CN113419015A - 一种基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法及用途 - Google Patents

一种基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法及用途 Download PDF

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徐敦明
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薛永霞
程睿
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Abstract

本发明涉及一种基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品的制备方法及用途，河豚毒素标准样品的制备方法包括：(1)均质匀浆；(2)预冷冻；(3)预真空冷冻干燥：在真空条件下，将预冷冻样品进行冷冻干燥，得到粘稠状样品；(4)脱脂：加入正己烷，在通风条件下不断搅拌样品，正己烷作为溶剂对样品进行脱脂，得到脱脂后的样品；(5)再次均质匀浆；(6)再次真空冷冻干燥：在真空条件下，将脱脂匀浆样品进行冷冻干燥，得到松散状的冻干粗粉；(7)研磨、过筛，得到冻干细粉，作为河豚毒素标准样品。所述河豚毒素标准样品具有更好的均匀性和稳定性，有利于水产品及食品中河豚毒素的检测和质量控制、能力验证评价工作的开展，具有积极的现实意义。

Description

一种基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法及 用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法及用途。
背景技术
在很长一段时间内，人们认为河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是河鲀鱼特有的一种毒性物质，因此人们用河鲀鱼的名字来命名该活性物质。直到1964年，人们从加利福尼亚的一种蝾螈体内检测到河豚毒素，才改变了这种说法。在后来的研究中发现，TTX广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物体内，除常见的河鲀鱼之外，在扁形虫、纽形虫、软体动物、节肢动物、毛颚类动物、棘皮动物、尾索动物和两栖动物中的某些生物中也有分布(Noguchi etal.,1984；Miyazawa et al.,1986,1987；Thuesen et al.,1988；Freitas et al.,1996；Tsai et al.,1997；Lin et al.,2000；Pires et al.,2002；Asakawa et al.,2003)。在软体动物中，含有河豚毒素的生物主要属于腹足纲，如织纹螺科、骨螺科、蛙螺科、玉螺科、法螺科和峨螺科中的部分生物，能够产生或者积累TTX造成食用者中毒。由腹足纲软体动物引起的中毒事件在日本和中国台湾均有报道(Narita et al.,1981；Hwang et al.,1995)。TTX是一种非蛋白质、高活性的神经毒素，进入人体后可使神经中枢和血管神经中枢出现麻痹，危及生命。鉴于TTX的毒性强，染毒生物的种类多，地理分布范围广，加强这方面的研究工作，避免人误食中毒事件的发生具有重要意义。
在食品安全检测体系中，标准样品对整个检测质量控制体系起到核心作用。在国际上，一种毒素残留量的分析方法的建立需要经3种类型的样品测试：受控组织或液体、用药物强化至或接近最大容许水平(MRL)的样品和本身具有毒素残留的组织基料样品，从而保证分析方法能具有一定的样品基质适用范围和重复性。欧盟对兽药等残留分析方法与结果表达的法规(2002/657/EC)中明确指出了需要采用组织基料实物标准样品进行检测过程控制，可见组织基料实物标准样品在残留检测中具有十分重要的意义。
目前用于河豚毒素残留检测的标准品主要是纯品河豚毒素标准样品，检测质量控制主要是通过向样品中添加纯的河豚毒素标准品后进行检测分析，这种分析方法无法代表目标分析物在活体内真正存在的状态，不能真实地重现毒素经过自然代谢后在动物体内的提取效率，无法反映水产品及食品基质样品中河豚毒素检测方法的准确性。由于目标物和基体结合情形与真实检测样品不完全一致而导致提取、净化等处理结果与日常分析样本存在较大差异，从而影响结果的可靠性和有效性。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有的河豚毒素检测中存在的不足，提供一种基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法，利用正己烷脱脂分离处理后，采用两次冷冻干燥程序制备的基于河鲀鱼基料天然河豚毒素标准样品，不仅可以真实地重现毒素经过自然代谢后在动物体内的情况，而且样品在长达一年的时间内基本不会出现河豚毒素降解或者标准样品变质，极大方便了研究人员的工作。
本发明研制以河鲀鱼肝脏、卵巢和肌肉组织为基料的天然河豚毒素定量分析用标准样品，应用于水产品及食品中河豚毒素的检测和质量控制、能力验证评价等工作，为实验室检测质量控制提供技术保障。
目前市场上河豚毒素标准品的纯度水平参差不齐，很多河豚毒素产品的纯度偏低，并未达到其标示值，为了保证测量结果的可溯源性以及量值的准确可靠，开展河豚毒素标准样品的研制显得尤为迫切。现有河豚毒素标准样品制备方法主要有两种方式：一是以河鲀鱼组织为原料，以化学方法提取制备脱水河豚毒素，采用色谱分离、浓缩、结晶、干燥等精制方法制备获得纯品河豚毒素，此方法制备的标准品纯度较高，但同样无法代表目标分析物在活体内真正存在的状态。二是还有采用河鲀鱼肌肉组织，通过添加阳性标准品稀释制备河豚毒素阳性质控样品，因肌肉组织含有河豚毒素含量较低或不含有河豚毒素，采用添加方式制备标准样品容易引进样品不均匀性的误差，且不能真实地重现毒素在动物体内自然代谢后的提取效率等问题。
天然河豚毒素在河鲀鱼等生物体内的积累和分布因不同季节、个体种类、组织器官、毒素代谢阶段等的不同而存在差异。特别是天然河豚毒素主要蓄积在河鲀鱼卵巢、脾脏和肝脏，紧密地与受体部位结合并自然代谢。然而这些受体部位脂肪含量高，基质复杂，毒素含量不均，不易制备成干燥、松散的标准样品基料，进而会影响到标准样品的稳定性和均匀性。因此，采用天然鱼基料成功制备标准样品难度高，存在样品保存时间短、样品的准确性、稳定性差等多方面的问题。
为解决上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明采用河豚毒素含量高的肝脏、卵巢和肌肉组织直接制备一种基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品，本发明所述的天然河豚毒素标准样品的制备方法选取野生河鲀鱼，并选择河鲀鱼的肝脏、卵巢和肌肉作为基料制备标准样品。因此本发明的标准样品基料全部来自于河鲀鱼，无任何添加物，避免了不能真实地重现毒素经过自然代谢后在动物体内的提取效率，更好的保留基料中的原有成分，提高了水产品及食品中河豚毒素检测的准确性。
本发明更优选的是，由于肝脏、卵巢组织中的河豚毒素含量极高，肌肉组织河豚毒素含量极低或者无毒素，优选地，本发明的河鲀鱼基料的河豚毒素定量分析标准样品含有肝脏、卵巢组织基料和肌肉组织基料的混合基料制备成的冻干粉，进一步优选的，所述混合基料以适宜质量比的形式进行取料配制，具体配比以冰鲜肝脏卵巢占总基料质量比与冻干粉样品中河豚毒素预期含量占冰鲜河鲀鱼基料中河豚毒素总含量比的线性关系来预估冻干粉样品中河豚毒素预期含量。
第二方面，本发明提供了一种以野生河鲀鱼肝脏、卵巢和肌肉组织为基料的天然河豚毒素标准样品制备过程中的脱脂处理方法。针对肝脏和卵巢组织脂肪含量高，难以真空冷冻干燥制成松散状干粉的难题，本发明采用正己烷脱脂的方法，成功制备具有均匀性的标准样品。
在研究中，本申请的发明人发现，肝脏和卵巢样品中脂肪含量特别高，按照常规制备方法难以通过冷冻干燥制备成均匀的松散状干粉标准样品。基于上述原因，本申请的制备方法是在制备流程中增加了一种脱脂处理步骤进行制备优化调整得到的，其更适合于以野生河鲀鱼肝脏、卵巢组织为主要基料的标准样品制备；并通过标准样品均匀性检验评价做比较发现，只有通过脱脂处理才能达到符合标准样品均匀性、稳定性的评价指标。
优选地，本发明的脱脂处理效果以脱脂时间和溶剂用量的优化结果，确定经预真空冷冻干燥后的粘稠状河鲀鱼基料与正己烷溶剂的用量比例为1:10，脱脂用时间1h最短，标准样品制备脱脂效果最佳。
第三方面，本发明提供了一种河鲀鱼肝脏、卵巢和肌肉组织基料均质匀浆后，一种预真空冷冻干燥—脱脂—再次真空冷冻干燥制备含脂肪含量高的生物体标准样品的冷冻干燥程序，一种适用于河鲀鱼肝脏、卵巢和肌肉组织基料均质匀浆脱脂后的两次冷冻干燥程序，成功制备以河鲀鱼肝脏、卵巢和肌肉为基料的天然河豚毒素生物体标准样品。
优选地，本发明的真空冷冻干燥程序对匀浆基料预真空冷冻干燥—脱脂—再次真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥程序为：物料厚度2cm，-50℃预冷冻6h，0.1mbar真空冷冻10h，-10℃～30℃快速升温干燥8h以上；使用上述真空冷冻干燥程序制备标准样品时，样品呈现松散粉状的最佳冻干效果，且所用物料最多、时间最短，且在常温下长时间保存，也能很好的保持其性能。
本申请发明人意外发现，在本发明的制备方法中，因肝脏和卵巢组织中脂肪含量特别高，在制备流程中增加了上述正己烷溶剂脱脂处理能够显著保证经真空冷冻干燥制备出松散状冻干粉，适合于以野生河鲀鱼肝脏、卵巢组织为主要基料的冻干粉标准样品制备，不仅使其在常温下具备良好的稳定性，在长达一年的时间内基本不会出现河豚毒素降解或者标准样品变质；同时，河鲀鱼基料标准样品均匀性方面也显著优于未经脱脂处理情况；而未经正己烷溶剂脱脂处理时基本无法获得松散状的冻干粉，均匀性无法保障。
具体方案如下：
一种基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法，包括以下步骤：
(1)均质匀浆：取河鲀的肝脏、卵巢和肌肉组织，进行均质粉碎、匀浆，得到匀浆样品；
(2)预冷冻：取上步得到的所述匀浆样品，冷冻处理得到预冷冻样品；
(3)预真空冷冻干燥：在真空条件下，将上步得到的所述预冷冻样品进行冷冻干燥，得到粘稠状样品；
(4)脱脂：取上步得到的所述粘稠状样品，加入正己烷，在通风条件下不断搅拌样品，正己烷作为溶剂对样品进行脱脂，得到脱脂后的样品；
(5)再次均质匀浆：取上步得到的所述脱脂后的样品，再次进行均质粉碎、匀浆，得到脱脂匀浆样品；
(6)再次真空冷冻干燥：在真空条件下，将上步得到的所述脱脂匀浆样品进行冷冻干燥，得到松散状的冻干粗粉；
(7)研磨、过筛：取上步得到的所述冻干粗粉，进行粉碎，细磨，过筛，得到冻干细粉，作为河豚毒素标准样品。
进一步的，步骤(2)中，所述冷冻处理是置于-75～-85℃预冷冻1～3h；优选置于-80℃预冷冻2h。
进一步的，步骤(3)中，在0.05-～0.2mbar真空条件下，先进行初步冷冻干燥，将所述预冷冻样品制成物料厚度为1～3cm的样品，在-45～-55℃预冷冻5～8h；然后在-45～-55℃冷冻8～12h；最后在-10℃～30℃快速升温干燥8h以上，快速升温的速率为≥1.0℃/min，得到粘稠状样品；优选地，采用真空冷冻干燥机进行初步冷冻干燥，物料厚度2cm，先-50℃预冷冻6h，然后0.1mbar真空冷冻10h，最后-10℃～30℃快速升温干燥8h以上，快速升温的速率≥1.0℃/min。
进一步的，步骤(4)中，所述粘稠状样品与正己烷的体积比为1:10～1:12，优选为1:10，在通风条件下不断搅拌样品1～2h，弃上清液，取沉淀物，为所述脱脂后的样品。
进一步的，步骤(6)中，在0.05～0.2mbar真空条件下处理上步得到的所述脱脂匀浆样品，将所述脱脂匀浆样品制成物料厚度为1～3cm的样品，在-45～-55℃预冷冻5～8h；然后在-10℃～30℃快速升温干燥8h以上，快速升温的速率为≥1.0℃/min，直至完全干燥，得到松散状的冻干粗粉；优选地，采用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，物料厚度2cm，-50℃预冷冻6h，0.1mbar真空冷冻10h，-10℃～30℃快速升温干燥8h以上，快速升温的速率为≥1.0℃/min，直至完全干燥，得到松散状的冻干粗粉。
进一步的，步骤(7)中，所述冻干细粉的颗粒大小在30-80目之间。
本发明还保护一种河豚毒素标准样品，运用所述基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法，制备得到。
进一步的，所述河豚毒素标准样品为冻干细粉，粒度在30-80目之间；河豚毒素含量值为5.20±0.03mg/kg。
进一步的，所述河豚毒素标准样品经F检验，均匀性F比为1.4-1.5，样品不均匀性标准不确定度为0.013-0.014％；稳定性F比为2.1-2.2，样品不稳定标准差为0.006-0.007％；优选地，所述河豚毒素标准样品经F检验，均匀性F比为1.47，样品不均匀性标准不确定度为0.0136％；稳定性F比为2.15，样品不稳定标准差为0.0068％。
本发明还保护所述河豚毒素标准样品在河豚毒素检测上的用途。
有益效果：
本发明制备的基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素定量分析标准样品能真实地重现毒素经过自然代谢后在动物体内的提取效率，更好的保留基料中的原有成分，提高了水产品及食品中河豚毒素检测的准确性；提供的采用正己烷脱脂的制备方法克服了肝脏、卵巢组织脂肪含量高，难以真空冷冻干燥制成松散状干粉的技术难题，所制备的河鲀鱼基料标准样品具有更好的均匀性和稳定性，能更客观地用于水产品及食品中河豚毒素的检测和质量控制、能力验证评价工作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。
图1是本发明一个实施例提供的野生河鲀鱼去头、去皮、去骨处理以及取肝脏、卵巢和肌肉组织的实物图；
图2是本发明一个实施例提供的标准样品中河豚毒素含量比与基料质量比的线性关系图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。
实施例1基于河鲀鱼肝脏主基料的标准样品制备方法
1.标准样品制备方法
1.1河鲀鱼基料的选择
从红鳍东方鲀养殖基地外围海域采捕野生河鲀鱼，要求个体大小均一、均重约1.5kg，剔除受伤不健康的野生河鲀鱼。将野生河鲀鱼去头、去皮、去骨处理，取肝脏、卵巢和肌肉组织备用(参见图1)，用于制备河鲀鱼基料标准样品。
1.2河鲀鱼基料标准样品制备程序
具体制备程序如下：
(1)均质匀浆：取肝脏、卵巢和肌肉组织，采用均质粉碎机进行均质粉碎、匀浆。
(2)预冷冻：取匀浆样品置于-80℃预冷冻2h。
(3)预真空冷冻干燥：采用真空冷冻干燥机(CHRiST Epsilon 2-6D)进行初步冷冻干燥，物料厚度2cm，-50℃预冷冻6h，0.1mbar真空冷冻10h，-10℃～30℃快速升温干燥8h以上，观察目标样品。由于脂肪含量较多，目标样品呈现粘稠状，无法充分冷冻干燥。
(4)脱脂：取经真空冷冻预干燥的粘稠状样品，按照1:10体积比例加入正己烷，充分浸泡，于通风橱中不间断搅拌，脱脂1h，弃上清液，取沉淀物。
(5)再次均质匀浆：脱脂后的沉淀物样品再次用均质粉碎机进行均质粉碎、匀浆。
(6)再次真空冷冻干燥：采用真空冷冻干燥机(CHRiST Epsilon 2-6D)进行冷冻干燥，物料厚度2cm，-50℃预冷冻6h，0.1mbar真空冷冻10h，-10℃～30℃快速升温干燥8h以上，直至完全干燥，得到松散状的冻干粗粉。
(7)研磨、过筛：取冻干粗粉采用中药粉粉碎机粉碎，组织研磨机细磨，过30目筛，取筛下部分再过80目筛，弃筛下部分，即样品颗粒大小在30-80目之间的冻干细粉。
(8)分装及保存：用带有铝箔垫片的白色聚乙烯塑料瓶分装，每瓶装2g冻干细粉，电磁感应封盖，2-8℃冷藏保存。
(9)均匀性检验和稳定性检验评价。
(10)协同定值。
1.3以未经脱脂处理进行冻干的样品作为对照样品
采用1.2中未经脱脂处理进行冻干的样品，即：均质匀浆、预冷冻、预真空冷冻干燥、再次均质匀浆、再次真空冷冻干燥、研磨、过筛、分装及保存，来验证样品的均匀性检查性能。
2.脱脂时间和溶剂用量的优化及结果
2.1试验方法
为确定脱脂的最佳时间和溶剂用量，分别对粘稠状河鲀鱼基料样品与正己烷溶剂的不同用量比例(1:1、1:4、1:7、1:10、1:13、1:16)，以脱脂时间从1h至5h以1h为间距递增，摸索最佳时间和溶剂用量。利用Taguchi法探究摸索最佳脱脂时间和溶剂用量比例组合。
2.1脱脂时间和溶剂用量的优化结果
分别对不同溶剂用量的脱脂时间进行比较，结果发现低于1:10的用量比例，即便是脱脂时间再长，基料样品仍呈现不同程度的粘稠状，达不到最佳的脱脂松散状效果，因而确定粘稠状河鲀鱼基料样品与正己烷溶剂的用量比例为1:10，脱脂用时间1h最短，按照1.2标准样品制备程序脱脂效果最佳。
3.真空冷冻干燥程序的优化试验及结果
3.1试验方法
为确定真空冷冻干燥的最佳程序，将脱脂后粘稠状河鲀鱼基料样品从物料厚度1cm至4cm以1cm为间距递增；-50℃预冷冻从2h至8h以2h为间距递增；0.1mbar真空冷冻从6h至12h以2h为间距递增；-10℃～30℃快速升温干燥从4h至12h以2h为间距递增。利用Taguchi法探究摸索最佳真空冷冻干燥参数组合。
3.2真空冷冻干燥程序的优化结果
分别对不同的真空冷冻干燥物料厚度、冷冻干燥时间进行比较，通过Taguchi方法进行试验设计，根据所获得的最佳参数范围进一步进行优化，从多次重复试验中发现：物料厚度为2cm，-50℃预冷冻6h，0.1mbar真空冷冻10h，-10℃～30℃快速升温干燥8h时基料样品呈现松散粉状的最佳冻干效果，且所用时间最短、物料最多，所以选择物料最佳厚度为2cm浓度、-50℃预冷冻最佳时间为6h、0.1mbar真空冷冻最佳时间为10h、-10℃～30℃快速升温干燥最佳时间为8h以上。
最后，采用上述优化结果按照1.2河鲀鱼基料标准样品制备程序，制备冻干细粉备用。
实施例2河鲀鱼肝脏、卵巢和肌肉基料比例及标准样品中河豚毒素含量分析
1.水产品及食品中河豚毒素含量分析方法
1.1提取
称取5.00g匀浆样品(指待测的水产品或食品样品)置于50mL聚丙烯离心管中，加入20mLI％乙酸甲醇溶液，旋涡振荡2min，50℃水浴超声提取20min，4000r/min离心5min，取上清液，在残渣中再加入20mL 1％乙酸溶液洗脱，合并流出液，与洗脱液置于25mL浓缩瓶中，于60℃下减压浓缩至近干，用l％乙酸溶液定容1mL，过0.2μm滤膜，供液相色谱分析。进行液相色谱-串联质谱确证时，将样液装入离心超滤管中，13000r/min离心15min，取滤液测定。
1.2空白基质溶液的制备
称取阴性样品5.00g(指不含河豚毒素的水产品或食品样品)，按1.1操作。
1.3测定条件
液相色谱参考条件：
a)色谱柱：Purospher Star PR-18e Cl8柱，5μm，250mm X 4.6mm(内径)或相当者；
b)柱温：30℃；
c)流动相：乙腈一乙酸铵缓冲液(4.9)(1+19)；
d)流速：1.0mL/min；
e)激发波长：385nm，发射波长：505nm；
f)进样量：40.0μL。
柱后衍生参考条件：
a)衍生溶液：4mol/L氢氧化钠溶液；
b)衍生溶液流速：0.5mL/min；
c)衍生管温度：110℃。
色谱测定：根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和待测样液中河豚毒素的响应值应在仪器线性响应范围内。标准工作液与待测样液等体积进样。在上述色谱条件下，河豚毒素的参考保留时间为10.3min，根据标准溶液色谱峰的保留时间和峰面积，对样液的色谱峰进行定性并外标法定量。
1.4确证
液相色谱一串联质谱条件：
a)色谱柱：Atlantis TM HILIC Silica，3μm，150mm X 2.1mm(内径)或相当者；
b)流动相：乙腈+0.1％甲酸溶液(17+8)；
c)柱温：30℃:；
d)进样量：10μL；
e)流速：200μL/min；
f)离子源：电喷雾源ESI，正离子模式；
g)扫描方式：多反应监测(MRM)；
h)离子源温度：500℃；
i)雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；
j)仪器工作所需电压值应优化至最优灵敏度；
k)定性离子对、定量离子对、碰撞池出口电压和碰撞气能量见表1。
表1 定性离子对、定量离子对、碰撞池出口电压和碰撞气能
Figure BDA0003179865630000091
液相色谱一串联质谱确证：
将基质标准工作液和所得滤液(必要时用乙睛稀释至适当浓度)用LC-MS/MS测定。如果样液中与标准工作液相同的保留时间有检测离子峰出现，则对其进行质谱确证。
定性标准：
保留时间：待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在±2.5之内。
信噪比：待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3(S/N≥3)。
定量离子、定性离子及子离子丰度比：每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围。
表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差％
Figure BDA0003179865630000092
1.5平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。
1.6回收率试验
在阴性样品中添加适量标准溶液，测定后计算样品添加的回收率。
1.7结果计算
用数据处理软件中外标法，或绘制标准曲线，按如下公式计算试样中河豚毒素含量：
Figure BDA0003179865630000101
式中：
X—试样中河豚毒素含量的数值，单位为微克每千克(μg/kg)；
c—由标准曲线而得的样液中河豚毒素含量的数值，单位为微克每升(μg/L)；
c0—由标准曲线而得的空白实验中河豚毒素含量的数值，单位为微克每升(μg/L)；
V—样品最终定容体积，单位为毫升(mL)；
m—最终样液代表的试样量，单位为克(g)。
计算结果应扣除空白值。
注：上述水产品及食品中河豚毒素含量分析方法都是报道的常用方法。
2.河鲀鱼肝脏、卵巢和肌肉组织基料中河豚毒素含量分析及配料比例试验
2.1不同基料中河豚毒素含量分析
使用上述1分析方法，分别检测肝脏、卵巢匀浆组织基料和肌肉匀浆组织基料中的河豚毒素含量，根据不同基料的河豚毒素含量以确定不同基料配料比例。结果如表3所示。经检测分析可知，冰鲜状态的肝脏、卵巢匀浆组织基料中河豚毒素含量为27.91mg/kg(以鲜品计)，而冰鲜状态的肌肉匀浆组织基料中河豚毒素含量为1.75mg/kg(以鲜品计)。
2.2基料配料质量比与冻干粉中河豚毒素含量的关系
表3 干品与鲜品基料中河豚毒素含量关系
Figure BDA0003179865630000102
取河豚毒素含量为27.91mg/kg(以鲜品计)的冰鲜肝脏卵巢基料，以及河豚毒素含量为1.75mg/kg(以鲜品计)的冰鲜肌肉基料，分别按照冰鲜肝脏卵巢基料占冰鲜总基料的不同质量百分比(50％、40％、30％、20％、10％)进行配料，按照河鲀鱼基料中天然河豚毒素定量分析标准样品制备工艺流程，制成冻干粉样品，使用上述1中的分析方法检测冻干粉样品中河豚毒素含量(以干品计)，计算冻干粉中河豚毒素含量与冰鲜基料中河豚毒素含量之间的关系，为预估冻干粉标准样品中河豚毒素含量的预期值提供基料最佳配比的参考依据。结果如表3所示。经分析可知，制成的冻干粉样品中河豚毒素含量比(干品计/鲜品计)与冰鲜肝脏卵巢占总基料质量比(以鲜品计)的线性关系如图2所示，其拟合度R2＝0.9993，具有很好的相关性。国际通用的河鲀产品的河豚毒素含量食用安全限量为不得超过2.2mg/kg(以鲜品计)，且河鲀鱼中河豚毒素主要集中在肝脏和卵巢，而肌肉中含量微乎甚微，因此，本发明中冰鲜肌肉基料中的河豚毒素含量为1.75mg/kg(以鲜品计)，在做基料最佳配比时，可以忽略其含量，而以冰鲜肝脏卵巢占总基料质量比与冰鲜河鲀鱼基料中河豚毒素含量的线性关系来预估冻干粉样品中河豚毒素预期值。由此可知，根据冰鲜肝脏卵巢基料占冰鲜总基料的配料质量比(％)，就可依据冰鲜肝脏卵巢基料中河豚毒素含量来预估算制成后的冻干粉标准样品中河豚毒素含量预期值，为制备预期的河豚鱼基料中天然河豚毒素定量分析标准样品的河豚毒素含量预期值提供参考。
实施例3河鲀鱼基料标准样品的均匀性检验评价
制备的标准样品需要检验其均匀性，本检验利用方差分析法，采用F检验，将均匀性方差分析结果(Sbb)与该特性值不确定度的预期目标进行比较，若不显著，则标准样品视为均匀。
抽取数按
Figure BDA0003179865630000111
个(N为总单元数)计算。本项目中最小包装总单元数约180瓶。
抽取i个样品(i＝1、2、3、…m)，每个样品在重复条件下测试j次(j＝1、2、3、…n)。
每个样品的测试平均值
Figure BDA0003179865630000112
全部样品测试的总平均值
Figure BDA0003179865630000113
测试总次数
Figure BDA0003179865630000114
样品间平方和
Figure BDA0003179865630000121
均方
Figure BDA0003179865630000122
样品内平方和
Figure BDA0003179865630000123
均方
Figure BDA0003179865630000124
自由度f1＝m-1
f2＝N-m
统计量F＝MS1/MS2
样品间的不均匀性标准偏差
Figure BDA0003179865630000125
若F<自由度为(f1，f2)及给定显著性水平a(通常a＝0.05)的临界值Fa(f1，f2)，则表明样品内和样品间无显著性差异，样品是均匀的。
对实施例1中制备的最终样品，随机抽取15个样品进行均匀性检查。并以未经脱脂处理进行冻干的样品作为对照，验证所述脱脂处理情况下的样品均匀性检查性能。这里未经脱脂处理进行冻干的样品，是指实施例1中1.3的对照样品。
每个样品平行测定2次，所有试料以随机次序在重复性条件下测试，即在同一实验室中由相同的人员使用相同的测试方法和仪器在较短时间内测试。本发明制备的河鲀鱼基料标准样品中河豚毒素含量的均匀性测定结果见表4，其均匀性评价结果见表5，从表5可知，两个样品组之间不存在显著差异，可以认为样品是均匀的。从表5可见，经F检验，计算F比为1.47，小于查表所得到的F(14,15)＝2.42，说明样品是均匀的，样品(不)均匀性标准不确定度为0.0136％。而对照组的均匀性测定结果见表4，其均匀性评价结果见表6，从表6可知，经F检验，计算F比为994.34，远远大于查表所得到的F(14,15)＝2.42，说明样品是极其不均匀的，样品(不)均匀性标准不确定度为0.7558％。结果表明，本发明的河鲀鱼基料标准样品具备明显优于对照的均匀性。
表4 均匀性测定结果(以干品计)
Figure BDA0003179865630000126
Figure BDA0003179865630000131
表5 本发明河鲀鱼基料标准样品中河豚毒素含量均匀性单因素方差分析结果
Figure BDA0003179865630000132
表6 对照组样品中河豚毒素含量均匀性单因素方差分析结果
Figure BDA0003179865630000133
实施例4河鲀鱼基料标准样品的稳定性检验评价
1.长期稳定性预检验
长期稳定性是考察标准样品在贮存条件下的稳定性，按照时间间隔前密后疏的抽样原则，随机选取本发明实施例1制备的最终样品进行稳定性预试验，第一年每两个月、第二年每三个月进行含量测试。每次抽取4个样品进行测试。所选取的用于稳定性测试的包装好的样品在0～4℃低温条件下历经了长时间保存。在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均匀性测试相同。
用线性拟合模型评估标准样品的稳定性，以X代表时间，Y代表标准样品中目标毒素的含量，斜率b1用下式计算：
Figure BDA0003179865630000134
式中：
Figure BDA0003179865630000141
截距由下式计算：
Figure BDA0003179865630000142
直线上的点的标准偏差可由下式计算：
Figure BDA0003179865630000143
取其平方根s，与斜率相关的不确定度用下式计算：
Figure BDA0003179865630000144
长期稳定性引入的不确定度由下式计算：
ults＝s(b1)·X
测试结果见表7。稳定性方差分析表见表8，不稳定标准差为0.00631。结果表明制得的标准样品在4年内未观测到明显的不稳定性。且有效期四年的不确定度不超过预期不确定度，故确定标准样品有效期为4年，更长时间的稳定期将根据持续不断的检测结果进行确定。
表7 河鲀鱼基料标准样品中河豚毒素含量的稳定性预检验结果
Figure BDA0003179865630000145
Figure BDA0003179865630000151
表8 稳定性方差分析表
Figure BDA0003179865630000152
2.短期稳定性检验
短期稳定性检验是指运输过程中，由于运输条件限制和外部环境的影响，标准样品的特性量值所受到的影响：主要是温度、湿度等因素变化对样品量值变化的影响。将实施例1制备的最终样品储存在模式运输条件下，采用1分析方法进行检测，并与长期存储条件下的样品作比对分析实验。
用t检验法对运输前后样品的测定值进行一致性检验，检验公式为：
Figure BDA0003179865630000153
Figure BDA0003179865630000154
Figure BDA0003179865630000155
统计量t计算：
Figure BDA0003179865630000161
计算出t实验，与t0.95,(n1 +n2 -2)比较，如果t实验小于临界值，则认为该标准样品的特性量值没有发生显著性变化，否则认为有显著性差异。
2021年1－5月间，采用同步设计方法在-80℃～55℃范围内(选择-80℃、-20℃、4℃、25℃、55℃)进行了运输条件下标准样品的稳定性研究，由稳定性实验所得到的数据初步分析，在0－4℃范围内的标准样品未观测到不稳定性，因此，使用在此温度范围内储存的标准样品作为“基点”，其他温度条件下放置的标准样品为研究对象，每个温度条件下测试3瓶标准样品，每瓶重复测试两次，历经的条件和测试结果如表9。实验结果表明，制备成的河鲀鱼基料标准样品中河豚毒素含量值在模拟运输条件下的测定值具有一致性。不考虑瓶间不均匀性与温度效应的交互作用，采用双因素方差分析(见表10)，得到运输条件下不稳定性标准差为0.0023。
表9 同步设计运输条件下稳定性研究条件及其测试结果
Figure BDA0003179865630000162
表10 稳定性方差分析表
Figure BDA0003179865630000163
3.长期稳定性检验
所选取的用于稳定性测试的包装好的样品在0～4℃低温条件下历经了长时间保存。随机选取样品进行稳定性试验。第一年每两个月、第二年每三个月进行含量测试。在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均匀性测试相同。测试结果见表11，稳定性方差分析表见表12，不稳定标准差为0.0068。
表11 河鲀鱼基料标准样品的稳定性检验结果
Figure BDA0003179865630000171
表12 稳定性方差分析表
Figure BDA0003179865630000172
实施例5河鲀鱼基料标准样品的定值
采用多个实验室协作试验定值，参加实验室的数目为8个。对本发明经过均匀性和稳定性检验合格的样品，随机抽取40瓶，每个定值实验室分发5瓶样品，每瓶样品平行测定2次。定值实验室选派具有丰富操作经验的实验员，按照统一的实验程序，利用液相色谱串联质谱仪测定河豚毒素含量的检测试验，测试数据汇总表见表13。
8个实验室的定值数据采用夏皮罗-威尔克(Shapiro-Wilk)检验法考察其正态性。在近似符合正态性的前提下，再经Grubb’s法检验确认每个实验室均不存在异常值，用科克伦(Cochran)检验各实验室定值数据是否等精度。对数据进行统计，计算河鲀鱼基料标准样品中河豚毒素含量的标准值及不确定度，结果见表14。
正态性检验中，偏态系数A小于95％临界值，峰态系数B落于95％置信区间内。正态性检验结果表明，定值数据符合正态分布。异常值检验结果表明，定值数据中不存在异常值。上述结果表明，所有的数据均通过检验，各实验室测试精度一致。定值结果采用标准值±扩展不确定度的方式表示。
将均匀性和稳定性所导致的不确定度与测定不确定度合成，得到结果的合成标准不确定度，取包含因子为k＝2，得到结果的扩展不确定度，河鲀鱼基料标准样品中河豚毒素含量的定值结果为：(5.20±0.03)mg/kg，k＝2。
表13 河鲀鱼基料标准样品中河豚毒素含量定值结果汇总表
Figure BDA0003179865630000181
表14 河鲀鱼基料标准样品中河豚毒素含量定值结果统计分析表
Figure BDA0003179865630000182
实施例6河鲀鱼基料标准样品的应用
收集三份河鲀鱼肝脏样品、卵巢样品、肌肉样品，按照实施例2中的1.水产品及食品中河豚毒素含量分析方法，分别采用本发明制备的河鲀鱼基料标准样品和市售纯品河豚毒素标准品(品牌：阿尔塔，货号：1ST9101-100MW，甲醇/水中河豚毒素溶液)做标准曲线及添加回收进行定量分析，测定所收集样品中河豚毒素的含量及平均值，结果详见表15。
表15 测定河鲀鱼样品中河豚毒素含量的结果
Figure BDA0003179865630000183
Figure BDA0003179865630000191
结果显示，采用本发明制备的河鲀鱼基料标准样品做标准曲线及添加回收进行定量测定时，从河鲀鱼肝脏样品、河鲀鱼卵巢样品、河鲀鱼肌肉样品中测定的河豚毒素含量要高于以市售纯品标准品做标准曲线和添加回收的测定值，两组之间的结果存在显著差异，说明本发明制备的天然河鲀鱼基料标准样品更能体现目标分析物在水产品基料内真正存在的状态、且回收提取效率更高，进一步证实了本发明标准样品的实用性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)均质匀浆：取河鲀的肝脏、卵巢和肌肉组织，进行均质粉碎、匀浆，得到匀浆样品；
(2)预冷冻：取上步得到的所述匀浆样品，冷冻处理得到预冷冻样品；
(3)预真空冷冻干燥：在真空条件下，将上步得到的所述预冷冻样品进行冷冻干燥，得到粘稠状样品；
(4)脱脂：取上步得到的所述粘稠状样品，加入正己烷，在通风条件下不断搅拌样品，正己烷作为溶剂对样品进行脱脂，得到脱脂后的样品；
(5)再次均质匀浆：取上步得到的所述脱脂后的样品，再次进行均质粉碎、匀浆，得到脱脂匀浆样品；
(6)再次真空冷冻干燥：在真空条件下，将上步得到的所述脱脂匀浆样品进行冷冻干燥，得到松散状的冻干粗粉；
(7)研磨、过筛：取上步得到的所述冻干粗粉，进行粉碎，细磨，过筛，得到冻干细粉，作为河豚毒素标准样品。
2.根据权利要求1所述基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述冷冻处理是置于-75～-85℃预冷冻1～3h；优选置于-80℃预冷冻2h。
3.根据权利要求1所述基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法，其特征在于：步骤(3)中，在0.05-～0.2mbar真空条件下，先进行初步冷冻干燥，将所述预冷冻样品制成物料厚度为1～3cm的样品，在-45～-55℃预冷冻5～8h；然后在-45～-55℃冷冻8～12h；最后在-10℃～30℃快速升温干燥8h以上，快速升温的速率为≥1.0℃/min，得到粘稠状样品；优选地，采用真空冷冻干燥机进行初步冷冻干燥，物料厚度2cm，先-50℃预冷冻6h，然后0.1mbar真空冷冻10h，最后-10℃～30℃快速升温干燥8h以上，快速升温的速率≥1.0℃/min。
4.根据权利要求1所述基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述粘稠状样品与正己烷的体积比为1:10～1:12，优选为1:10，在通风条件下不断搅拌样品1～2h，弃上清液，取沉淀物，为所述脱脂后的样品。
5.根据权利要求1所述基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法，其特征在于：步骤(6)中，在0.05～0.2mbar真空条件下处理上步得到的所述脱脂匀浆样品，将所述脱脂匀浆样品制成物料厚度为1～3cm的样品，在-45～-55℃预冷冻5～8h；然后在-10℃～30℃快速升温干燥8h以上，快速升温的速率为≥1.0℃/min，直至完全干燥，得到松散状的冻干粗粉；优选地，采用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，物料厚度2cm，-50℃预冷冻6h，0.1mbar真空冷冻10h，-10℃～30℃快速升温干燥8h以上，快速升温的速率为≥1.0℃/min，直至完全干燥，得到松散状的冻干粗粉。
6.根据权利要求1所述基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法，其特征在于：步骤(7)中，所述冻干细粉的颗粒大小在30-80目之间。
7.一种河豚毒素标准样品，运用权利要求1-6中任一项所述基于河鲀鱼基料的天然河豚毒素标准样品制备方法，制备得到。
8.根据权利要求7所述河豚毒素标准样品，其特征在于：所述河豚毒素标准样品为冻干细粉，粒度在30-80目之间；河豚毒素含量值为5.20±0.03mg/kg。
9.根据权利要求7所述河豚毒素标准样品，其特征在于：所述河豚毒素标准样品经F检验，均匀性F比为1.4-1.5，样品不均匀性标准不确定度为0.013-0.014％；稳定性F比为2.1-2.2，样品不稳定标准差为0.006-0.007％；优选地，所述河豚毒素标准样品经F检验，均匀性F比为1.47，样品不均匀性标准不确定度为0.0136％；稳定性F比为2.15，样品不稳定标准差为0.0068％。
10.一种权利要求7-9任一项所述河豚毒素标准样品在河豚毒素检测上的用途。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101858833A (zh) * 2010-05-21 2010-10-13 王秋艳 麻痹性贝类毒素标准样品及其制备方法和应用
US20110201627A1 (en) * 2008-09-17 2011-08-18 Ruizao Yi Freeze-dried reparation of tetrodotoxin and the producing method thereof
CN102288464A (zh) * 2011-07-05 2011-12-21 时文春 一种鲤鱼肌肉中氯霉素残留冻干粉标准样品的制备方法
CN104155162A (zh) * 2014-08-22 2014-11-19 威海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 动物源基体药物及其代谢物残留冻干粉标准样品制备方法
CN106645496A (zh) * 2016-12-30 2017-05-10 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 液质联用快速测定鱼肝脏中河鲀毒素含量的方法
CN107957473A (zh) * 2018-01-12 2018-04-24 杨洁 一种河豚毒素的快速检测方法
CN111122752A (zh) * 2020-02-26 2020-05-08 浙江清华长三角研究院 一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110201627A1 (en) * 2008-09-17 2011-08-18 Ruizao Yi Freeze-dried reparation of tetrodotoxin and the producing method thereof
CN101858833A (zh) * 2010-05-21 2010-10-13 王秋艳 麻痹性贝类毒素标准样品及其制备方法和应用
CN102288464A (zh) * 2011-07-05 2011-12-21 时文春 一种鲤鱼肌肉中氯霉素残留冻干粉标准样品的制备方法
CN104155162A (zh) * 2014-08-22 2014-11-19 威海出入境检验检疫局检验检疫技术中心 动物源基体药物及其代谢物残留冻干粉标准样品制备方法
CN106645496A (zh) * 2016-12-30 2017-05-10 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 液质联用快速测定鱼肝脏中河鲀毒素含量的方法
CN107957473A (zh) * 2018-01-12 2018-04-24 杨洁 一种河豚毒素的快速检测方法
CN111122752A (zh) * 2020-02-26 2020-05-08 浙江清华长三角研究院 一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陈伟珠等: "河豚毒素标准样品的研制", 《化学分析计量》 *

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