CN111238890B - 基于离心法的液基制片技术用于液基真菌的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种基于离心法的液基制片技术用于液基真菌的检测方法，所述基于离心法的液基制片技术包括以下步骤：向含有真菌的标本的标本瓶内加入专用消化液，将瓶底呈倒锥体形的标本瓶放入振荡器振荡，静置，尖端朝下，比重较大的真菌沉淀于尖底部，振荡后用一次性移液管插入标本瓶底部，吸取1‑2mL标本，加入至制片仓内，制片仓安装在装有载玻片的制片架上，将制片架悬挂入离心式液基细胞制片机内，离心，制成液基薄片。本发明制备方法简单，制得的真菌薄片清晰可观察，实现对真菌的精确检测，有效的解决了现有技术中所存在的操作繁琐、过程耗时长，所需试剂多等问题。
Description
技术领域
本发明涉及医学化验技术领域，具体涉及一种基于离心法的液基制片技术用于液基真菌的检测方法。
背景技术
真菌属于真核生物，没有质体，营养方式为吸收，无吞噬作用。细胞壁含有甲壳质和β-葡聚糖。可引起人类，动物的疾病，称为真菌病，还可引起植物的疾病、人类过敏性疾病和真菌毒素中毒症。真菌侵犯人体常继发于其他疾患，如恶性肿瘤、糖尿病等慢性消耗性疾病；大剤量X线照射；免疫抑制剂等导致免疫功能和抵抗力低下；大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染真菌；另外器官移植、导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为真菌的入侵提供了条件。近年来由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现，使原来不致病的真菌转为致病真菌。因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。
真菌分为浅部真菌和深部真菌。浅部真菌：主要侵犯机体皮肤，寄生和腐生于表皮，毛发和甲板的角质组织中，引起浅部真菌病，简称癣病。临床最多见的浅部真菌病有：体癣、股癣、手癣和足癣。
真菌感染在常用的检测方法包括：直接镜检法(如KOH涂片或乳酸酚棉蓝涂片)及染色镜检法。其中，直接镜检法缺点在于阳性率较低，阴性结果也不能排除诊断，背景杂乱，灵敏度低，漏检率高，对操作人员专业识别能力要求高。一般的染色镜检法包括：革兰染色、吉姆萨染色、PAS法、六胺银法(GMS)、银氨液浸染法(G-S)、Gridley染色法、粘蛋白卡红(Mayer’s Mucicarmin stain)染色法、巴氏染色法等。这几种特殊染色法优点：在控制好染色细节的前提下，可染出漂亮的真菌形态，容易辨识。
发明内容
本发明提供一种基于离心法的液基制片技术用于液基真菌的检测方法，其目的在于，制备方法简单，制得的真菌薄片清晰可观察，实现对真菌的精确检测，有效的解决了现有技术中所存在的操作繁琐、过程耗时长，所需试剂多等问题。
本发明提供一种基于离心法的液基制片技术用于液基真菌的检测方法，所述基于离心法的液基制片技术包括以下步骤：向含有真菌的标本的标本瓶内加入专用消化液，将瓶底呈倒锥体形的标本瓶放入振荡器振荡，静置，尖端朝下，比重较大的真菌沉淀于尖底部，振荡后用一次性移液管插入标本瓶底部，吸取1-2mL标本，加入至制片仓内，制片仓安装在装有载玻片的制片架上，将制片架悬挂入离心式液基细胞制片机内，离心，制成液基薄片；
所述专用消化液由以下原料制备而成：pH为8的PBS缓冲液、胰蛋白酶、EDTA二钠、碳酸氢钠和二硫苏糖醇；
所述专用消化液的制备方法：将胰蛋白酶、EDTA二钠、二硫苏糖醇溶于pH为8的PBS缓冲液中，加入碳酸氢钠调节pH为8.3，搅拌溶解，制得专用消化液。
作为本发明进一步的改进，所述专用消化液由以下原料按重量份制备而成：pH为8的PBS缓冲液1000-1200份、胰蛋白酶30-100份、EDTA二钠10-30份、碳酸氢钠适量和二硫苏糖醇10-20份。
作为本发明进一步的改进，所述专用消化液由以下原料按重量份制备而成：pH为8的PBS缓冲液1100份、胰蛋白酶70份、EDTA二钠20份、碳酸氢钠适量和二硫苏糖醇15份。
作为本发明进一步的改进，所述标本和专用消化液的体积比为1:1。
作为本发明进一步的改进，所述振荡时间为5-10min(，所述静置时间为10-30min；所述离心转速为800-1000r/min，离心时间为3-5min。
作为本发明进一步的改进，所述检测方法为在所述液基薄片制备好后，进行固定、染色、封片，置于荧光显微镜下进行镜检。
作为本发明进一步的改进，所述染色步骤采用专用染色剂，所述专用染色剂由以下原料按重量份制备而成：苯酚5-12份、乙二醇20-40份、PBS缓冲液100-200份、藻蓝蛋白或藻红蛋白30-50份和去离子水100-200份。
本发明进一步保护一种上述的专用消化液。
本发明进一步保护一种上述的专用染色剂。
本发明具有如下有益效果：
白带是由阴道黏膜渗出物、宫颈腺体分泌物及子宫内膜腺体分泌物混合而成，内含阴道上皮脱落细胞、白细胞、乳酸杆菌。本发明采用专用消化液对妇科真菌标本进行消化酶解，其中向消化液中加入二硫苏糖醇用于降低二硫键的作用，提高蛋白酶解后的溶解性；
本发明专用染色剂通过添加荧光性极好的藻胆蛋白(藻蓝蛋白或者藻红蛋白)，是一种具有强烈荧光性的红色、紫罗蓝色和蓝色蛋白质，来自于蓝藻或红藻等藻类物质，天然无毒害，比普通染色剂的荧光效果更好，且更安全，不会致癌，适合真菌检测的染色；
本发明基于离心法的液基制片技术，采用离心法结合振荡法，将真菌分离不黏连，成单个的真菌细胞，消化后将白带中大部分人体细胞以及其他细菌酶解，薄层过滤后仅仅留下真菌细胞，留在薄片上，振荡后使得细胞呈悬浮状态，采用染色剂染色后细胞清晰可辨，方便显微镜观察。
本发明制备方法简单，制得的真菌薄片清晰可观察，实现对真菌的精确检测，有效的解决了现有技术中所存在的操作繁琐、过程耗时长，所需试剂多等问题。
附图说明
图1为本发明实施例基于离心法的液基制片技术的工艺流程图；
图2为本发明实施例检测方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种基于离心法的液基制片技术用于液基真菌的检测方法，包括以下步骤：向含有真菌的标本的标本瓶内加入专用消化液，标本和专用消化液的体积比为1:1，将瓶底呈倒锥体形的标本瓶放入振荡器振荡5min，静置10min，尖端朝下，比重较大的真菌沉淀于尖底部，振荡5min，用一次性移液管插入标本瓶底部，吸取1mL标本，加入至制片仓内，制片仓安装在装有载玻片的制片架上，将制片架悬挂入离心式液基细胞制片机内，800r/min离心3min，制成液基薄片。在所述液基薄片制备好后，进行固定、染色、封片，置于荧光显微镜下进行镜检。
专用消化液由以下原料按重量份制备而成：pH为8的PBS缓冲液1000份、胰蛋白酶30份、EDTA二钠10份、碳酸氢钠适量和二硫苏糖醇10份。
专用消化液的制备方法：将胰蛋白酶、EDTA二钠、二硫苏糖醇溶于pH为8的PBS缓冲液中，加入碳酸氢钠调节pH为8.3，搅拌溶解，制得专用消化液。
染色步骤采用专用染色剂，所述专用染色剂由以下原料按重量份制备而成：苯酚5份、乙二醇20份、PBS缓冲液100份、藻蓝蛋白30份和去离子水100份。
专用染色剂的制备方法：将苯酚、乙二醇、PBS缓冲液、藻蓝蛋白和去离子水混合，搅拌均匀，制得专用染色剂。
实施例2
一种基于离心法的液基制片技术用于液基真菌的检测方法，包括以下步骤：向含有真菌的标本的标本瓶内加入专用消化液，标本和专用消化液的体积比为1:1，将瓶底呈倒锥体形的标本瓶放入振荡器振荡10min，静置30min，尖端朝下，比重较大的真菌沉淀于尖底部，振荡10min，用一次性移液管插入标本瓶底部，吸取2mL标本，加入至制片仓内，制片仓安装在装有载玻片的制片架上，将制片架悬挂入离心式液基细胞制片机内，1000r/min离心5min，制成液基薄片；在所述液基薄片制备好后，进行固定、染色、封片，置于荧光显微镜下进行镜检。
专用消化液由以下原料按重量份制备而成：pH为8的PBS缓冲液1200份、胰蛋白酶100份、EDTA二钠30份、碳酸氢钠适量和二硫苏糖醇20份。
专用消化液的制备方法：将胰蛋白酶、EDTA二钠、二硫苏糖醇溶于pH为8的PBS缓冲液中，加入碳酸氢钠调节pH为8.3，搅拌溶解，制得专用消化液。
染色步骤采用专用染色剂，所述专用染色剂由以下原料按重量份制备而成：苯酚12份、乙二醇40份、PBS缓冲液200份、藻红蛋白50份和去离子水200份。
专用染色剂的制备方法：将苯酚、乙二醇、PBS缓冲液、藻红蛋白和去离子水混合，搅拌均匀，制得专用染色剂。
实施例3
一种基于离心法的液基制片技术用于液基真菌的检测方法，包括以下步骤：向含有真菌的标本的标本瓶内加入专用消化液，标本和专用消化液的体积比为1:1，将瓶底呈倒锥体形的标本瓶放入振荡器振荡6min，静置15min，尖端朝下，比重较大的真菌沉淀于尖底部，振荡6min，用一次性移液管插入标本瓶底部，吸取1mL标本，加入至制片仓内，制片仓安装在装有载玻片的制片架上，将制片架悬挂入离心式液基细胞制片机内，850r/min离心4min，制成液基薄片；在所述液基薄片制备好后，进行固定、染色、封片，置于荧光显微镜下进行镜检。
专用消化液由以下原料按重量份制备而成：pH为8的PBS缓冲液1050份、胰蛋白酶50份、EDTA二钠15份、碳酸氢钠适量和二硫苏糖醇12份。
专用消化液的制备方法：将胰蛋白酶、EDTA二钠、二硫苏糖醇溶于pH为8的PBS缓冲液中，加入碳酸氢钠调节pH为8.3，搅拌溶解，制得专用消化液。
染色步骤采用专用染色剂，所述专用染色剂由以下原料按重量份制备而成：苯酚7份、乙二醇25份、PBS缓冲液120份、藻蓝蛋白35份和去离子水120份。
专用染色剂的制备方法：将苯酚、乙二醇、PBS缓冲液、藻蓝蛋白和去离子水混合，搅拌均匀，制得专用染色剂。
实施例4
一种基于离心法的液基制片技术用于液基真菌的检测方法，包括以下步骤：向含有真菌的标本的标本瓶内加入专用消化液，标本和专用消化液的体积比为1:1，将瓶底呈倒锥体形的标本瓶放入振荡器振荡9min，静置25min，尖端朝下，比重较大的真菌沉淀于尖底部，振荡9min，用一次性移液管插入标本瓶底部，吸取2mL标本，加入至制片仓内，制片仓安装在装有载玻片的制片架上，将制片架悬挂入离心式液基细胞制片机内，950r/min离心4min，制成液基薄片；在所述液基薄片制备好后，进行固定、染色、封片，置于荧光显微镜下进行镜检。
专用消化液由以下原料按重量份制备而成：pH为8的PBS缓冲液1150份、胰蛋白酶70份、EDTA二钠25份、碳酸氢钠适量和二硫苏糖醇18份。
专用消化液的制备方法：将胰蛋白酶、EDTA二钠、二硫苏糖醇溶于pH为8的PBS缓冲液中，加入碳酸氢钠调节pH为8.3，搅拌溶解，制得专用消化液。
染色步骤采用专用染色剂，所述专用染色剂由以下原料按重量份制备而成：苯酚10份、乙二醇35份、PBS缓冲液180份、藻蓝蛋白45份和去离子水180份。
专用染色剂的制备方法：将苯酚、乙二醇、PBS缓冲液、藻蓝蛋白和去离子水混合，搅拌均匀，制得专用染色剂。
实施例5
一种基于离心法的液基制片技术用于液基真菌的检测方法，包括以下步骤：向含有真菌的标本的标本瓶内加入专用消化液，标本和专用消化液的体积比为1:1，将瓶底呈倒锥体形的标本瓶放入振荡器振荡7min，静置20min，尖端朝下，比重较大的真菌沉淀于尖底部，振荡7min，用一次性移液管插入标本瓶底部，吸取1.5mL标本，加入至制片仓内，制片仓安装在装有载玻片的制片架上，将制片架悬挂入离心式液基细胞制片机内，900r/min离心4min，制成液基薄片；在所述液基薄片制备好后，进行固定、染色、封片，置于荧光显微镜下进行镜检。
专用消化液由以下原料按重量份制备而成：pH为8的PBS缓冲液1100份、胰蛋白酶70份、EDTA二钠20份、碳酸氢钠适量和二硫苏糖醇15份。
专用消化液的制备方法：将胰蛋白酶、EDTA二钠、二硫苏糖醇溶于pH为8的PBS缓冲液中，加入碳酸氢钠调节pH为8.3，搅拌溶解，制得专用消化液。
染色步骤采用专用染色剂，所述专用染色剂由以下原料按重量份制备而成：苯酚9份、乙二醇30份、PBS缓冲液150份、藻蓝蛋白40份和去离子水150份。
专用染色剂的制备方法：将苯酚、乙二醇、PBS缓冲液、藻蓝蛋白和去离子水混合，搅拌均匀，制得专用染色剂。
对比例1
与实施例5相比，专用染色剂中藻蓝蛋白替换为台酚蓝。
对比例2
与实施例5相比，专用消化液中未添加二硫苏糖醇。
测试例1
将本发明实施例1-5和对比例1-3进行性能测试，结果见表1。
表1染色效果比较
| 组别 | 染色效果 | 荧光时长(min) | 反差效果 | 保存时间 | 毒性 |
| 实施例1 | 好 | 100 | 明显 | >7d | 安全无毒 |
| 实施例2 | 好 | 100 | 明显 | >7d | 安全无毒 |
| 实施例3 | 好 | 100 | 明显 | >7d | 安全无毒 |
| 实施例4 | 好 | 100 | 明显 | >7d | 安全无毒 |
| 实施例5 | 好 | 100 | 明显 | >7d | 安全无毒 |
| 对比例1 | 好 | 20 | 不明显 | >7d | 致癌疑似物 |
| 对比例2 | 好 | 100 | 明显 | >7d | 安全无毒 |
由上表可知，本发明采用藻胆蛋白(藻蓝蛋白和藻红蛋白)作为荧光显色剂，具有安全无毒，荧光时间长，保持时间长，反差明显等优点。
表2
由上表可知，采用本发明方法进行制片，质量评估结果明显优于对比例1-3制片的质量。对比例2中未添加二硫苏糖醇，使得蛋白酶解后溶解性变差，导致背景较乱，细胞保留不完整。
与现有技术相比，白带是由阴道黏膜渗出物、宫颈腺体分泌物及子宫内膜腺体分泌物混合而成，内含阴道上皮脱落细胞、白细胞、乳酸杆菌。本发明采用专用消化液对妇科真菌标本进行消化酶解，其中向消化液中加入二硫苏糖醇用于降低二硫键的作用，提高蛋白酶解后的溶解性；
本发明专用染色剂通过添加荧光性极好的藻胆蛋白(藻蓝蛋白或者藻红蛋白)，是一种具有强烈荧光性的红色、紫罗蓝色和蓝色蛋白质，来自于蓝藻或红藻等藻类物质，天然无毒害，比普通染色剂的荧光效果更好，且更安全，不会致癌，适合真菌检测的染色；
本发明基于离心法的液基制片技术，采用离心法结合振荡法，将真菌分离不黏连，成单个的真菌细胞，消化后将白带中大部分人体细胞以及其他细菌酶解，薄层过滤后仅仅留下真菌细胞，留在薄片上，振荡后使得细胞呈悬浮状态，采用染色剂染色后细胞清晰可辨，方便显微镜观察。
本发明制备方法简单，制得的真菌薄片清晰可观察，实现对真菌的精确检测，有效的解决了现有技术中所存在的操作繁琐、过程耗时长，所需试剂多等问题。
本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。
Claims (3)
1.一种基于离心法的液基制片技术用于液基真菌的检测方法，其特征在于，所述基于离心法的液基制片技术包括以下步骤：向含有真菌的标本的标本瓶内加入专用消化液，将瓶底呈倒锥体形的标本瓶放入振荡器振荡，静置，尖端朝下，比重较大的真菌沉淀于尖底部，振荡后用一次性移液管插入标本瓶底部，吸取1-2mL标本，加入至制片仓内，制片仓安装在装有载玻片的制片架上，将制片架悬挂入离心式液基细胞制片机内，离心，制成液基薄片；
所述专用消化液由以下原料制备而成：pH为8的PBS缓冲液、胰蛋白酶、EDTA二钠、碳酸氢钠和二硫苏糖醇；
所述专用消化液的制备方法：将胰蛋白酶、EDTA二钠、二硫苏糖醇溶于pH为8的PBS缓冲液中，加入碳酸氢钠调节pH为8.3，搅拌溶解，制得专用消化液；
所述专用消化液由以下原料按重量份制备而成：pH为8的PBS缓冲液1100份、胰蛋白酶70份、EDTA二钠20份、碳酸氢钠适量和二硫苏糖醇15份；
所述标本和专用消化液的体积比为1:1；
所述振荡时间为5-10min，所述静置时间为10-30min；所述离心转速为800-1000r/min，离心时间为3-5min；
所述含有真菌的标本为白带。
2.根据权利要求1所述一种基于离心法的液基制片技术用于液基真菌的检测方法，其特征在于，所述检测方法为在所述液基薄片制备好后，进行固定、染色、封片，置于荧光显微镜下进行镜检。
3.根据权利要求2所述一种基于离心法的液基制片技术用于液基真菌的检测方法，其特征在于，所述染色步骤采用专用染色剂，所述专用染色剂由以下原料按重量份制备而成：苯酚5-12份、乙二醇20-40份、PBS缓冲液100-200份、藻蓝蛋白或藻红蛋白30-50份和去离子水100-200份。
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