CN106645496A - 液质联用快速测定鱼肝脏中河鲀毒素含量的方法 - Google Patents

液质联用快速测定鱼肝脏中河鲀毒素含量的方法 Download PDF

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曹文卿
吴振兴
静平
王曼霞
许艳丽
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography

Abstract

本发明公开了一种液质联用快速测定鱼肝脏中河鲀毒素含量的方法，包括下列步骤：（一）样品预处理；（二）色谱‑质谱检测。本发明针对鱼肝脏样品中的基质效应问题，结合河鲀毒素的化学特点，在前处理时加入高岭土，并采用低温冷冻的方式，最大程度的将毒素分离出来。同时60℃酸解，细胞破碎仪超声提取，Carbon‑GCB SPE净化后，样品直接进样分析，处理过程简捷、低耗。方法准确，操作方便、重现性好，可满足目前对鱼肝中河鲀毒素快速检测的技术要求。

Description

液质联用快速测定鱼肝脏中河鲀毒素含量的方法
技术领域
本发明涉及一种液质联用快速测定鱼肝脏中河鲀毒素含量的方法，属于色谱检测技术领域。
背景技术
TTX(河鲀毒素)是发现最早而毒性极大的小分子海洋毒素，毒性为氰化钠的1000倍。毒性作用主要表现为选择性地阻遏神经和肌肉的钠离子通道，抑制钠离子通过神经细胞膜，先后麻痹感觉和运动神经，严重的脑干麻痹导致呼吸衰竭；中毒潜伏期短，致死率高达60％。TTX为无色棱柱状晶体，可溶于弱酸的水溶液。溶液pH值影响其稳定性，pH值<3和pH值>7时易分解；温度高于220℃时炭化。TTX的测定方法主要有酶联免疫法、生物检测法(小鼠法)、电化学法(毛细管电泳法)、色谱法(液相色谱、液相色谱-质谱、气相色谱-质谱联用)等。但小鼠法测定的准确度会因小鼠个体差异而变化；酶联免疫法成本较高，气相色谱-质谱与液相色谱-荧光法需将TTX经碱解衍生后再检测，衍生效率以及源自样品的荧光物质会干扰检测结果，且步骤复杂、费时。而液相色谱-质谱联用，前处理净化需达到质谱进样要求，提取溶液一般采用三氯乙酸、乙酸等水溶液，净化样品采用过C18小柱、离子交换柱等以及超滤等手段，但所得提取液仍因存在严重的基质效应而影响方法灵敏度。
发明内容
针对现有技术中的基质效应问题，本发明所要解决的技术问题是：提供一种液质联用快速测定鱼肝脏中河鲀毒素含量的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供的液质联用快速测定鱼肝脏中河鲀毒素含量的方法，包括下列步骤：
(一)样品预处理
(1)活河鲀鱼冷冻处死，去皮，取其肝脏部分经均质制样机充分粉碎，取其粉碎后肝脏样品50g，加入15-20g的高岭土，继续用均质制样机粉碎，均质粉碎10-15min，然后放入-40℃冰箱中冷冻1-2h；
冷冻结束后称取试样(1.00±0.01)g于50mL聚丙烯离心管中，准确加入5mL 30％乙醇水溶液和5mL 1.0％乙酸甲醇溶液，均质30-50s，细胞破碎仪在60℃超声提取25min，8000r/min离心5min，转移上清液至另一洁净离心管中；
残渣用3mL 30％乙醇水溶液和3mL 1％乙酸甲醇溶液重复提取1次，合并上清液并于4℃10 000r/min离心5min，取2.0mL上清液加入5.0mL正己烷，涡旋30s后4℃下10000r/min离心5min，弃正己烷层，重复脱脂1次，所得清液待净化；
(2)取1.0mL脱脂后的上清液过Carbon-GCB石墨化碳黑SPE固相萃取小柱，控制流速2mL/min，弃去流出液；再取1mL上清液以2mL/min流速通过小柱，流出液过0.22μm聚四氟乙烯-尼龙复合膜，收集于进样小瓶，供HPLC-MS/MS测定；
(二)色谱-质谱条件
色谱条件色谱柱：Zic-Hilic(100mm×2.1mm i.d.，3.5μm)；流动相A为0.1％甲酸水溶液(含5mmol/L甲酸铵)；流动相B为95％乙腈(含5mmol/L甲酸铵的0.1％甲酸水溶液)。洗脱程序为：0-5.3min，从20％线性递增到95％；5.3-7min， 从95％线性递减至20％；7.01-12min，平衡5min；进样量：10μL；流速0.35mL/min；柱温：30℃。
表1 TTX的液相色谱梯度洗脱条件
时间(min) 流速(μL/min) A相(％) B相(％)
0.0 350 20 80
5.3 350 95 5
7.0 350 95 5
7.01 350 20 80
12.0 350 20 80
质谱条件离子源及扫描方式：ESI+；检测模式：MRM；碰撞气流量：12L/min；气帘气流量：10L/min；TTX的质谱定性、定量离子对分别为320.2/162.1和320.2/302.2，相应碰撞能分别为32V和47V；质谱峰保留时间在6.32附近，驻留时间和电喷雾电压分别为200ms和5000V，离子源温度为600℃，各质谱参数见表2。
表2 TTX保留时间、定性定量离子对、去簇电压和碰撞能量
*定量离子对。
本发明的有益效果：
本发明针对鱼肝脏样品中的基质效应问题，结合河鲀毒素的化学特点，在前处理时加入高岭土，并采用低温冷冻的方式，最大程度的将毒素分离出来。同时60℃酸解，细胞破碎仪超声提取，Carbon-GCB SPE净化后，样品直接进样分析，处理过程简捷、低耗。方法准确，操作方便、重现性好，可满足目前对鱼肝中河鲀毒素快速检测的技术要求。
本发明中样品经1％乙酸甲醇在60℃下细胞破碎仪超声提取，Carbon-GCB SPE小柱净化后，直接进样分析，节省了浓缩时间。与现有技术中0.2％乙酸水溶液提取、其它SPE净化以及超滤等方法相比，该方法操作简单、准确度高、成本低、省时高效，改进了基质效应问题，且具有灵敏度高、重现性好、结果可靠的优点，满足目前快速检测河鲀鱼肝中TTX含量的技术要求。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1是阳性河鲀鱼肝脏样品中TTX总离子流图。
图2是空白红鳍东方鲀肝脏样品的总离子流图。
图3是加标10μg/kg红鳍东方鲀肝脏样品的总离子流图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供的液质联用快速测定鱼肝脏中河鲀毒素含量的方法，包括下列步骤：
(一)样品预处理
(1)活河鲀鱼冷冻处死，去皮，取其肝脏部分经均质制样机充分粉碎，取其粉碎后肝脏样品50g，加入15-20g的高岭土，继续用均质制样机粉碎，均质粉碎10-15min，然后放入-40℃冰箱中冷冻1-2h；
冷冻结束后称取试样(1.00±0.01)g于50mL聚丙烯离心管中，准确加入5mL 30％乙醇水溶液和5mL 1.0％乙酸甲醇溶液，均质30-50s，细胞破碎仪在60℃超声提取25min，8000r/min离心5min，转移上清液至另一洁净离心管中；
残渣用3mL 30％乙醇水溶液和3mL 1％乙酸甲醇溶液重复提取1次，合并上清液并于4℃10 000r/min离心5min，取2.0mL上清液加入5.0mL正己烷，涡旋30s后4℃下10000r/min离心5min，弃正己烷层，重复脱脂1次，所得清液待净化；
(2)取1.0mL脱脂后的上清液过Carbon-GCB石墨化碳黑SPE固相萃取小柱，控制流速2mL/min，弃去流出液；再取1mL上清液以2mL/min流速通过小柱，流出液过0.22μm聚四氟乙烯-尼龙复合膜，收集于进样小瓶，供HPLC-MS/MS测定；
(二)色谱-质谱条件
色谱条件色谱柱：Zic-Hilic(100mm×2.1mm i.d.，3.5μm)；流动相A为0.1％甲酸水溶液(含5mmol/L甲酸铵)；流动相B为95％乙腈(含5mmol/L甲酸铵的0.1％甲酸水溶液)。洗脱程序为：0-5.3min，从20％线性递增到95％；5.3-7min， 从95％线性递减至20％；7.01-12min，平衡5min；进样量：10μL；流速0.35mL/min；柱温：30℃。
表1 TTX的液相色谱梯度洗脱条件
时间(min) 流速(μL/min) A相(％) B相(％)
0.0 350 20 80
5.3 350 95 5
7.0 350 95 5
7.01 350 20 80
12.0 350 20 80
质谱条件离子源及扫描方式：ESI+；检测模式：MRM；碰撞气流量：12L/min；气帘气流量：10L/min；TTX的质谱定性、定量离子对分别为320.2/162.1和320.2/302.2，相应碰撞能分别为32V和47V；质谱峰保留时间在6.32min附近，驻留时间和电喷雾电压分别为200ms和5000V，离子源温度为600℃，各质谱参数见表2。
表2 TTX保留时间、定性定量离子对、去簇电压和碰撞能量
*定量离子对。
如图1，是阳性河鲀鱼肝脏样品中TTX总离子流图。
实施例2线性范围与检出限
称取试样(1.00±0.01)g于50mL聚丙烯离心管中，加入适量河鲀毒素标准溶液，加标水平分别为0、10、20、50、100、200μg/kg，放置0.5h后按照实施例1方法，得到0、10、20、50、100、200μg/kg的基质加标溶液；以TTX标准物质的峰面积为纵坐标，基质加标溶液浓度(μg/kg)为横坐标，绘出标准曲线，外标法定量。结果显示，TTX在10～200μg/kg范围内呈良好线性，回归方程为Y＝2.34e+003X，r2＝0.9994。
等量称取河鲀鱼肝脏样品(1.00±0.01)g，加适量标准溶液，使TTX的浓度水平为5.0、10、20、30μg/kg，每水平3个平行样，按实施例1方法进行HPLC-MS/MS分析。结果表明，添加水平为5.0μg/kg时提取液中TTX的定量离子信噪比均大于3；添加水平为10.0μg/kg时，TTX定量离子的S/N均大于10。以目标化合物的响应值信噪比≥3时对应的浓度作检出限，信噪比大于10作定量下限，得到本方法中河鲀毒素的检出限和定量下限分别为5.0μg/kg和10.0μg/kg。
图2-3为红鳍东方鲀肝空白基质及加标样品谱图。
实施例3
回收率与精密度
称取经测定不含TTX的养殖阴性红鳍东方鲀肝脏样品(1.00±0.01)g于50mL聚丙烯离心管，分成3组，每组6个，加适量标准溶液，使样品中TTX的浓度分别为10、15、30、50、100、200μg/kg，按实施例1方法用HPLC-MS/MS分析。基质加标校准曲线外标法定量，回收率与精密度数据见表3。用空白基质作回收率实验，结果如下：
表3回收率与精密度数据
添加水平/(μg.kg-1) 回收率％
10 88.6-93.6
15 90.6-96.3
30 95.8-98.3
50 95.2-99.5
100 97.6-102.3
200 98.3-103.8
实施例4
实际样品的检测
应用本方法对20份河鲀鱼肝脏样品进行检测，检出阳性样品6份，其TTX含量在41.5～520.7μg/kg之间。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (1)

1.液质联用快速测定鱼肝脏中河鲀毒素含量的方法，其特征在于，包括下列步骤：
(一)样品预处理
(1)活河鲀鱼冷冻处死，去皮，取其肝脏部分经均质制样机充分粉碎，取其粉碎后肝脏样品50g，加入15-20g的高岭土，继续用均质制样机粉碎，均质粉碎10-15min，然后放入-40℃冰箱中冷冻1-2h；
冷冻结束后称取试样(1.00±0.01)g于50mL聚丙烯离心管中，准确加入5mL 30％乙醇水溶液和5mL 1.0％乙酸甲醇溶液，均质30-50s，细胞破碎仪在50℃超声提取25min，8000r/min离心5min，转移上清液至另一洁净离心管中；
残渣用3mL 30％乙醇水溶液和3mL 1％乙酸甲醇溶液重复提取1次，合并上清液并于4℃10000r/min离心5min，取2.0mL上清液加入5.0mL正己烷，涡旋30s后4℃下10000r/min离心5min，弃正己烷层，重复脱脂1次，所得清液待净化；
(2)取1.0mL脱脂后的上清液过Carbon-GCB石墨化碳黑SPE固相萃取小柱，控制流速2mL/min，弃去流出液；再取1mL上清液以2mL/min流速通过小柱，流出液过0.22μm聚四氟乙烯-尼龙复合膜，收集于进样小瓶，供HPLC-MS/MS测定；
(二)色谱-质谱条件
色谱条件色谱柱：Zic-Hilic(100mm×2.1mm i.d.，3.5μm)；流动相A为0.1％甲酸水溶液(含5mmol/L甲酸铵)；流动相B为95％乙腈(含5mmol/L甲酸铵的0.1％甲酸水溶液)。洗脱程序为：0-5.3min，从20％线性递增到95％；5.3-7min，＝95％；7-7.01min从95％线性递减至20％；7.01-12min，＝20％；平衡5min；进样量：10μL；流速0.35mL/min；柱温：30℃；
表1 TTX的液相色谱梯度洗脱条件
时间(min) 流速(μL/min) A相(％) B相(％) 0·0 350 20 80 5·3 350 95 5 7·0 350 95 5 7·01 350 20 80 12·0 350 20 80
质谱条件离子源及扫描方式：ESI+；检测模式：MRM；碰撞气流量：12L/min；气帘气流量：10L/min；TTX的质谱定性、定量离子对分别为320.2/162.1和320.2/302.2，相应碰撞能分别为32V和47V；质谱峰保留时间在6.32附近，驻留时间和电喷雾电压分别为200ms和5000V，离子源温度为600℃，各质谱参数见表2；
表2 TTX保留时间、定性定量离子对、去簇电压和碰撞能量
*定量离子对。
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