接进样法进行比较
分别称取4份2g磨碎的红粮样品，编号为0，1，2，3。对3种真菌毒素进行低、中、高3个不同水平添加，不同组分每个浓度进行6 次水平测定。编号0作为空白对照，样品经直接提取和氮吹浓缩后，用QE液质联用仪进行检测分析，测定结果如表2所示。
表2 各真菌毒素在红粮基质中的回收率和精密度（n=6）
由表2可知，DON毒素经氮吹浓缩的回收率比直接提取进样的回收率要高，而ZEN毒素经直接提取进样比氮吹浓缩的回收率高，分别为92.33%、117.44%、89.18%，OTA毒素在直接提取进样回收率也较好，分别为87.97%、83.06%、77.89%。所以，本方法在样品前处理最后一步时可直接进样检测，不需要氮吹浓缩，可节约时间，提高效率。
三、流动相溶液的选择与优化
分别考察了两种常见流动相体系下目标化合物的分离情况。结果表明，在甲醇-水流动相体系下7种毒素化合物在色谱柱上均能实现基线分离，且峰形对称。由于乙腈的极性略弱于甲醇，且洗脱能力较强，故在分离极性较强的化合物时，化合物的流出时间与死体积极为接近，基质干扰较大，不利于准确定量分析；另一方面，基于溶解性的差异，部分毒素化合物在乙腈中分散的均匀程度较差，造成进样时重复性和灵敏度较差，故选用甲醇-水体系作为毒素化合物液质分析的流动相体系。
实验中7种毒素化合物均采用 ESI 模式电离，为提高化合物在离子源中的电离效率，通常向流动相中添加挥发性酸或缓冲盐体系。此外，少量有机酸的加入也可以起到改善峰型的作用。本实验分别考察并对比了甲醇-水体系、甲醇(0.1%甲酸)-水体系、甲醇-5mmol/L甲酸铵水体系，7种毒素化合物的质谱响应情况和峰形。实验结果表明，甲酸的加入会明显改善OTA的峰形，消除拖尾。但甲酸的加入会影响到 DON 和 PAT 的检测，甲酸铵的加入可以有效地改善OTA的峰型，且其余化合物均能实现基线分离，但过高的甲酸铵也会影响化合物的检测灵敏度。所以，最终采用甲醇-5 mmol /L甲酸铵水体系作为流动相， 以梯度洗脱方式依次将毒素化合物在色谱柱上实现基线分离。真菌毒素分离色谱图，见图1。
四、质谱条件的优化与选择
由于不同离子化模式下物质响应存在差异，实验采用正负全扫描来比较正负离子模式下真菌毒素的响应值，结果显示，正离子模式下其响应大于负离子模式，因此，选择正离子作为真菌毒素的离子化模式。经过优化，毒素化合物均以[M+H]+方式形成母离子，在二级扫描分析中我们选择离子丰度最高的子离子作为定量离子，选择丰度次高的子离子作为定性离子，尽量不选择质荷比在100以下的离子，以免流动相中的低分子量杂质对检测造成影响。每个母离子选取两个子离子用以对化合物进行准确定性定量分析，见表3。
表3 各真菌毒素的精确质量数
此外，为了进一步保证定量的准确性，采用碰撞后二级碎片离子进行进一步定性分析。在此过程中，碰撞能量太小，不能很好的进行分子碰撞，离子碎片丰度很低；碰撞能量太大，得到碎片离子太多，影响定量碎片离子的选择。实验通过逐级优化碰撞能量，在碰撞能量为50 eV时，母离子和碎片离子丰度比较稳定，见图2至图8，因此，选择50 eV作为检测各毒素的碰撞能量。
图2至图8为真菌毒素的二级离子色谱图产生的可能二级碎片结构式。从图中可看出二级碎片离子质谱峰与库中结构式匹配较高，进一步说明正离子模式条件下，能满足酿酒原辅料和白酒中毒素定性定量结果的准确性。
五、基质效应影响评价
（1）基质效应对真菌毒素质谱检测的影响
由于原辅料中成分较复杂，干扰物质较多，这些物质可能会影响真菌毒素的离子化效率，对定量结果有一定的影响。因此，对基体效应进行评价显得十分必要。
基体效应主要通过在空白加标样品基质溶液中的响应值和纯溶剂配制标准品的响应值比值来评价，如下公式：
ME > 100%，信号增强；ME = 100%，没有基体效应；ME < 100%，信号抑制。
实验选取了预先测定不含目标毒素的红粮样品作为基质空白，按前处理方法制作基质空白，向基质空白中加入50ppb毒素混标液，获取其质谱响应，如图9，并与相同浓度水平标准溶液（甲醇中加入50ppb）的质谱响应情况如图10进行对比。
图9、10所示，对于ZEN、OTA两种毒素基质响应值明显低于标准溶液响应值，有一定的基质抑制作用，而对DON毒素基质响应值稍高于标品响应值，有一定的增强作用。尽管如此，红粮中各毒素检测时定量离子与定性离子的离子比在基质曲线中和溶液标准曲线中是一致的，说明基质作用虽然会抑制或增强各物质的响应，但对离子比没有影响。因此，选用相应的基质添加曲线作为定量曲线可以提高定量分析的准确度。
（2）基质响应对加标回收的影响
根据QuEChERS法提制备玉米提取液，配置标曲浓度梯度，使得标准品处于和样品同样的基质中，以期减少基质效应。结果见表4。
表4玉米中5种黄曲霉毒素加标定量结果（玉米基质配制标品，单位：µg/kg）
表4可知，用玉米提取液配置的标准品制作标准曲线，定量加标结果，计算回收率。AFLB1、AFL B2、AFL G1、AFL G2、OTA的回收率最高分别为88.04%、88.86%、83.50%、90.17%、92.81%，回收率均在80%以上。对于黄曲霉毒素，加C18和PSA粉末净化能得到较高的回收率，OTA在不加净化剂时回收率最高，这与之上面的结论一致。因此，消除基质效应后，回收率均大幅提高。
六、方法性验证
根据欧盟标准指南，方法验证主要分析标准曲线的线性，方法的最低检测限，最低定量限，回收率（准确度）和重复性、重现性（精密度）。
（1）方法的线性响应与检出限
标曲的线性主要通过稀释空白基质真菌毒素标准溶液质至少6个浓度（浓度范围1.0-500ppb），采用外标法，根据峰面积和浓度的值制作标准曲线。由图5可知，标曲的线性关系较好，回归系数R2达0.999以上。
方法的最低检测限（LOD）和最低定量限（LOQ）分别根据3倍信噪比和10倍信噪比时标准浓度计算而得。根据表6、7结果可知，4种黄曲霉毒素、OTA和ZEN的最低检出限为0.003-0.025ppb，最低定量浓度为0.01-0.1ppb，DON的最低检出限和定量限分别介于0.3-0.8之间，远低于其在规定的最高限量。
（2）方法的准确度和精密度
添加回收实验用来考察该方法的准确度和精密度。在不含真菌毒素的红粮原料中，分别对真菌毒素进行低、中、高3个不同水平添加，不同组分每个浓度进行6 次水平测定。样品经直接提取进样后，用QE液质联用仪进行检测分析，测定结果如表5所示， 所有回收率介于70%-120%之间，精密度介于0.5%-4% 之间(n=6)，可以满足日常食品监测中真菌毒素分析的准确度与精密度要求。
表5 原料-方法的回收率和精密度（n=6）
选取不含真菌毒素的白酒，分别对真菌毒素进行低、中、高3个不同水平添加，不同组分每个浓度进行6 次水平测定，用来考察该方法的准确度和精密度。样品经直接提取进样后，用QE液质联用仪进行检测分析，测定结果如表6所示， 所有回收率介于90%-140%之间，精密度介于0.1%-2% 之间(n=6)，很好地满足白酒中真菌毒素分析的准确度与精密度要求。
表6 白酒-方法的回收率和精密度（n=6）
结论：本研究基于QuEChERS 原理的前处理技术，运用UHPLC-MS/MS建立了一种快速、灵敏检测原料及白酒中真菌毒素的方法。该方法采用四级杆和高分辨的orbitrap检测器，根据精确质量数和碎片离子，实现了真菌毒素的定性和定量分析。同时，通过线性、最低检出限、最低定量限和回收率等指标对方法进行了验证，得到了满意的准确性和精密度，可应用于原辅料和白酒中真菌毒素的日常监测，做好食品安全的风险防控。

Claims (2)

1.一种同时检测白酒原辅料中七种真菌毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）待测样品的制备：称取均质后的待测样品，80%乙腈水溶液萃取后过0.22μm微孔滤膜，待测；
2）真菌毒素混标制备：配制呕吐毒素、赭曲霉素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2七种毒素混标，先分别用纯甲醇溶解并定容至刻度，其中玉米赤霉烯酮浓度为50mg/L，其余浓度均为10mg/L，配制的标准储备溶液于-20℃下避光保存备用；
按步骤1）方法制成空白样品提取液，用空白样品提取液将标准储备溶液配成浓度1-500 ppb溶液范围内至少6个点的基质混合标准溶液，待测；
3）步骤1）样品和步骤2）标品分别采用高分辨Q-Exactive液质联用仪进行真菌毒素分离、检测，
色谱条件为：
色谱柱：HypersilGOLDC18色谱柱（100mm×2.1mm，3μm）；流动相：A：5mm甲酸铵水溶液，B：甲醇；流速：0.30mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；梯度洗脱程序：
时间（min） 0 0.5 5 7 9 A% 90 90 10 10 90 B% 10 10 90 90 10
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：Full-MS/t-MS2模式；鞘气压力：35arb；辅助气压力：10arb；毛细管电压：3.80kv（+），3.20kv（-）；毛细管温度：350℃；探针温度：300℃；分辨率：70，000；扫描范围：56-840m/z，Full-MS扫描模式；HCD碰撞能量：50eV；
4）通过ToxID软件中真菌毒素数据库的精确质量数和保留时间筛选混标中和样品中真菌毒素，然后对比样品与标品Full-MS模式检测的一级碎片离子定性以及t-MS2模式检测的二级碎片离子定性，得到色谱图后采用自动积分，通过拟合标准曲线计算得到测定液中待测组分的浓度为C，单位为µg/L，样品中真菌毒素定量按照公式进行计算:X=,其中X为样中待测组分的含量，单位mg/kg；C为测定液中待测组分的浓度，单位为µg/L；V为加入乙腈的体积，单位为ml；M为样品称样量，单位为g。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测白酒原辅料中七种真菌毒素的方法，其特征在于：步骤1）中准确称取均质后的待测样品2g入离心管中，加入体积比乙腈：水等于80：20的乙腈水20ml，超声提取10min后，再加入2g无水硫酸镁、0.5氯化钠，涡旋振荡3min，以9000r/min离心10min，取上层溶液，过0.22μm微孔滤膜，直接上机检测。
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