CN107655985B - 一种基于lc-ms-ms技术的体内蛋白质营养的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于LC‑MS‑MS技术的体内蛋白质营养的评价方法。本发明评价方法，包含以下步骤：(1)采集不同肠段内容物，提取分离蛋白成分；(2)测定蛋白浓度；(3)质谱前处理：包括进行全蛋白溶液的消化和脱盐；(4)LC‑MS‑MS分析；(5)数据库搜索；(6)数据处理。本发明将蛋白质组学技术用来鉴定不同肠段内容中蛋白质及其消化产物，在此基础上，可以判断出不同肠段内容物蛋白质及其内容物的来源，通过生物信息学分析，可以更深入了解差异蛋白在机体内部的功能，其中与蛋白质消化代谢有关的酶的基因表达可能存在不同，为进一步科学评价蛋白质的消化利用提供科学依据。

Description

一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法
技术领域
本发明属于蛋白质组学技术领域，涉及一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法。
背景技术
目前较为权威的体内蛋白质消化率测定的方法是粪氮平衡实验。其原理是膳食蛋白通过食道进入胃肠道，胃中胃蛋白酶将膳食蛋白进行消化，多肽类进入小肠段(十二指肠、空肠和回肠)由胰蛋白酶和糜蛋白酶作用，最后，少量的微生物细胞、肠内粘膜脱落的粪代谢氮和未被完全消化吸收的蛋白质经过结肠时，以粪便的形式排出体外。摄入氮和粪氮的差值占摄入氮的比例即为表观消化率。尽管会添加5％高消化性酪蛋白后再测定粪代谢氮来校正表观消化率从而得到真消化率，但是这种方法并不能如实的反映体内的蛋白质消化吸收情况。这种体内消化率测定方法操作复杂、时间长，且实验动物对外界环境的要求较高。传统方法只知道摄入氮和排出氮，缺乏对机体内部的消化吸收代谢情况的深入了解，并不能如实的反映机体内的蛋白消化。因此，有必要建立一套能够如实评价膳食蛋白体内消化的新方法。
蛋白质组学是应用蛋白质分离、鉴定和定量的技术研究蛋白质组的一门学科，基于质谱的蛋白质组学技术更是广泛应用于生命科学领域。生物质谱技术(MassSpectrometry)是蛋白组学研究中的核心技术，是进行蛋白质鉴定的基本手段，能准确的测量肽和蛋白质的相对分子质量、氨基酸序列及翻译后的修饰。目前来讲，液相色谱-质谱联用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)技术，已经成为蛋白质高通量分析的主流方法。通常LC与MS是串联的，通过LC分离的肽段在进入MS之前，先经过外加电场使肽段离子化带上电荷。离子化的肽段进入一级MS，确定肽段的精确分子质量、所带电荷数、肽段丰度(即在质谱上的信号强度)等信息后进入二级质谱，通过Mascot数据库搜索、序列比对推断出肽段的氨基酸组成和排列顺序。通过Maxquant软件进行比对数据库，可比对三种来源(宿主、膳食和微生物)的蛋白库，收集对蛋白质在体内消化吸收转化的全部信息。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法，包含以下步骤：
(1)采集不同肠段内容物，提取分离蛋白成分；
(2)测定蛋白浓度；
(3)质谱前处理：包括进行全蛋白溶液的消化和脱盐；
(4)LC-MS-MS分析：将上一步经消化和脱盐吹干的样品通过使用纳升液质系统的反相液相色谱得到的肽段产物，并通过使用LTQ-Orbitrap质谱仪的串联质谱法通过纳升离子源进行分析；
(5)数据库搜索：使用MaxQuant_1.5.8.3软件分别搜索来自30个单独的鸟枪法LC-MS/MS运行的原始光谱文件；
(6)数据处理：包括通过对各个肠段内容物的蛋白进行三方面搜库，具体搜索来源为膳食蛋白，宿主和肠道微生物的蛋白库，对三个来源的蛋白数据进行分析，能够明确知道以下信息：①膳食蛋白在体内的消化情况，在哪个肠段转变成哪种物质，以及鉴定出的蛋白或肽段种类和丰度；②宿主在膳食蛋白的诱导下分泌出了哪些蛋白，参与哪些生物学进程，对机体健康有何种作用；③肠道微生物会对进入大肠的膳食蛋白进行响应，从而代谢蛋白分泌微生物蛋白。
其中所述的不同肠段优选十二指肠、空肠、盲肠和/或结肠。
作为本发明所述的评价方法的优选，采用BCA试剂盒测定不同肠段内容物的蛋白浓度。
作为本发明所述的评价方法的优选，所述的全蛋白溶液的消化包括以下步骤：
(1)将10KD超滤管用超纯水活化；
(2)取200μg蛋白量，计算取200μg蛋白的体积为X ml，然后补充Y ml 8M尿素，50mMTris-HCl(pH8.0)至200μl体系(即X+Y＝200μl)到超滤管中，14000×g离心15min；
(3)补加200μl 8M尿素，50mM Tris-HCl(pH8.0)，14000×g离心15min；
(4)加200μl 8M尿素，50mM Tris-HCl(pH8.0)，往溶液中加入1M DTT 5μl，60℃加热60min，冷却至室温，14000×g离心15min；
(5)加200μl 8M尿素，50mM Tris-HCl(pH8.0)，加入0.5M IAM 20ul，室温暗处孵育45min，14000×g离心15min；
(6)加200μl 50mM NH4HCO3(pH7.8)，14000×g离心15min，重复一次；
(7)换新的超滤管底管，加200μl 50mM NH4HCO3(pH7.8)，按Trypsin酶与底物蛋白的量之比在1:50，加入酶液(即加入40μl)，37℃孵育16h(过夜)；
(8)孵育结束后，14000×g离心25min，补加50μl，50mM NH4HCO3(pH7.8)，14000×g离心25min，底管内即酶解后肽段，往溶液加甲酸至终浓度为0.2％。
(9)将样品转移到1.5ml离心管中，旋转吹干仪吹干即可。
作为本发明所述的评价方法的优选，所述的全蛋白溶液的脱盐包括以下步骤：
(1)将吹干后的样品用50μl B液复溶混匀；
(2)用10μl A液活化脱盐柱(Ziptip C18柱)，重复5次；
(3)再用10μl B液活化脱盐柱(Ziptip C18柱)，重复10次；
(4)吸取10μl(1)中的样品至活化后的柱子中；
(5)用10μl B液对脱盐柱进行脱盐；
(6)用10μl A液对脱盐柱进行洗脱样品；
(7)用Nanodrop微量分光光度计对样品肽段含量进行定量。
(8)调平质量：通过选取一个蛋白总量保证每个离心管的蛋白总量一样，根据浓度，吸取一定量的体积到新的离心管。
(9)旋转吹干仪吹干备用；
其中，A液为含0.2％甲酸的60％乙腈溶液；B液含0.2％甲酸的超纯水。
作为本发明所述的评价方法的优选，所述的LC-MS-MS分析包括：将脱盐处理吹干的样品离心管用10μl含0.2％甲酸的超纯水进行复溶，复溶后转移到内插管中，标记好名称后进质谱仪上样。通过使用纳升液质系统的反相液相色谱得到的肽段产物，并使用LTQ-Orbitrap质谱仪的串联质谱纳升离子源进行分析。具体步骤如下，肽样品用0.1％的甲酸酸化，之后通过纳升液质系统的自动进样器将样液注入系统，之后泵入loading buffer，流动速度为4μl/min，样品随loading buffer自动加载到配备有纳米捕获柱的纳升液质系统；8min后，换用3％到55％的B缓冲液梯度洗脱和分离肽段，缓冲液流速为300nL/min，洗脱时间为112min；换用55％到98％的B缓冲液进一步梯度洗脱剩余的肽段，洗脱时间为5min；分离后的肽段在LTQ OrbitrapXL上进行质谱扫描，将碰撞诱导解离的归一化碰撞能量设定为35，并在线性离子阱中以正常分辨率检测所得碎片，锁定质量设为445.120020。其中loading buffer为2％乙腈,HPLC级水中的0.1％甲酸；所述的B缓冲液为80％乙腈,HPLC级水中的0.1％甲酸。
作为本发明所述的评价方法的优选，所述的数据库搜索中使用MaxQuant_1.5.8.3软件的搜索参数设为：
Figure BDA0001389461120000031
Figure BDA0001389461120000041
作为本发明所述的评价方法的优选，所述的膳食蛋白包括:肉蛋白、乳蛋白、植物蛋白；所述的肉蛋白包括源自牛肉、猪肉、羊肉、鱼肉、鸡肉、鸭肉的蛋白；所述的乳蛋白为酪蛋白；所述的植物蛋白包括源自大豆、大麦、小麦、高粱、水稻、玉米的蛋白。
作为本发明所述的评价方法的优选，所述的数据处理还包括根据组间t-test进行统计分析，得到差异蛋白，进而通过生信分析得到差异蛋白参与的生物学进程。
有益效果：
本发明的创新之处在于将蛋白质组学技术用来鉴定不同肠段内容中蛋白质及其消化产物，在此基础上，可以判断出不同肠段内容物蛋白质及其内容物的来源(膳食、宿主或肠道微生物)，通过生物信息学分析，可以更深入了解差异蛋白在机体内部的功能，其中与蛋白质消化代谢有关的酶的基因表达可能存在不同，为进一步科学评价蛋白质的消化利用提供科学依据。该方法可延伸用于粪便中蛋白质及其消化产物的分析，简化蛋白质消化利用率的评价程序。
附图说明
图1体内蛋白质消化吸收情况
图2高盐和低盐膳食组差异蛋白的生物信息学功能分析图
A.差异蛋白的GO分析，GO分析包括参与的生物过程、细胞组成和分子功能。
B.差异蛋白的KEGG分析，主要是功能基因参与的代谢通路分析。
C.差异蛋白互作分析(PPI)，主要是蛋白质之间的交互作用。
具体实施方式
一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的评价方法，包含以下步骤：
步骤一：采集不同肠段(十二指肠、空肠、盲肠、结肠)内容物，取W(mg)内容物到2ml研磨管(3-5颗镐珠)，加入RIPA裂解液(强)(1:100,W/V,碧云天)，磷酸酶抑制剂(1％,v/v,Sigma,P8340)和蛋白酶抑制剂(1％,v/v,Sigma,P2850)，放入Precellys均质器震荡(8500rpm,60s,间隔30s,循环3次),震荡后放入已4度预冷的离心机中,14000g离心15min，离心后取上清。为得到更澄清的蛋白样品，转移上清到新离心管中，再次离心(3500rpm,5min)取上清即蛋白样品置于-80℃备用。
步骤二：采用BCA试剂盒(Bio-Rad,USA)测定不同肠段内容物的蛋白浓度。
步骤三：质谱前处理步骤(全蛋白溶液消化、脱盐)：
全蛋白溶液消化：
一、试剂：
1.变性缓冲液：8M尿素，50mM Tris-HCl(pH8.0)
2. 1M DTT(二硫苏糖醇,Sigma,646563-10X.5ML)
3. 0.5M IAM(碘乙酰胺,Sigma,I1149-5G)
4. 50mM NH4HCO3(pH7.8)(碳酸氢铵,Sigma,A6141-25G)
5.Trypsin酶(0.1μg/μl,200ul buffer加入到酶的玻璃瓶中)(Promega,V5111)
6. 10KD超滤管
二、操作步骤：
1.将10KD超滤管用超纯水活化，即加入200μl超纯水，14000×g离心15min(温度室温即可)；
2.取200μg蛋白量，计算取200μg蛋白的体积为X ml，然后补充Y ml 8M尿素，50mMTris-HCl(pH8.0)至200μl体系(即X+Y＝200μl)到超滤管中，14000×g离心15min；
3.补加200μl 8M尿素，50mM Tris-HCl(pH8.0)，14000×g离心15min；
4.加200μl 8M尿素，50mM Tris-HCl(pH8.0)，往溶液中加入1M DTT 5μl，60℃加热60min，冷却至室温，14000×g离心15min；
5.加200μl 8M尿素，50mM Tris-HCl(pH8.0)，加入0.5M IAM 20ul，室温暗处孵育45min，14000×g离心15min；
6.加200μl 50mM NH4HCO3(pH7.8)，14000×g离心15min，重复一次；
7.换新的超滤管底管，加200μl 50mM NH4HCO3(pH7.8)，按Trypsin酶与底物蛋白的量之比在1:50，加入酶液(即加入40μl)，37℃孵育16Hr(过夜)；
8.孵育结束后，14000×g离心25min，补加50μl，50mM NH4HCO3(pH7.8)，14000×g离心25min，底管内即酶解后肽段，往溶液加甲酸至终浓度为0.2％。
9.将样品转移到1.5ml离心管中，旋转吹干仪吹干即可。
全蛋白溶液脱盐：
一、试剂：
1.A液(含0.2％FA的60％ACN溶液)
2.B液含0.2％FA的超纯水
3.Ziptip脱盐柱(10μl)(Merck Millipore,ZTC18S096)
FA：Formid Acid甲酸，色谱级
ACN：Acetonitrile乙腈，色谱级
二、操作步骤
1.将吹干后的样品用50μl B液复溶混匀；
2.用10μl A液活化脱盐柱(Ziptip C18柱)，重复5次；
3.再用10μl B液活化脱盐柱(Ziptip C18柱)，重复10次；
4.吸取10μl(1)中的样品至活化后的柱子中；
5.用10μl B液对脱盐柱进行脱盐；
6.用10μl A液对脱盐柱进行洗脱样品；
7.用Nanodrop微量分光光度计对样品肽段含量进行定量。
8.调平质量：通过选取一个蛋白总量保证每个离心管的蛋白总量一样，根据浓度，吸取一定量的体积到新的离心管。
9.旋转吹干仪吹干备用。
三、注意事项
1.先A液再B液活化脱盐柱，保证上样时柱子是水相。
2.上样时可能因为浓度过高吸取速度很慢，要耐心。
3.水相洗盐，有机相洗蛋白。
步骤四(LC-MS-MS)：
将吹干的样品离心管用10μl B液进行复融，复融后转移到内插管中，标记好名称后进质谱仪上样。通过使用纳米液质系统(DIONEX Thermo Scientific)的反相液相色谱得到的肽段产物，并通过使用LTQ-Orbitrap质谱仪(Thermo Scientific)的串联质谱法通过纳升离子源进行分析。肽样品用0.1％的甲酸(FA)酸化，并以在loading buffer(2％乙腈,HPLC级水中的0.1％甲酸)中4μl/min的速度自动加载到配备有纳米捕获柱的纳米液质系统(Acclaim PepMap100C18,75μm×2cm,3μm,
Figure BDA0001389461120000072
Thermo Scientific)。8min后，肽段在分析柱(Acclaim PepMap RSLC,C18,75μm×15cm,3μm,
Figure BDA0001389461120000073
Thermo Scientific)上以300nL/min的流速通过B缓冲液(80％乙腈,HPLC级水中的0.1％甲酸)的3％到55％的梯度超过112min后被洗脱和分离。剩余的肽段以通过B缓冲液的55％到98％短梯度5min来进行分离。分离后的肽段在LTQ OrbitrapXL中进行分析。从高分辨率质谱扫描，如果超过强度至少为5000个计数，并且如果它们至少带有双重电荷，则选择十个最强的肽离子用于线性离子阱中的片段分析。将碰撞诱导解离(CID)的归一化碰撞能量设定为35，并在线性离子阱中以正常分辨率检测所得碎片。锁定质量选项被激活，质量为445.120020的背景信号用作锁定质量。通过动态排除将每个选择碎片的离子排除60秒。
步骤五(数据库搜索)：
使用MaxQuant_1.5.8.3软件(马克斯·普朗克生物化学研究所)分别搜索来自30个单独的鸟枪法LC-MS/MS运行的原始光谱文件。其中MaxQuant软件的搜索参数设为：
Figure BDA0001389461120000071
Figure BDA0001389461120000081
Figure BDA0001389461120000082
Figure BDA0001389461120000091
Figure BDA0001389461120000101
步骤六(数据处理)：
通过对四个肠段内容物的蛋白进行三方面搜库，具体搜索来源为膳食蛋白，宿主和肠道微生物的蛋白库，对三个来源的蛋白数据进行分析，可明确知道以下信息：①膳食蛋白在体内的消化情况，在哪个肠段转变成哪个物质，以及鉴定出的蛋白(肽段)种类和丰度；②宿主在膳食蛋白的诱导下分泌出了哪些蛋白，参与哪些生物学进程，对机体健康有何种作用；③肠道微生物会对进入大肠的膳食蛋白进行响应，从而代谢蛋白分泌微生物蛋白。另外，还可根据组间t-test进行统计分析，得到差异蛋白，进而通过生信分析得到差异蛋白参与的生物学进程。
实施例1
以C57BL/6J小鼠为动物模型，对其进行低盐(0.25％)和高盐(3.5％)膳食的饲喂，每组有5只小鼠，实验周期为8周。实验结束后断颈处死后采集十二指肠、空肠、盲肠和结肠内容物，置于2ml冻存管并放入液氮中速冻，转移到-80℃后备用。10只小鼠，四种肠段内容物，共计40个样品。通过加入RIPA裂解液、磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂进行蛋白提取(方法同上)。提取蛋白质后用BCA试剂盒进行浓度测定，按操作步骤经过消化和脱盐，进行质量的调整。本实验选取的每个离心管中的蛋白总量为1.5μg。经过LC-MS-MS和数据库搜索，得到四个肠段三个来源的蛋白质鉴定结果(图1)。
在膳食蛋白来源方面，通过搜索Bos taurus(酪蛋白)数据库，从所有肠道内容物中鉴定出了总共452个蛋白质组。通过重复性和匹配的过滤后，所测肽段序列可以匹配到54个蛋白质。其中大多数是酪蛋白激酶和其他酶类，仅能在LSD组检测出少量的β-乳球蛋白(片段)是属于酪蛋白的成分，两组之间基于饮食的蛋白质片段的组成差异无统计学意义。因此可以看出酪蛋白是一种消化吸收性能较好的蛋白，极易在小肠段被胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶消化，进而被肠段吸收。因此通过质谱的鉴定，可以明确了解出蛋白质在体内的消化过程。
在宿主蛋白来源方面，通过搜索Mus musculus(小鼠)数据库，从低盐膳食组和高盐膳食组的四个肠道内容物中鉴定出了179和149个特有的肽段序列，在十二指肠两组之间共有20个蛋白质的含量有差异，且在高盐膳食组中是低丰度表达。由图中可以看出，基于宿主的肽段的数量由十二指肠到盲肠是减少，盲肠到结肠是增加的趋势。20种差异蛋白种部分是消化酶，其中包括糜蛋白酶原B、胰腺三酰甘油脂肪酶前体、羧肽酶A1前体和羧肽酶B1。这些结果表明，高盐膳食可能会抑制消化酶的分泌，从而导致在高盐膳食组蛋白质的消化程度不高。除消化酶之外还确定了几种细胞质成分，包括α-肌动蛋白，原肌球蛋白α-1链，钙粘蛋白17和囊泡蛋白VAT-1同源物，其中钙粘蛋白17与钙离子结合有关，囊泡蛋白VAT-1同源物与氧化还原酶活性相关，而磷酸甘油酸变位酶1涉及糖酵解过程。使用OmicsBean组学分析系统(http://www.omicsbean.com:88/)中的生物信息学工具对差异蛋白的数据进行分析，以获取更多与参与途径相关的信息。生物信息学分析主要包括三个方面，主要是GO(Gene Ontology)分析，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析和PPI(protein-protein interaction)分析。在GO分析结果中，大多数鉴定的蛋白质被鉴定参与了代谢过程，特别是在吡啶和辅酶代谢过程中。同时属于细胞器和细胞外的成分之一。在分子功能方面，大多数的蛋白质参与酶活性，包括氧化还原酶，苹果酸脱氢酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶和磷酸丙糖异构酶(图2A)。在KEGG分析结果中，蛋白质涉及的活性途径是与分泌和代谢相关的途径，包括蛋白质消化、吸收和胰腺分泌(图2B)。结果表明，高盐饮食可能通过抑制胰蛋白酶的分泌而对胰腺分泌具有抑制作用。为了进一步探索识别蛋白质的更多相关信息，进行蛋白质数据的更全面的生物信息学分析以整合蛋白质-蛋白质相互作用网络。7个蛋白质被认为是生物相互作用网络中的关键节点(图2C)。胰凝乳蛋白酶样弹性蛋白酶家族成员2A前体(P05208)和木瓜霉素(Q9E205)与胰腺分泌，蛋白质消化和吸收高度相关。由Sdha和Tpi1编码的蛋白质参与许多代谢过程，包括琥珀酸代谢过程，糖异生和戊糖磷酸支路过程(图2C)。
在微生物蛋白来源方面，通过搜索Bacteria(自建)数据库，相关数据库建立是根据文献从Uniprot下载集合得到。共有63个肽段被明确鉴定和定量，但其中对应的18个蛋白质未被注名。蛋白质均由肠道微生物代谢糖类和蛋白质而分泌。在结肠内容物中，有17种微生物蛋白质在两组之间是常见的，其中低盐膳食组与高盐膳食组相比有五种蛋白质是高丰度表达的，包括胞苷酸激酶，触发因子，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，转运蛋白和十一异戊酸二磷酸酶，这些蛋白分别由极小阿托波氏菌，嗜酸乳杆菌，短乳杆菌，厌食菌，无乳链球菌分泌。胞苷酸激酶参与嘧啶代谢，ATP结合，转移酶和胞苷酸激酶活性。触发因子与蛋白质转运有关，蛋白质运输通过保持新合成的分泌和非分泌蛋白质作为分子伴侣。此外，触发因子涉及细胞周期，细胞分裂，蛋白质折叠和肽基-脯氨酰顺反异构酶活性，从而调节其活性。6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶参与磷酸戊糖途径。转运蛋白是确保在生物体内转移材料的功能的蛋白质，在钠分子转运方面发挥着重要的作用。因此，高浓度的钠可能导致转运蛋白的高表达。十一异戊酸二磷酸酶参与去磷酸化，肽聚糖生物合成和细胞形状的调节。其中还有两种蛋白质(乙酰谷氨酸激酶和PBSX噬菌体含锰过氧化氢酶)在低盐膳食组中具有相对较高的丰度，由梭菌和枯草芽孢杆菌BEST7613分泌。乙酰谷氨酸激酶参与精氨酸和脯氨酸生物合成和ATP结合，其催化N-乙酰基-L-谷氨酸的ATP依赖性磷酸化。PBSX噬菌体含锰过氧化氢酶由枯草芽孢杆菌产生，细胞处于厌氧环境时细胞内过氧化氢酶活性降低，而在好氧条件下，从培养基中除去硫代硫酸盐或添加锰时，会有增加其活性的趋势。

Claims (8)

1.一种基于LC-MS-MS技术的体内蛋白质营养的测定方法，其特征在于包含以下步骤：
（1）采集不同肠段内容物，提取分离蛋白成分；
（2）测定蛋白浓度；
（3）质谱前处理：包括进行全蛋白溶液的消化和脱盐吹干；
（4）LC-MS-MS分析：将上一步经消化和脱盐吹干的样品通过使用纳米液质系统的反相液相色谱得到的肽段产物，并通过使用LTQ-Orbitrap质谱仪的串联质谱法通过纳升离子源进行分析，包括：将脱盐处理吹干的样品离心管用10μl含0.2%甲酸的超纯水进行复溶，复溶后转移到内插管中，标记好名称后进质谱仪上样，通过使用纳升液质系统的反相液相色谱得到的肽段产物，并使用LTQ-Orbitrap质谱仪的串联质谱纳升离子源进行分析，具体步骤如下，肽样品用0.1%的甲酸酸化，之后通过纳升液质系统的自动进样器将样液注入系统，之后泵入loading buffer，流动速度为4μl/min，样品随loading buffer自动加载到配备有纳米捕获柱的纳升液质系统；8min后，换用3%到55%的B 缓冲液梯度洗脱和分离肽段，缓冲液流速为300nL/min，洗脱时间为112min；换用55%到98%的B缓冲液进一步梯度洗脱剩余的肽段，洗脱时间为5min；分离后的肽段在LTQ OrbitrapXL上进行质谱扫描，将碰撞诱导解离的归一化碰撞能量设定为35，并在线性离子阱中以正常分辨率检测所得碎片，锁定质量设为445.120020；其中loading buffer为2%乙腈, HPLC级水中的0.1%甲酸；所述的B 缓冲液为80% 乙腈, HPLC级水中的0.1%甲酸；
（5）数据库搜索：使用MaxQuant_1.5.8.3 软件分别搜索来自30个单独的鸟枪法LC-MS/MS运行的原始光谱文件；
（6）数据处理 ：包括通过对各个肠段内容物的蛋白进行三方面搜库，具体搜索来源为膳食蛋白，宿主和肠道微生物的蛋白库，对三个来源的蛋白数据进行分析，能够明确知道以下信息：①膳食蛋白在体内的消化情况，在哪个肠段转变成哪种物质，以及鉴定出的蛋白或肽段种类和丰度；②宿主在膳食蛋白的诱导下分泌出了哪些蛋白，参与哪些生物学进程，对机体健康有何种作用；③肠道微生物会对进入大肠的膳食蛋白进行响应，从而代谢蛋白分泌微生物蛋白。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的不同肠段选自十二指肠、空肠、盲肠和/或结肠。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于采用BCA试剂盒测定不同肠段内容物的蛋白浓度。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的全蛋白溶液的消化包括以下步骤：
（1）将10KD 超滤管用超纯水活化；
（2）取200μg蛋白量，计算取200μg蛋白的体积为X ml，然后补充Y ml 8M 尿素50mMTris-HCl pH8.0 至200μl体系即X+Y=200μl到超滤管中，14000×g 离心15min；
（3）补加200μl 8M尿素，50mM Tris-HCl pH8.0，14000×g 离心15min；
（4）加200μl 8M 尿素，50mM Tris-HCl pH8.0，往溶液中加入1M DTT 5μl，60℃加热60min，冷却至室温，14000×g 离心15min；
（5）加200μl 8M 尿素，50mM Tris-HCl pH8.0，加入0.5M IAM 20ul，室温暗处孵育45min，14000×g 离心15min；
（6）加200μl 50mM NH4HCO3pH7.8，14000×g 离心15min，重复一次；
（7）换新的超滤管底管，加200μl 50mM NH4HCO3pH7.8，按Trypsin 酶与底物蛋白的量之比在1:50，加入40μl酶液，37℃孵育14-18h;
（8）孵育结束后，14000×g 离心25min，补加50μl，50mM NH4HCO3pH7.8，14000×g 离心25min，底管内即酶解后肽段，往溶液加甲酸至终浓度为0.2%；
（9）将样品转移到1.5ml 离心管中，旋转吹干仪吹干即可。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的全蛋白溶液的脱盐包括以下步骤：
（1）将吹干后的样品用50μl B液复溶混匀；
（2）用10μl A液活化脱盐柱Ziptip C18柱，重复5次；
（3）再用10μl B液活化脱盐柱Ziptip C18柱，重复10次；
（4）吸取10μl步骤（1）中的样品至活化后的柱子中；
（5）用10μl B液对脱盐柱进行脱盐；
（6）用10μl A液对脱盐柱进行洗脱样品；
（7）用Nanodrop微量分光光度计对样品肽段含量进行定量；
（8）调平质量：通过选取一个蛋白总量保证每个离心管的蛋白总量一样，根据浓度，吸取一定量的体积到新的离心管；
（9）旋转吹干仪吹干备用；
其中，A液 为含0.2%甲酸的60%乙腈溶液；B液 含0.2%甲酸的超纯水。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的数据库搜索中使用MaxQuant_1.5.8.3 软件的搜索参数设为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的膳食蛋白包括: 肉蛋白、乳蛋白、植物蛋白；所述的肉蛋白包括源自牛肉、猪肉、羊肉、鱼肉、鸡肉、鸭肉的蛋白；所述的乳蛋白为酪蛋白；所述的植物蛋白包括源自大豆、大麦、小麦、高粱、水稻、玉米的蛋白。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的数据处理还包括根据组间t-test进行统计分析，得到差异蛋白，进而通过生信分析得到差异蛋白参与的生物学进程。
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