CN110531019B - 一种基于不同动物源性肉类特征多肽的肉样掺假定量检测方法 - Google Patents
一种基于不同动物源性肉类特征多肽的肉样掺假定量检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
针对目前对肉类的检测标准体系中，动物源性检测手段都只能做到定性或半定量，无法判断摻伪的严重程度的技术问题，本发明提供基于高效液相色谱串联质谱技术定量测定多种动物源性肉类的方法。为实现本发明目的，本发明筛选了鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉的标准肉样特征性多肽，并将特征多肽应用于定量检测肉样掺假情况。本发明的定量检测方法包括：待测肉样前处理，以及高效液相色谱‑质谱联用检测待测肉样中的特征多肽等步骤。本发明还提供了一种较为通用的标准肉样特征性多肽的筛选方法。为肉类市场的肉样掺假情况监管提供有效技术手段。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质组学技术领域，涉及一种基于不同动物源性肉类特征多肽的肉样掺假情况定量检测方法。具体为一种基于高效液相色谱质谱联用的测定混合肉样中不同物种来源及含量的方法，以及一种利用液质联用对比筛选出物种特异性多肽的方法。
背景技术
近几十年来，肉类食品在居民消费中的比例逐年上升，但随之也带来了一些违法行为，以价格低廉的猪肉、鸭肉、鸡肉甚至病死动物肉类及过期肉冒充高价牛、羊肉的事件时有曝光，让人触目惊心。
有关调查显示，肉制品的掺假主要表现在：①原料肉类掺假；②肉组织的替换，比如使用其他动物的组织替换肌肉组织成分；③非肉成分的添加，例如刻意注水以及掺入植物蛋白等。这些问题严重影响了世界范围内的肉品产业，不但制约了肉品质量的提升，还严重损害了消费者的经济利益和身体健康，甚至造成了一些宗教层面的问题。
然而，目前检测标准体系中现有的动物源性检测手段都只能做到定性或半定量，无法判断摻伪的严重程度，不能严厉打击假冒伪劣的不法商贩。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术手段的缺陷，提供一种基于高效液相色谱串联质谱技术定量测定多种动物源性肉类的方法，为肉类市场监管提供技术参考。
为了实现本发明目的，本发明提供一种肉蛋白多肽生物标记物(即各种标准肉样特征多肽)，结合高效液相色谱串联质谱技术，定量测定多种动物源性肉类的手段，包括样品前处理，各种标准肉样特征多肽的筛选、合成，以及高效液相色谱-质谱联用检测待测肉样中的特征多肽等步骤。
本发明的第一个目的在于提供用于定量检测肉样中不同动物源性肉类的特征多肽。
本发明的第二个目的是提供前述的标准肉样特征性多肽的筛选方法。
本发明的第三个目的是提供一种肉样掺假情况的定量检测方法。
本发明的第四个目的在于提供不同动物源性肉类的特征多肽、和肉样掺假情况的定量检测方法在定量检测肉样掺假情况中的应用。
本发明具体技术方案如下：
本发明的第一个目的在于提供用于定量检测肉样中不同动物源性肉类的标准肉样特征多肽，所述不同动物源性肉类分别为鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉，其标准肉样特征性多肽信息分别如下：
本发明的第二个目的是提供前述的标准肉样特征性多肽的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
S1：对标准肉样进行优化的前处理：
(1)提取不同动物源性肉类标准肉样总蛋白；
(2)将得到的标准肉样全蛋白溶液进行蛋白浓度测定；
(3)利用胰蛋白酶对全蛋白溶液消化；
(4)对消化得到的多肽溶液进行脱盐，优选的，采用离心管式脱盐柱进行脱盐。
进一步的，所述的标准肉样为已明确动物源的鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉。
S2：通过高效液相色谱-质谱联用筛选出标准肉样中所特有的热稳定性多肽：
(1)将S1步骤(4)得到的多肽样品通过使用纳升液质系统的反相液相色谱得到肽段产物；
(2)使用LTQ-Orbitrap质谱仪的串联质谱纳升离子源进行分析检测；
(3)利用Proteome Discover-1.4进行质谱数据分析，预筛选各种标准肉样中的特征多肽；
(4)通过高效液相色谱快速检测，验证预筛选得到多肽的响应强度，获得SEQ IDNO.1～15所示的的各种标准肉样特征性多肽信息。
进一步的，标准肉样特征性多肽的筛选方法中S1所述的前处理具体操作如下：
(1)提取肉样总蛋白：标准肉样去除脂肪和结缔组织，切碎，称取2g肉样，加入15～30mL2％SDS-PBS提取缓冲液(要保证浸没匀浆刀头，但不能添加过多否则匀浆过程中会产生大量泡沫造成实验误差)，冰浴条件下匀浆9600～13400rpm 30s，重复3～5次，每次匀浆间隔30s，然后4000g，4℃离心10min后，取上清液用纱布过滤，得到肌肉全蛋白溶液；本发明筛选方法提取所得的肉样总蛋白纯度更高，减少脂肪等杂质干扰；
(2)全蛋白溶液浓度测定：将步骤(1)得到的肌肉全蛋白溶液用相同的提取缓冲液稀释至适当的倍数(以5～15倍为宜)，采用BCA试剂盒，通过绘制标准样品的标准曲线来测定步骤(1)得到的肌肉全蛋白溶液浓度；取样品稀释液25μl及200μl工作液混合液于96孔板中，37℃孕育30min，冷却至室温后562nm波长测定样品蛋白浓度。
(3)全蛋白溶液消化：
①活化：将10KD超滤管用超纯水活化，超滤管内插管内加入200μl超纯水，14000g离心15min；
②加样：取200μg蛋白量，根据步骤(2)测定的蛋白溶液浓度，计算取200μg蛋白的体积为X mL，然后补充Y mL 8M尿素，50mM Tris-HCl(485.28g尿素溶于800mL水后加入6.057g三羟甲基氨基甲烷，用盐酸调至pH＝8，最后定容至1L)至200μL体系，即X+Y＝200μL，到超滤管中，14000g离心15min，弃废液；优选的，可再次补加200μL 8M尿素，50mM Tris-HCl(pH＝8.0)，14000g离心15min，以充分去除目的蛋白以外的小分子物质，弃废液，所需样品仍在超滤管内插管中；本发明筛选方法样品需求量小，仅200μg的样品蛋白即可完成检测；
③还原：加200μL 8M尿素，50mM Tris-HCl(pH＝8.0)，往溶液中加入1M DTT 5μL，60℃加热60min，冷却至室温，14000g离心15min,弃废液；
④烷基化：加200μL 8M尿素，50mM Tris-HCl(pH＝8.0)，加入0.5M IAM 20μL，室温暗处孵育45min，14000g离心15min，弃废液；加200μL的pH＝7.8、50mM NH4HCO3，14000g离心15min，弃废液，此步骤重复一次；
⑤酶切：更换新的超滤管底管，加200μL 50mM NH4HCO3(pH＝7.8)，按胰蛋白酶与底物蛋白的量之比在1:50，加入40μL浓度为0.1μg/μL的胰蛋白酶液，37℃孵育16h；
⑥保存：孵育结束后，14000g离心25min，补加50μL 50mM NH4HCO3(pH＝7.8)，14000g离心25min，此时底管内即酶解后肽段，往溶液加甲酸至终浓度为0.2％，短时间内可4℃保存，若需长时间保存，需真空冷冻干燥成粉末，4℃保存即可；
(4)对消化得到的多肽溶液脱盐，本发明筛选方法使用专业的离心管式脱盐柱，极大提高了脱盐效率和多肽浓度，并降低人为误差：
①向脱盐管内插管中加入加100μL含0.2％FA的60％ACN溶液，5000g离心2min，弃废液；
②向脱盐管内插管中加入100μL含0.2％FA的超纯水，5000g离心2min，弃废液；
③将步骤(3)消化所得的未冻干待脱盐酶解多肽样品全部转移至脱盐管内插管中，或将步骤(3)消化所得冻干样品加100μL超纯水复溶，并转移至脱盐管内插管中，5000g离心2min，弃废液；
④向脱盐管中内插管中加入300μL超纯水，5000g离心2min，弃废液，换底管；
⑤向脱盐管中内插管中加入中加100μL含0.2％FA的60％ACN溶液，5000g离心2min，离心所得溶液即为脱盐完毕的肽段混合物样品，采用nanodrop微量分光光度计测定肽段混合物样品浓度，真空冷冻干燥后待用(4℃以下至少可放置半年)。
进一步的，前述标准肉样特征性多肽的筛选方法S1所述步骤(1)和步骤(2)中所述提取缓冲液为2％SDS-PBS缓冲液，所述提取缓冲液的配制方法为二水磷酸二氢钠0.624g，十二水磷酸氢二钠2.148g，SDS 20g，水1L，70℃搅拌至澄清配置得；步骤(3)中所述超滤管为Ultracel-3超滤管，每管处理量0.5mL，截留分子量≥10kDa；胰蛋白酶，酶活力≥1645units/mg；步骤(4)中所述脱盐管为Monaspin C18萃取头，填料为整体性硅胶，通孔孔径为5μm，介孔孔径为10nm，表面积为350m2/g,上样体积为50～800μL。
进一步的，标准肉样特征性多肽的筛选方法S2所述的标准肉样特征多肽的筛选，具体操作如下：
(1)将S1步骤(4)得到的样品通过使用纳升液质系统的反相液相色谱得到肽段产物，所述色谱条件为：将S1步骤(4)得到的样品由自动进样器上样到预柱为C18色谱柱(长2cm，内径200μm，填料粒径5μm)，再经分析柱为C18色谱柱(长75μm，内径100mm，填料粒径3μm)分离；流动相A选用0.1％甲酸溶液，流动相B选用0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈浓度为84％)；梯度洗脱：0～12min(97％A，3％B)，12～100min(72％A，28％B)，100～120min(45％A，55％B)，122～144min(2％A，98％B)，144～160min(97％A，3％B)，流速为300nL/min；上样量为4.5μg；
(2)使用LTQ-Orbitrap质谱仪的串联质谱纳升离子源对步骤(1)分离所得的肽段产物的二级质谱数据进行分析检测，所述质谱条件为：将步骤(1)得到的肽段产物在LTQOrbitrap XL上进行质谱扫描，将碰撞诱导解离的归一化碰撞能量设定为35，并在线性离子阱中以正常分辨率检测所得碎片，锁定质量设为445.120020，从300～1800m/z全范围扫描，时长160min；其中loading buffer为2％乙腈，HPLC级水中的0.1％甲酸；所述的B缓冲液为80％乙腈，HPLC级水中的0.1％甲酸；
(3)预筛选各种标准肉样中的特征多肽，质谱数据分析：利用Proteome Discover-1.4在鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉和羊肉数据库中搜索与肽段二级质谱数据匹配；搜索的参数设置为：母离子浓度公差为10ppm，Oxidation of Met设为可变修饰，允许漏切位点目数为2；根据质谱数据分析结果，选取每个物种中独有的多肽信息，获得相对的特异性多肽，取其中每组样品丰度最高的10个特征多肽作为预筛选特征多肽进行验证；
(4)通过高效液相色谱快速检测，验证预筛选得到多肽的响应强度，获得SEQ IDNO.1～15所示的各种标准肉样特征性多肽信息；色谱条件：肽段混合物由自动进样器上样的预柱为EclipsePLus C18柱(2.1×50mm)；流动相A选用0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈浓度为84％)，流动相B选用0.1％甲酸溶液；梯度洗脱：0～7min(0％A，100％B)，7～52.6min(50％A，50％B)，53～58.2min(100％A，0％B)，59～72min(0％A，100％B)，流速为200nL/min；柱温35℃，上样量为20μL；质谱条件：离子源：ESI，+离子模式；气体温度：250℃，气体流速：12L/min；雾化压力：25psi；鞘气温度：350℃，鞘气流速：12L/min；毛细管电压：4000V；扫描模式：多反应监测模式。
本发明的第三个目的是提供一种肉样掺假情况的定量检测方法，包括如下步骤：
S1：对待测肉样进行优化的前处理：
(1)提取待测肉样总蛋白；本发明待测肉样总蛋白提取方法可有效提高总蛋白浓度和纯度
(2)将得到的待测肉样全蛋白溶液进行蛋白浓度测定，准确定量；
(3)利用胰蛋白酶对全蛋白溶液消化，样本需求量较小；
(4)对消化得到的多肽溶液进行脱盐；本发明脱盐方法高效，最终收集的多肽浓度较高。
S2：通过高效液相色谱-质谱联用定量检测待测肉样成分：利用三重四级杆高效液相色谱-质谱联用多反应监测模式快速检测出混合肉样中多肽的响应情况，并与SEQ IDNO.1～15所示的标准肉样的特征多肽进行比较，从而判定待测肉样组分；即根据已通过验证实验的标准肉样，并绘制出的前述标准曲线，根据待测样品中不同特征多肽响应峰的情况并结合标准曲线，即可确定待测肉样的组成峰面积反映了多肽的含量，通过标准曲线可以换算成几种肉所占的比例。
具体的，能够明确以下信息：待测肉样是否包括其他动物源性的肉类；如待测肉样包含其他动物源性肉类，可检测出其他动物源性肉类的种类及含量；所述可检测出的动物源性肉类的种类包括鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉；所述待测肉样为生肉或熟肉或深加工肉制品，优选的，所述待测肉样为鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉中一种或几种混合的生肉或熟肉或深加工肉制品。
进一步的，肉样掺假情况的定量检测方法S1所述的前处理操作如下：
(1)提取肉样总蛋白：用70％乙醇洗涤肉样30s，再用纯乙醇洗涤15s，接着用90％甲醇洗涤30s，最后用去离子水洗涤两次，每次30s；
(2)肉样总蛋白提取消化：取1g步骤(1)得到的肉类样品加入5mL蛋白提取液，冰上研磨匀浆，12000rpm 4℃离心10min。按照每100μL上清加入400μL-20℃预冷的丙酮，涡匀，-20℃放置过夜。取出后12000rpm 4℃离心10min，吹干沉淀，加入1mL尿素提取液复溶，采用BCA试剂盒，通过绘制标准样品的标准曲线来测定全蛋白溶液浓度，取样品25μl及200μl工作液混合液于96孔板中，37℃孕育30min，冷却至室温后562nm波长测定样品蛋白浓度；按照100μg蛋白加入50μL 100mM NH4HCO3(含有10mM DTT)，60℃水浴30min，冷却至室温，加入50μL 100mM NH4HCO3(含有55mM IAA)，25℃暗中放置20min，按照100μg蛋白加入1μg胰蛋白酶，37℃过夜，加入10μL甲酸，待脱盐。
(3)肉样蛋白脱盐：将准备好的C18固相萃取小柱装好，用5mL甲醇活化，然后加入5mL 1％甲酸平衡，加入酶解后样品溶液，5mL 5％甲醇(含有1％甲酸)洗涤，5mL90％乙腈(含0.1％甲酸)洗脱，加入25μL DMSO，氮吹吹干，用1mL3％乙腈水(含0.1％甲酸)复溶，待测。
进一步的，前述肉样掺假情况的定量检测方法S1所述蛋白提取液由7M尿素，2M硫脲，50mM DTT，4％3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸内盐(CHAPS，w/v)配置；尿素提取液由1M尿素，用100mM NH4HCO3溶解得；胰蛋白酶溶液浓度为0.1mg/mL，用25mM NH4HCO3溶解。
进一步的，前述肉样掺假情况的定量检测方法S2中，高效液相色谱-质谱联用的操作如下：
(1)液相色谱条件：
色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18柱，粒度2.7μm，150×3.0mm(内径)；
流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；
流动相：A：乙腈(含0.1％甲酸)；B：0.1％甲酸水溶液，梯度淋洗如下：
(2)质谱条件：
离子源：ESI(+离子模式)；
气体温度：250℃，气体流速：12L/min；
雾化压力：25psi；
鞘气温度：350℃，鞘气流速：12L/min；
毛细管电压：4000V；
扫描模式：多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)。
本发明的第四个目的是提供前述的不同动物源性肉类的标准肉样特征多肽或前述的肉样掺假情况的定量检测方法在定量检测肉样掺假中的应用，所述待测肉样为生肉或熟肉或深加工肉制品，优选的，所述待测肉样为鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉中一种或几种混合的生肉或熟肉或深加工肉制品；所述应用包括明确以下信息：待测肉样是否包括其他动物源性的肉类；如待测肉样包含其他动物源性肉类，可检测出其他动物源性肉类的种类及含量；所述可检测出的动物源性肉类的种类包括鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉。
本发明所述M为mol/L，本发明所述mM为mmol/L。
本发明所述浓度百分比，如未明述，均为体积浓度百分比。
本发明的技术方案的有益效果在于：
1.减少全蛋白溶液提取过程中脂肪、结缔组织等杂质的干扰，保证蛋白样品纯度；
2.提供一种高效稳定的蛋白消化方法，样品需求量低；
3.大大缩减了多肽样品脱盐的效率，减少人为误差，实验操作简单易操作，极大地提高了多肽样品的提取率；
4.提供了多条可供鸡鸭猪牛羊肉样掺假情况检测使用的特征多肽，为肉类市场的肉样掺假情况监管提供多样化选择。
附图说明
图1为鸡肉酶解产物LC-MS/MS总离子流图及质谱图，其中，图1A为LC-MS/MS总离子流图，图1B为质谱图；
图2为牛肉酶解产物LC-MS/MS总离子流图及质谱图，其中，图2A为LC-MS/MS总离子流图，图2B为质谱图；
图3为鸭肉酶解产物LC-MS/MS总离子流图及质谱图，其中，图3A为LC-MS/MS总离子流图，图3B为质谱图；
图4为猪肉酶解产物LC-MS/MS总离子流图及质谱图，其中，图5A为LC-MS/MS总离子流图，图5B为质谱图；
图5为羊肉酶解产物LC-MS/MS总离子流图及质谱图，其中，图4A为LC-MS/MS总离子流图，图4B为质谱图；
图6为猪肉中添加牛肉的混合模型标准曲线(猪肉：牛肉分别以0：100，20:80，40:60，60:40，80:20，100:0质量比例混合)；
图7为牛肉中添加猪肉的混合模型标准曲线(牛肉：猪肉分别以0：100，20:80，40:60，60:40，80:20，100:0质量比例混合)；
图8为牛肉中添加鸭肉的混合模型标准曲线(牛肉：鸭肉分别以0：100，20:80，40:60，60:40，80:20，100:0质量比例混合)；
图9为鸭肉中添加牛肉的混合模型标准曲线(鸭肉：牛肉分别以0：100，20:80，40:60，60:40，80:20，100:0质量比例混合)；
图10为鸡肉中添加羊肉的混合模型标准曲线(鸡肉：羊肉分别以0：100，20:80，40:60，60:40，80:20，100:0质量比例混合)；
图11为羊肉中添加鸡肉的混合模型标准曲线(羊肉：鸡肉分别以0：100，20:80，40:60，60:40，80:20，100:0质量比例混合)
图12为鸡肉特征多肽热稳定性曲线；
图13为牛肉特征多肽热稳定性曲线；
图14为鸭肉特征多肽热稳定性曲线；
图15为猪肉特征多肽热稳定性曲线；
图16为羊肉特征多肽热稳定性曲线；
图17为羊肉中模拟添加1％鸡肉检测结果；
图18为牛肉中模拟添加1％鸭肉检测结果。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂和生物材料，如未特别说明，均已公开。以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1筛选和验证不同动物源性肉类的特征多肽
1.标准肉样前处理：
标准肉样为已明确动物源的鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉。
标准肉样分为生肉和熟肉两大类，生肉为市售生鲜肉，冻存于-20℃待用，熟肉为生鲜肉水浴锅80℃水浴加热1h制得，后冻存于-20℃待用；
(1)提取肉样总蛋白：标准肉样去除脂肪和结缔组织，切块后切碎，称取2g肉样，加入25mL 2％SDS-PBS提取缓冲液，冰水浴条件下匀浆9600rpm 30s 2次，然后13400rpm 30s，每次匀浆间隔30s，然后4000g，4℃离心10min后，上清液用纱布过滤，去除少量脂肪等悬浮成分，即为肌肉全蛋白溶液；
(2)全蛋白溶液浓度测定：将步骤(1)得到的肌肉全蛋白溶液用提取缓冲液稀释10倍，采用BCA试剂盒(购于Thermo Scientific(美国)公司，货号：23225)，通过绘制标准样品的标准曲线来测定蛋白溶液浓度。取样品稀释液25μL及200μL工作液混合液于96孔板中，37℃孕育30min，冷却至室温后于酶标仪中562nm波长测定样品蛋白浓度，每个样品测定3次平行。
提取缓冲液为2％SDS-PBS缓冲液，配制方法为二水磷酸二氢钠0.624g，十二水磷酸氢二钠2.148g，SDS 20g，水1L，70℃搅拌至澄清配置得。
标准曲线配制方法如下：
表1稀释蛋白浓度标准曲线
全蛋白溶液浓度测定结果如下：
表2不同肉样全蛋白溶液浓度
| 物种 | 生肉(mg/ml) | 熟肉(mg/ml) |
| 鸡 | 11.73±0.94 | 11.42±0.35 |
| 鸭 | 12.67±0.77 | 12.15±0.20 |
| 猪 | 10.95±0.14 | 13.48±1.72 |
| 牛 | 7.51±1.03 | 5.59±1.62 |
| 羊 | 9.30±0.93c | 7.03±1.17 |
(3)全蛋白溶液消化：
①活化：将10KD超滤管用超纯水活化，即加入200μL超纯水，14000g离心15min(室温即可)；
②加样：取200μg蛋白量，根据表2测定的蛋白溶液浓度，计算取200μg蛋白的体积为X mL，然后补充Y mL 8M尿素，50mM Tris-HCl(485.28g尿溶于800mL水后加入6.057g三羟甲基氨基甲烷，用盐酸调至pH＝8，最后定容至1L)至200μL体系(即X+Y＝200μL)到超滤管中，14000g离心15min，弃废液；补加200μL 8M尿素，50mM Tris-HCl(pH＝8.0)，14000g离心15min，弃废液，补加200μL 8M尿素，50mM Tris-HCl(pH＝8.0)，14000g离心15min，弃废液，所需样品仍在超滤管内插管中；
③还原：加200μL 8M尿素，50mM Tris-HCl(pH＝8.0)，往溶液中加入1M DTT(二硫苏糖醇)5μL，60℃加热60min，冷却至室温，14000g离心15min，弃废液；
④烷基化：加200μL 8M尿素，50mM Tris-HCl(pH＝8.0)，加入0.5M IAM(碘代乙酰胺)20μL，室温暗处孵育45min，14000g离心15min，弃废液；加200μL 50mM NH4HCO3(pH＝7.8)，14000g离心15min，弃废液，此步骤重复一次；
⑤酶切：更换新的超滤管底管，加200μL 50mM NH4HCO3(pH＝7.8)，按胰蛋白酶与底物蛋白的量之比在1:50，加入40μL浓度为0.1μg/μL的酶液，37℃孵育16h；
超滤管为Ultracel-3超滤管，每管处理量0.5mL，截留分子量≥10kDa；Trypsin酶(胰蛋白酶)，酶活力≥1645units/mg，购于美国Sigma-Aldrich公司，货号：T7409。
⑥保存：孵育结束后，14000g离心25min，补加50μl 50mM NH4HCO3(pH＝7.8)，14000g离心25min，此时底管内即酶解后肽段，往溶液加甲酸至终浓度为0.2％，真空冷冻干燥成粉末。
(4)对消化得到的多肽溶液脱盐：
使用Monaspin C18萃取头(购于北京谱朋科技有限公司)作为脱盐管，脱盐管内插管中加100μL含0.2％FA(甲酸)的60％CAN(乙腈)溶液，5000g离心2min，弃废液；加100μL含0.2％FA的超纯水，5000g离心2min，弃废液；将步骤(3)消化得到的多肽溶液样品用100μL超纯水复溶后加入脱盐管内插管，5000g离心2min，弃废液；加300μL超纯水，5000g离心2min，弃废液，更换底管；脱盐内插管中加100μL含0.2％FA的60％ACN溶液，5000g离心2min，离心所得即为脱盐完毕的样品，随后nanodrop测定浓度，真空冷冻干燥后待用。
Nanodrop定量肽段含量测定结果如下：
表3Nanodrop定量肽段含量浓度
| 单位mg/ml | 生肉 | 熟肉 |
| 鸡 | 0.626±0.107 | 0.613±0.127 |
| 鸭 | 0.566±0.091 | 0.723±0.062 |
| 猪 | 0.738±0.118 | 0.583±0.090 |
| 牛 | 0.466±0.053 | 0.661±0.078 |
| 羊 | 0.571±0.109 | 0.676±0.063 |
(5)标准肉样特征多肽的筛选，通过高效液相色谱-质谱联用筛选出标准肉样中所特有的热稳定性多肽：
使用纳升液质系统的反相液相色谱分离得到肽段产物，并使用LTQ-Orbitrap质谱仪的串联质谱纳升离子源进行分析检测，并筛选5种标准肉样中的特征多肽，具体步骤如下：
色谱条件：将上述步骤(4)脱盐得到的肽段混合物由自动进样器上样到预柱为C18色谱柱(长2cm，内径200μm，填料粒径5μm)，再经分析柱为C18色谱柱(长75μm，内径100mm，填料粒径3μm)分离。流动相A选用0.1％甲酸溶液，流动相B选用0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈浓度为84％)。梯度洗脱：0～12min(97％A，3％B)，12～100min(72％A，28％B)，100～120min(45％A，55％B)，122～144min(2％A，98％B)，144～160min(97％A，3％B)，流速为300nL/min。上样蛋白量为4.5μg。
质谱条件：分离后的肽段在LTQ Orbitrap XL上进行质谱扫描，将碰撞诱导解离的归一化碰撞能量设定为35，并在线性离子阱中以正常分辨率检测所得碎片，锁定质量设为445.120020，从300～1800m/z全范围扫描，时长160min。其中，上样缓冲液为2％乙腈,HPLC级水中的0.1％甲酸；所述的B缓冲液为80％乙腈,HPLC级水中的0.1％甲酸。
质谱数据分析：利用Proteome Discover-1.4(Thermo Fisher Scientific,PaloAlto,CA,USA)在猪肉(Sus scrofa)、牛肉(Bos taurus)、鸡肉(Gallus gallus)、羊肉(Ovisaries)和鸭肉(Anas platyrhynchos)数据库中搜索与肽段二级质谱数据匹配(http://www.uniprot.org/)。搜索的参数设置为：母离子浓度公差为10ppm，Oxidation of Met设为可变修饰，允许漏切位点目数为2。
鸡肉、牛肉、鸭肉、猪肉、羊肉酶解产物LC-MS/MS总离子流图及质谱图依次如图1～5所示，通过软件Proteome Discover-1.4并结合http://www.uniprot.org/所下载的数据库相匹配，可见：各标准样品多肽具有良好的相应强度，多肽质量良好；
(6)特征多肽筛选结果，共筛选出鸡肉特征多肽142条，鸭肉特征多肽207条，猪肉特征多肽184条，牛肉特征多肽92条，羊肉特征多肽126条。
根据质谱数据分析结果，选取每个物种中独有的多肽信息，获得相对的特异性多肽，取其中每组样品丰度最高的10个特征多肽进行验证。
(7)通过高效液相色谱快速检测，验证筛选得到多肽的响应强度，验证方法具体方法如下：
色谱条件：肽段混合物由自动进样器上样的预柱为EclipsePLus C18柱(2.1×50mm)。流动相A选用0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈浓度为84％)，流动相B选用0.1％甲酸溶液。梯度洗脱：0～7min(0％A，100％B)，7～52.6min(50％A，50％B)，53～58.2min(100％A，0％B)，59～72min(0％A，100％B)，流速为200nL/min。柱温35℃，上样量为20μL。
质谱条件：离子源：ESI，+离子模式；气体温度：250℃，气体流速：12L/min；雾化压力：25psi；鞘气温度：350℃，鞘气流速：12L/min；毛细管电压：4000V；扫描模式：多反应监测模式。
利用高效液相色谱快速检测，验证筛选得到多肽的响应强度，最后确定各不同动物源性肉类的特征多肽如表4所示：
表4各不同动物源性肉类的特征多肽
鸡肉、牛肉、鸭肉、猪肉、羊肉特征多肽热稳定性曲线依次如图12～16所示，由图可见：不同物种的特征多肽的质谱图峰存在显著不同，且各特征多肽在肉样高温加工过程后仍然可以被稳定检测出，具有良好的热稳定性。
实施例2待检肉样掺假情况的标准曲线绘制
运用三重四级杆高效液相色谱质谱联用绘制混合肉样的标准曲线，具体方法如下：
将鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉中的2种肉按0:100、20:80、40:60、60:40、80:20、100：0的质量比例分别混合，上机前处理方法具体为：
(1)提取肉样总蛋白：用70％乙醇洗涤肉样30s，再用纯乙醇洗涤15s，接着用90％甲醇洗涤30s，最后用去离子水洗涤两次，每次30s；
(2)肉样总蛋白提取消化：取1g步骤(1)得到的肉类样品加入5mL蛋白提取液，冰上研磨匀浆，12000rpm 4℃离心10min。按照每100μL上清加入400μL-20℃预冷的丙酮，涡匀，-20℃放置过夜。取出后12000rpm 4℃离心10min，吹干沉淀，加入1mL尿素提取液复溶，采用BCA试剂盒，通过绘制标准样品的标准曲线来测定全蛋白溶液浓度，取样品25μl及200μl工作液混合液于96孔板中，37℃孕育30min，冷却至室温后562nm波长测定样品蛋白浓度；按照100μg蛋白加入50μL 100mM NH4HCO3(含有10mM DTT)，60℃水浴30min，冷却至室温，加入50μL 100mM NH4HCO3(含有55mM IAA)，25℃暗中放置20min，按照100μg蛋白加入1μg胰蛋白酶，37℃过夜，加入10μL甲酸，待脱盐。
(3)肉样蛋白脱盐：将准备好的C18固相萃取小柱装好，用5mL甲醇活化，然后加入5mL1％甲酸平衡，加入酶解后样品溶液，5mL 5％甲醇(含有1％甲酸)洗涤，5mL90％乙腈(含0.1％甲酸)洗脱，加入25μL DMSO，氮吹吹干，用1mL3％乙腈水(含0.1％甲酸)复溶，待测。
(4)色谱条件：
色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18柱，粒度2.7μm，150×3.0mm(内径)；
流速：0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；
流动相：A：乙腈(含0.1％甲酸)；B：0.1％甲酸水溶液，梯度淋洗如下：
(5)质谱条件：
离子源：ESI(+离子模式)；
气体温度：250℃，气体流速：12L/min；
雾化压力：25psi；
鞘气温度：350℃，鞘气流速：12L/min；
毛细管电压：4000V；
扫描模式：多反应监测模式(multiple reaction monitoring，MRM)
猪肉和牛肉、牛肉和猪肉、牛肉和鸭肉、鸭肉和牛肉、羊肉和鸡肉、鸡肉和羊肉，以0：100.20:80,40:60,60:40,80:20,100:0质量比例混合的混合模型标准曲线图依次如图6～11所示，由图可见：三种混合模型线性良好，R2范围为0.946～0.992，可用于绝对定量。
实施例3待检肉样掺假情况的检出限测定
运用三重四级杆高效液相色谱质谱联用确定本方法是否可以达到1％的检出限，具体方法如下：
将鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉中的2种肉按1:99的质量比例分别混合，上机前处理方法同实施例3。
羊肉中模拟添加1％鸡肉、牛肉中模拟添加1％鸭肉实验结果如图17、图18所示，由图可见：在羊肉样品中添加1％的鸡肉，鸡肉样品可以被检测出；在牛肉样品中添加1％的鸭肉，鸭肉样品可以被检测出，可见本方法具有良好的检出限。
序列表
<110> 南京农业大学
南京市食品药品监督检验院
<120> 一种基于不同动物源性肉类特征多肽的肉样掺假定量检测方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 牛(Bos)
<400> 1
Thr Leu Glu Asp Gln Val Asn Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 牛(Bos)
<400> 2
Gly Leu Ser Asp Ser Val Ser Ile Gly Pro Val Thr Val Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 牛(Bos)
<400> 3
Phe Leu Glu Glu Leu Leu Thr Thr Gln Cys
1 5 10
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 鸡(Gallus)
<400> 4
Leu Val Ser Trp Tyr Asp Asn Glu Phe Gly Tyr Ser Asn Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 鸡(Gallus)
<400> 5
Ile Gly Asp Glu Phe Val Ala Asp Leu Asp Gln Leu Gln Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 鸡(Gallus)
<400> 6
Leu Asp Val Pro Ile Ser Gly Glu Pro Ala Pro Thr Val Thr Trp Lys
1 5 10 15
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 鸡(Gallus)
<400> 7
Glu Cys Gln Thr Leu Val Ser Asp Val Asp Tyr Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 鸭(Anatidae)
<400> 8
Val Val Phe Asp Asp Ser Phe Asp Arg
1 5
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 鸭(Anatidae)
<400> 9
Ile Val Glu Ser Leu Gln Ser Ser Leu Asp Ala Glu Ile Arg
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 鸭(Anatidae)
<400> 10
Leu Ala Ile Leu Glu Asn Ala Asn Val Leu Ala Arg
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 猪(Suidae)
<400> 11
Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg
1 5 10
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 猪(Suidae)
<400> 12
Asp Gln Gly Ser Tyr Glu Asp Phe Val Glu Gly Leu Arg
1 5 10
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 羊(Caprinae)
<400> 13
Ser Pro Pro Asn Pro Glu Asn Ile Ala Pro Gly Tyr Ser Gly Pro Leu
1 5 10 15
Lys
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 羊(Caprinae)
<400> 14
His Val Leu Thr Thr Leu Gly Glu Arg
1 5
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 羊(Caprinae)
<400> 15
Asn Leu Val His Ile Ile Thr His Gly Glu Glu Lys Asp
1 5 10
Claims (11)
1.用于定量检测肉样中不同动物源性肉类的标准肉样特征多肽，其特征在于：所述不同动物源性肉类为鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉和羊肉，所述标准肉样特征多肽信息如下：
。
2.权利要求1中所述标准肉样特征多肽的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：对标准肉样进行优化的前处理：
（1）提取不同动物源性肉类标准肉样的总蛋白，所述标准肉样为已明确动物源的鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉和羊肉；
（2）将得到的标准肉样全蛋白溶液进行蛋白浓度测定；
（3）利用胰蛋白酶对全蛋白溶液消化；
（4）对消化得到的多肽溶液脱盐；
S2：通过高效液相色谱-质谱联用筛选出标准肉样中所特有的热稳定性多肽：
（1）将S1步骤（4）得到的多肽样品通过使用纳升液质系统的反相液相色谱得到肽段产物：将S1步骤（4）得到的样品通过使用纳升液质系统的反相液相色谱得到肽段产物，所述色谱条件为：将S1步骤（4）得到的样品由自动进样器上样到预柱，所述预柱为C18色谱柱，长2cm，内径200μm，填料粒径5μm，再经分析柱分离，所述分析柱为C18色谱柱，长75μm，内径100mm，填料粒径3μm；流动相A选用0.1%甲酸溶液，流动相B选用0.1%甲酸乙腈水溶液，所述乙腈浓度为84%；梯度洗脱：0~12min：97%A，3%B；12~100min：72%A，28%B；100~120min：45%A，55%B；122~144min：2%A，98%B；144~160min：97%A，3%B；流速为300nL/min；上样量为4.5μg；
（2）使用LTQ-Orbitrap质谱仪的串联质谱纳升离子源进行分析检测：使用LTQ-Orbitrap质谱仪的串联质谱纳升离子源对步骤（1）分离所得的肽段产物的二级质谱数据进行分析检测，所述质谱条件为：将步骤（1）得到的肽段产物在LTQ Orbitrap XL上进行质谱扫描，将碰撞诱导解离的归一化碰撞能量设定为35，并在线性离子阱中以正常分辨率检测所得碎片，锁定质量设为445.120020，从300~1800m/z全范围扫描，时长160min；其中loading buffer为2%乙腈，HPLC级水中的0.1%甲酸；B 缓冲液为80% 乙腈，HPLC级水中的0.1%甲酸；
（3）利用Proteome Discover -1.4进行质谱数据分析，预筛选各种标准肉样中的特征多肽，质谱数据分析：利用Proteome Discover -1.4在鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉和羊肉数据库中搜索与肽段二级质谱数据匹配；搜索的参数设置为：母离子浓度公差为10ppm，Oxidationof Met设为可变修饰，允许漏切位点目数为2；根据质谱数据分析结果，选取每个物种中独有的多肽信息，获得相对的特异性多肽，取其中每组样品丰度最高的10个特征多肽作为预筛选特征多肽进行验证；
（4）通过高效液相色谱快速检测，验证预筛选得到多肽的响应强度，获得权利要求1所述的各种标准肉样特征性多肽信息；色谱条件：肽段混合物由自动进样器上样到预柱，所述预柱为EclipsePLus C18柱，2.1×50mm；流动相A选用0.1%甲酸乙腈水溶液，所述乙腈浓度为84%，流动相B选用0.1%甲酸溶液；梯度洗脱：0~7min：0%A，100%B；7~52.6min：50%A，50%B；53~58.2min：100%A，0%B；59~72min：0%A，100%B；流速为200nL/min；柱温35℃，上样量为20µL；质谱条件：离子源：ESI，+离子模式；气体温度：250°C，气体流速：12L/min；雾化压力：25psi；鞘气温度：350°C，鞘气流速：12L/min；毛细管电压：4000V；扫描模式：多反应监测模式，验证预筛选得到多肽的响应强度，获得权利要求1所述的标准肉样特征性多肽信息。
3.根据权利要求2所述标准肉样特征多肽的筛选方法，其特征在于，S1中步骤（4）所述脱盐为采用离心管式脱盐柱进行脱盐。
4.根据权利要求2所述标准肉样特征多肽的筛选方法，其特征在于，S1所述的前处理具体操作如下：
（1）提取肉样总蛋白：标准肉样去除脂肪和结缔组织，切碎，称取2g肉样，加入15~30mL2% SDS-PBS提取缓冲液，冰浴条件下匀浆9600~13400rpm 30s，重复3~5次，每次匀浆间隔30s，然后4000g，4℃离心 10min后，取上清液用纱布过滤，得到肌肉全蛋白溶液；
（2）全蛋白溶液浓度测定：将步骤（1）得到的肌肉全蛋白溶液用相同的提取缓冲液稀释5~15倍，采用BCA试剂盒，通过绘制标准样品的标准曲线来测定步骤（1）得到的肌肉全蛋白溶液浓度，取样品稀释液25µl及200µl工作液混合液于96孔板中，37℃孕育30min，冷却至室温后562nm波长测定样品蛋白浓度；
（3）全蛋白溶液消化：
①活化：将10KD 超滤管用超纯水活化；
②加样：取200µg蛋白量，根据步骤（2）测定的蛋白溶液浓度，计算取200µg蛋白的体积为X ml，然后补充Y mL 8M 尿素，50mM Tris-HCl缓冲液至200µL体系，即X+Y=200µL，到超滤管中，14000g 离心15min，弃废液；补加200µL 8M尿素，50mM Tris-HCl，14000g离心15min，弃废液，所需样品仍在超滤管内插管中；再次补加200µL 8M尿素，50mM Tris-HCl，14000g离心15min，弃废液，所需样品仍在超滤管内插管中；
③还原：加200µL8M 尿素，50mM Tris-HCl，往溶液中加入1M DTT 5µL，60℃加热60min，冷却至室温，14000g 离心15min，弃废液；
④烷基化：加200µL8M 尿素，50mM Tris-HCl，加入0.5M IAM 20µL，室温暗处孵育45min，14000g 离心15min，弃废液；加200µL的pH=7.8、50mM NH4HCO3，14000g 离心15min，弃废液，此步骤重复一次；
⑤酶切：更换新的超滤管底管，加200µL 50mM NH4HCO3，按胰蛋白酶与底物蛋白的量之比在1:50，加入40µL浓度为0.1µg/µL的胰蛋白酶液，37℃孵育16h；
⑥保存：孵育结束后，14000g 离心25min，补加50µL50mM NH4HCO3，14000g 离心25min，此时底管内即酶解后肽段，往溶液加甲酸至终浓度为0.2%，4℃保存或真空冷冻干燥成粉末4℃保存；
所述50mM Tris-HCl pH=8.0，所述NH4HCO3 pH=7.8；
（4）对消化得到的多肽溶液脱盐：
①向脱盐管内插管中加入100µL含0.2%FA的60%ACN溶液，5000g离心2min，弃废液；
②向脱盐管内插管中加入100µL含0.2%FA的超纯水，5000g离心2min，弃废液；
③将步骤（3）消化所得的未冻干待脱盐酶解多肽样品转移至脱盐管内插管中，或将步骤（3）消化所得冻干样品加100µL超纯水复溶，并转移至脱盐管内插管中，5000g离心2min，弃废液；
④向脱盐管内插管中加入300µL超纯水，5000g离心2min，弃废液，换底管；
⑤向脱盐管内插管中加入中加100µL含0.2%FA的60%ACN溶液，5000g离心2min，离心所得溶液即为脱盐完毕的肽段混合物样品，采用nanodrop微量分光光度计测定肽段混合物样品浓度，真空冷冻干燥后待用。
5.根据权利要求4所述标准肉样特征多肽的筛选方法，其特征在于， S1中的步骤（1）和步骤（2）中所述提取缓冲液为2%SDS-PBS缓冲液，配制方法为二水磷酸二氢钠 0.624g，十二水磷酸氢二钠 2.148g，SDS 20g，水 1L，70℃搅拌至澄清配制得； S1中的步骤（3）中所述超滤管为Ultracel-3超滤管，每管处理量0.5 mL，截留分子量≥10 kDa；胰蛋白酶，酶活力≥1645 U/mg； S1中的步骤（4）中所述脱盐管为Monaspin C18萃取头，填料为整体性硅胶，通孔孔径为5µm，介孔孔径为10nm，表面积为350m2/g,上样体积为50~800µL。
6.一种肉样掺假情况的定量检测方法，其特征在于，所述定量检测方法包括如下步骤：
S1：对待测肉样进行优化的前处理：
（1）肉样洗涤；
（2）提取待测肉样总蛋白，对提取到的全蛋白溶液进行蛋白浓度测定；
（3）利用胰蛋白酶对全蛋白溶液消化；
（4）对消化得到的多肽溶液脱盐；
S2：通过高效液相色谱-质谱联用定量检测混合肉样中存在的多肽：
利用三重四级杆高效液相色谱-质谱联用多反应监测模式快速检测出混合肉样中多肽的响应情况，并与权利要求1中所述的标准肉样的特征多肽进行比较，从而判定待测肉样信息，所述待测肉样信息包括：待测肉样是否包括其他动物源性的肉类；如待测肉样包含其他动物源性肉类，可检测出其他动物源性肉类的种类及含量；可检测出的动物源性肉类的种类为鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉和羊肉；所述待测肉样为生肉或熟肉或深加工肉制品，所述高效液相色谱-质谱联用操作如下：
液相色谱条件：
色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱，粒度2.7 μm，内径150×3.0 mm；
流速：0.3 mL/min；柱温：35°C；进样量：20 μL；
流动相：A：含0.1%甲酸的乙腈；B：0.1%甲酸水溶液，梯度淋洗如下：
质谱条件：
离子源：ESI，+离子模式；
气体温度：250°C，气体流速：12L/min；
雾化压力：25 psi；
鞘气温度：350°C，鞘气流速：12L/min；
毛细管电压：4000V；
扫描模式：多反应监测模式。
7.根据权利要求6所述的肉样掺假情况的定量检测方法，其特征在于，S2所述待测肉样为鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉中一种或几种混合的生肉或熟肉或深加工肉制品。
8.根据权利要求6所述的肉样掺假情况的定量检测方法，其特征在于，S1所述的前处理具体操作如下：
（1）肉样洗涤：用70%乙醇洗涤肉样30s，再用纯乙醇洗涤15s，接着用90%甲醇洗涤30s，最后用去离子水洗涤两次，每次30s；
（2）肉样总蛋白提取、总蛋白测定：取1g步骤（1）得到的肉类样品加入5mL蛋白提取液，冰上研磨匀浆，12000rpm 4℃离心10min；按照每100µL上清加入400µL -20℃预冷的丙酮，涡匀，-20℃放置过夜；取出后12000rpm 4℃离心10min，吹干沉淀，加入1mL尿素提取液复溶，采用BCA试剂盒，通过绘制标准样品的标准曲线来测定全蛋白溶液浓度，取样品25µl及200µl工作液混合液于96孔板中，37℃孕育30min，冷却至室温后562nm波长测定样品蛋白浓度；
（3）利用胰蛋白酶对全蛋白溶液消化：按照100 μg蛋白加入50μL含有10mM DTT 的100mM NH4HCO3，60℃水浴30min，冷却至室温，加入50μL含有55mM IAA 的100mM NH4HCO3，25℃暗中放置20min，按照100μg蛋白加入1μg 胰蛋白酶，37℃过夜，加入10μL 甲酸，待脱盐；
（4）肉样蛋白脱盐：将准备好的C18固相萃取小柱装好，用5mL甲醇活化，然后加入5mL 1%甲酸平衡，加入酶解后样品溶液，5mL含有1% 甲酸的5%甲醇洗涤，5mL含0.1% 甲酸的90%乙腈洗脱，加入25μL DMSO，氮吹吹干，用1mL含0.1% 甲酸的3%乙腈水复溶，待测。
9.根据权利要求8所述的肉样掺假情况的定量检测方法，其特征在于：所述蛋白提取液由7M尿素，2M硫脲，50mM DTT，质量体积百分浓度为4% 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸内盐配制；所述尿素提取液由1M尿素，用100mM NH4HCO3溶解得到；胰蛋白酶溶液浓度为0.1mg/mL，用25mM NH4HCO3溶解。
10.权利要求6至9中任一项所述的肉样掺假情况的定量检测方法在定量检测待测肉样掺假中的应用，其特征在于，所述待测肉样为生肉或熟肉或深加工肉制品；所述应用包括明确以下信息：待测肉样是否包括其他动物源性的肉类；如待测肉样包含其他动物源性肉类，可检测出其他动物源性肉类的种类及含量；可检测出的动物源性肉类的种类为鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉和羊肉。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述待测肉样为鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉、羊肉中一种或几种混合的生肉或熟肉或深加工肉制品。
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