CN106635891A - 牛支原体专用快速培养基及牛支原体的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物疫病病原快速诊断领域，尤其是一种牛支原体专用快速培养基及牛支原体的分离纯化方法，由牛支原体液体培养基和牛支原体固体培养基组成，在原有配方的基础上添加脱氧核糖核苷酸钠、牛心汤及牛肺消化液，增加了酵母浸出液的用量，减少了血清的添加量。改良后的牛支原体液体培养基接种牛支原体培养24h颜色即可变为黄色，且蛋白含量最高可达1.58‑1.69 mg/mL。将培养24h变黄的牛支原体液体培养基接种于牛支原体固体培养基后48h即可观察到典型的牛支原体“油煎蛋”样菌落。本发明的牛支原体培养基提高了牛支原体的生长效率，且提高了牛支原体分离纯化的成功率，为牛支原体的快速诊断、治疗和防控提供了宝贵的时间，并降低了牛支原体的培养成本。

Description

牛支原体专用快速培养基及牛支原体的分离纯化方法

技术领域

本发明属于动物疫病病原快速诊断领域，尤其是一种牛支原体专用快速培养基及牛支原体的分离纯化方法。

背景技术

牛支原体（Mycoplasmabovis）是感染肉牛和奶牛一种重要的病原微生物，1961年牛支原体首次在美国患有乳腺炎的牛乳中被分离到。牛支原体是一种能够导致牛发生多种疾病，且感染率极高的重要病原微生物，可以导致牛发生肺炎、关节炎、乳房炎、结膜炎、怀孕母牛流产、生殖器感染等多种疾病，临床上牛支原体病例多与各种病毒、细菌、寄生虫的混合感染。随着经济不断的发展和运输条件的改善，牛只在国与国、地区与地区之间的交易规模不断的再增加，该病相继传播到南美、欧洲及中东等地区，在世界多个国家和地区，牛支原体已经成为一种重要的病原并在多个国家和地区流行，对肉牛和奶牛产业造成重大影响。牛支原体对畜牧业生产造成严重的经济损失，尤其在北美和欧洲，在美国由于牛支原体引起的疾病每年所造成的损失高达1.40亿美元，在欧洲每年由于牛支原体引起的犊牛肺炎约为25 %～33 %，而在美国2015年最新的报告中显示，近几年，牛支原体对澳大利亚和美国乳制品和牛肉行业造成巨大的经济损失，且在逐年递增，牛支原体现阶段不仅引起常见的肺炎，而且引起成年泌乳奶牛的隐形乳房炎和临床型乳房炎比例也在逐年增多，在临床型乳房炎病例中，由牛支原体引起的比例已从2003年的3.9 %上升到现在的14.4 %，在鲜乳中牛支原体检出率也在逐年增高。1983年黎济申在我国首次报道了从乳房炎牛乳中分离得到牛支原体，此后我国关于牛支原体的报道极少。2008年湖北省相继报道从肉牛和犊牛肺脏中分离到牛支原体，此后重庆、贵州、新疆、宁夏等全国多个省市报道肉牛和奶牛发生牛支原体疾病,至今，全国所有省、自治区都有关于牛支原体疾病和流行病学的相关报道。这表明牛支原体在我国传播速度快，传播范围广。牛支原体生长时所需要的营养物质主要靠外界摄取获得，因为牛支原体自身生物合成及代谢能力有限，,因此牛支原体对体外培养基的选择相当苛刻，关于牛支原体的PCR等诊断技术都需要获得牛支原体的纯培养物及牛支原体典型的油煎蛋样菌落，而现有牛支原体培养基抑制杂菌能力弱，培养效率低，培养时间长，容易污染、易产生误诊和漏诊。因此, 为了尽早控制该病在我国的流行，本领域函需高效稳定、快速分离诊断牛支原体的培养基以及分离纯化牛支原体的方法,进而开展牛支原体感染的诊断、治疗与防控研究。

发明内容

本发明提供了一种成本相对较低的牛支原体培养基，该牛支原体培养基能够用来较为快速的分离纯化牛支原体，蛋白含量高、生长效率高；本发明亦提供了一种应用该培养基分离纯化牛支原体的方法，便于快速诊断牛支原体。

本发明为实现上述目的采用的方案为：牛支原体培养基，包括牛支原体液体培养基和牛支原体固体培养基，所述牛支原体液体培养基由以下成分组成：超纯水、10%醋酸铊溶液、PPLO肉汤、灭活马血清、25%酵母浸出液、青霉素、葡萄糖、丙酮酸钠、脱氧核糖核苷酸钠、牛心汤、牛肺消化液和0.4%酚红。

作为优选，所述牛支原体液体培养基由以下组分组成：10%醋酸铊溶液1-2.5mL/L、PPLO肉汤20-23g、灭活马血清100-120mL/L、25%酵母浸出液90-110 mL/L、青霉素200-300万单位、葡萄糖1-1.2g、丙酮酸钠1.8-2.1g、脱氧核糖核苷酸钠0.1-0.3g、牛心汤150-170 mL/L、牛肺消化液100-120 mL/L和0.4%酚红 4.3-4.6 mL/L，剩余体积用超纯水补够。

最优选，所述牛支原体液体培养基由以下组分组成：10%醋酸铊溶液1mL/L、PPLO肉汤21g、灭活马血清100mL/L、25%酵母浸出液200mL/L、青霉素300万单位、葡萄糖1g、丙酮酸钠2g、脱氧核糖核苷酸钠0.1g、牛心汤150 mL/L、牛肺消化液100 mL/L和0.4%酚红 4.5 mL/L，剩余体积用超纯水补够

作为优选,所述酵母浸出液的制备方法为:将250g鲜酵母溶于1000 mL超纯水，搅拌均匀，充分溶解后煮沸15min，快速冷却，4000r/min离心15min，提取上清液，再煮沸15min，快速冷却，用K型澄清滤极过滤，再用0.22um无菌滤膜过滤除菌，置4℃保存备用。

采用上述方法制备得到的酵母浸出液具备以下优点: 搅拌均匀增加了鲜酵母的溶解性，使用K型澄清滤极过滤的浸出液颜色为淡黄色，尽量避免对培养基浑浊度的干扰，使用0.22um无菌滤膜过滤除菌避免了高温高压灭菌法对浸出液成份的破坏。

作为优选，所述牛心汤的制备方法为：将提出劲健的牛心搅碎，称取500g混合均匀放入4℃冰箱24h，出去血液和浮油，用纱布包裹隔，加水1000 mL煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块并挤压收集全部滤液，使用0.8um滤膜，加水补足1000mL，加入蛋白胨5g，NaCl 0.8g，磷酸盐0.6g，溶解后校正Ph值7.6-7.8，使用0.22um无菌滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存备用。

作为优选，所述牛肺消化液的制备方法为：将健康的牛肺搅碎，称取600 g放入2 L烧杯，加入1 L超纯水，在电炉上加热至80 ℃并不断搅拌。再加入8 g/L 碳酸钠溶液1 L并搅拌，冷却至45℃后加入12 g胰酶溶液，在45 ℃条件下水浴3 h，过一会搅拌一次并不断除去液面油脂，边搅拌边加入16 mL浓盐酸，加入煮沸15 min，先经双层纱布过滤，3000 r/min离心15 min，滤纸过滤后煮沸15 min，冷却至室温，用1 moL/L NaOH调pH至7.8，121 ℃高压灭菌15 min，4 ℃冰箱保存。

本发明还提供上述培养基的制备方法,所述液体培养基的制备方法为:将配方量的超纯水,10%的醋酸铂溶液,PPLO肉汤,葡萄糖,丙酮酸钠,脱氧核糖核苷酸钠，牛心汤,牛肺消化液，0.4%酚红充分混匀,调Ph值为7.8,121℃高压灭菌15分钟,冷却至50-55℃,加入配方量的无菌的灭活的马血清,酵母浸出液,无菌的青霉素水溶液, 最后微调Ph值至7.8。

作为优选,所述固体培养基的制备方法为: 10%的醋酸铂溶液,PPLO肉汤,葡萄糖,丙酮酸钠,脱氧核糖核苷酸钠，牛心汤, 牛肺消化液，0.4%酚红充分混匀,调Ph值为7.8,121℃高压灭菌15分钟,冷却至50-55℃,加入配方量的无菌的灭活的马血清,酵母浸出液,无菌的青霉素水溶液, 最后微调Ph值至7.8。混匀后倒平板,得固体培养基。

本发明的第三个目的是提供牛支原体分离纯化的方法,包括以下步骤:

1. 用无菌棉签在牛的鼻腔、病死解剖牛的气管、喉头、肺脏、胸腔或肿大的关节采样，或无菌条件下剪切小块病样组织接种到5mL的液体培养基中并弃去棉签,置于37℃、5%CO₂培养箱中培养, 48 h液体培养基均变黄，略微浑浊，经0.22 μm滤膜过滤，过滤液体传代培养，传至第3代液体培养基变为黄色，澄清透明，无沉淀。

2.将传至第3代液体培养基转接固体培养基培养3 d长出针尖大小菌落，40倍显微镜下呈现牛支原体典型的“油煎蛋”样菌落，用接种环无菌刮取平板上的菌落接种到新的液体培养基中培养生长,再将变黄的培养物接种到固体培养基上;重复该步骤3次,确保分离到牛支原体特征菌落。

步骤1和2表明，由于牛支原体病通常都是牛支原体和其它细菌的混合感染，其它细菌同时也生长或抑制牛支原体的生长，影响牛支原体的分离，因此，初代接种的液体培养基颜色变黄后立即使用0.22 μm无菌滤膜过滤去除其它细菌，由于牛支原体呈现多型性且较小，可以通过0.22 μm无菌滤膜，将过滤的液体继续接种于新的牛支原体液体培养基进行增值纯化。直至接种的第三代液体培养基变黄且澄清透明后接种于牛支原体固体培养基中，再反复纯化三代，确保分离到牛支原体典型的“油煎蛋”样菌落。

3.在显微镜下选取单个的特征菌落,并在平板底部做好标记;用无菌接种环挑取单一菌落并接种到5mL液体培养基中培养,当pH下降,液体由红色变为黄色时,重复步骤2，如此重复3次,得到纯化的牛支原体,将液体培养物和甘油以50%比列混合，振荡混匀后一80℃保存。

本发明对培养基进行了营养成分的筛选,通过添加脱氧核糖核苷酸钠和牛心汤，增加了牛支原体培养基的营养成分,使其富含DNA合成的必需物质胆固醇及蛋白质;通过增加酵母浸出液，提供了牛支原体生长所必须的核酸、核酸前体、维生素、氨基酸和生长因子。上述物质对于促进牛支原体的生长繁殖及提高牛支原体在培养基中生长率起到重要作用。经反复实验表明,本发明的培养基能有效促进牛支原体的繁殖, 培养12小时后牛支原体蛋白含量为0.43-0.48 mg/mL，培养24小时后牛支原体蛋白含量为0.72-0.81mg/mL，培养36小时后牛支原体蛋白含量为1.06-1.13 mg/mL，培养48小时后牛支原体蛋白含量为1.58-1.69mg/mL，培养60小时后牛支原体蛋白含量为1.36-1.41 mg/mL，培养72小时后牛支原体蛋白含量为1.39-1.42 mg/mL 。而在未添加上述成分之前,培养48小时后牛支原体蛋白含量最高为1.26-1.32 mg/mL 。通过提高醋酸砣添加量、提高青霉素的浓度,可阻止环境中其他杂菌的生长,使培养基在2-8℃存储时间从之前的2-3月延长到半年。

利用上述培养基对牛支原体分离纯化,是在液体培养基上对牛支原体进行增值并过滤后继续培养增值，利用固体培养基分离菌落,将分离的菌落再置于液体培养基中生长,重复上述步骤直至得到纯化的牛支原体。利用本发明的培养基进行牛支原体分离纯化的成功率高,在正确采样的前提下,通过最初病料接种、过滤接种和分离,到后来挑取单菌落增殖的纯化步骤,均能从临床病样中成功分离纯化出牛支原体。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为市售。

实施例1

本发明的牛支原体培养基由液体培养基和固体培养基组成,具体为:

液体培养基配方为：10%醋酸铊溶液1mL/L、PPLO肉汤21g、灭活马血清100mL/L、25%酵母浸出液200mL/L、青霉素300万单位、葡萄糖1g、丙酮酸钠2g、脱氧核糖核苷酸钠0.1g、牛心汤150 mL/L、牛肺消化液100 mL/L和0.4%酚红 4.5 mL/L，剩余体积用超纯水补够。

配制1000mL本发明的液体培养基的方法如下：准备1000mL三角瓶一个，量取200mL超纯水加入到准备的三角瓶内，使用移液器吸取2mL10%醋酸铊溶液缓慢滴加到三角瓶内，然后依次称取并加入PPLO肉汤21g，葡萄糖1g，丙酮酸钠2g，脱氧核糖核苷酸钠0.1g，0.4%酚红 4.5 mL，充分混匀后121℃高压灭菌15分钟；冷却至50-55℃，加入灭活马血清100mL，无菌的25%酵母浸出液200mL，无菌的牛心汤150 mL，无菌的牛肺消化液100 mL/L，无菌的青霉素300万单位水溶液（(溶于50mL灭菌超纯水），用灭菌超纯水调至1000mL，无菌条件下调pH值至7.8，放置于4℃冰箱保存备用。

固体培养基配方为：10%醋酸铊溶液1mL/L、PPLO琼脂33g、灭活马血清100mL/L、25%酵母浸出液100 mL/L、青霉素300万单位、葡萄糖1g、丙酮酸钠2g、脱氧核糖核苷酸钠0.1g、牛心汤150 mL/L，无菌的牛肺消化液100 mL/L，和0.4%酚红 4.5 mL/L，剩余体积用超纯水补够。

配制1000mL本发明的液体培养基的方法如下：准备1000mL三角瓶一个，量取200mL超纯水加入到准备的三角瓶内，使用移液器吸取2mL10%醋酸铊溶液缓慢滴加到三角瓶内，然后依次称取并加入PPLO肉汤21g，葡萄糖1g，丙酮酸钠2g，脱氧核糖核苷酸钠0.1g，0.4%酚红 4.5 mL，充分混匀后121℃高压灭菌15分钟；;放入50-55℃的水浴锅中冷却，加入灭活马血清100mL，无菌的25%酵母浸出液200mL，无菌的牛心汤150 mL，无菌的牛肺消化液100 mL/L，无菌的青霉素300万单位水溶液（(溶于50mL灭菌超纯水），用灭菌超纯水调至1000mL后混匀，无菌条件下调pH值至7.8，,混匀后倒平板,放置于4℃冰箱保存备用。

本发明的牛支原体培养基的菌体蛋白含量的测定:

取4只试管，分别加入液体培养基15mL/管，无菌操作下，在第1管中加入灭菌超纯水0.75 mL（按液体培养基5%量添加）作为空白对照，在2、3、4管中分别加入牛支原体培养物0.75 mL（按液体培养基5%量添加），震荡器混匀，将试管放置37℃ CO₂培养箱中静置培养，每日观察颜色变化,每间隔12小时从待测菌液中取样，无菌操作条件下每管分别吸取2 mL待测菌液置于无菌离心管中，12000 r/min离心15 min，倒掉上清，吸取等量0.01 moL/LPBS缓冲液置于离心管中，用涡旋振荡器将离心管底部沉淀混匀，再次12000 r/min离心15min，如此反复洗涤3次，制成菌悬液待测，制成菌悬浊液用微量核算蛋白检测仪测定蛋白含量，求2、3、4号试管测试值的平均值。连续测试72h，结果显示，培养48小时后牛支原体蛋白含量最高，为1.58-1.69 mg/mL。

应用实施例1制备的培养基分离纯化牛支原体的方法如下:

用无菌棉签,从活体病牛的鼻腔中取样,立即将棉签放入含有5mL培养基的试管中用力搅拌挤压,弃棉签，或将病死解剖牛的气管、喉头、肺脏、胸腔或肿大的关节采样，或无菌条件下剪切小块病样组织接种到5mL的液体培养基将试管放置37℃ CO₂培养箱中静置培养。每天观察培养基颜色变化情况，将变黄的培养液用0.22 微分μm除菌滤膜过滤，重复培养过滤液两次后接种于牛支原体固体培养基中，5 % CO2 37 ℃静置培养3 d～5 d，40倍显微镜下观察菌落形态。选取单个菌落接种于液体培养基中培养,当液体由红色变为黄色后,重复该步骤;如此重复3次,即可得到纯化的牛支原体,加甘油于-80℃保存。

实施例2

本实施例与实施例1的不同之处在于:

液体培养基配方为：10%醋酸铊溶液2mL/L、PPLO肉汤21g、灭活马血清200mL/L、25%酵母浸出液100mL/L、青霉素300万单位、葡萄糖1g、丙酮酸钠2g和0.4%酚红 4.5 mL/L，剩余体积用超纯水补够。

固体培养基配方为：10%醋酸铊溶液1mL/L、PPLO琼脂33g、灭活马血清200mL/L、25%酵母浸出液100 mL/L、青霉素300万单位、葡萄糖1g、丙酮酸钠2g和 0.4%酚红 4.5 mL/L，剩余体积用超纯水补够。其余部分均相同。

实施例3

本实施例与实施例1的不同之处在于:

液体培养基配方为：10%醋酸铊溶液1.5mL/L、PPLO肉汤20g、灭活马血清110mL/L、25%酵母浸出液210mL/L、青霉素200万单位、葡萄糖1.1g、丙酮酸钠1.8g、脱氧核糖核苷酸钠0.2g、牛心汤140 mL/L、肺消化液牛110 mL/L和0.4%酚红 4.3mL/L，剩余体积用超纯水补够。

固体培养基配方为：0%醋酸铊溶液1mL/L、PPLO琼脂31g、灭活马血清110mL/L、25%酵母浸出液210mL/L、青霉素200万单位、葡萄糖1.1g、丙酮酸钠1.8g、脱氧核糖核苷酸钠0.2g、牛心汤140 mL/L、牛肺消化液110 mL/L和0.4%酚红 4.3mL/L，剩余体积用超纯水补够。其余部分均相同。

实施例4

本实施例与实施例1的不同之处在于:

液体培养基配方为：10%醋酸铊溶液2.5mL/L、PPLO肉汤23g、灭活马血清230mL/L、25%酵母浸出液220mL/L、青霉素300万单位、葡萄糖1.2g、丙酮酸钠2.1g、脱氧核糖核苷酸钠0.3g、牛心汤170mL/L、牛肺消化液120 mL/L和0.4%酚红 4.6mL/L，剩余体积用超纯水补够。

固体培养基配方为：10%醋酸铊溶液2.5mL/L、PPLO琼脂33g、灭活马血清230mL/L、25%酵母浸出液220mL/L、青霉素300万单位、葡萄糖1.2g、丙酮酸钠2.1g、脱氧核糖核苷酸钠0.3g、牛心汤170mL/L、牛肺消化液120 mL/L和0.4%酚红 4.6mL/L，剩余体积用超纯水补够。其余部分均相同。

最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.牛支原体培养基,其特征在于:由液体培养基和固体培养基组成,所述液体培养基由以下组分组成: 超纯水、10%醋酸铊溶液、PPLO肉汤、灭活马血清、25%酵母浸出液、青霉素、葡萄糖、丙酮酸钠、脱氧核糖核苷酸钠、牛心汤、牛肺消化液和0.4%酚红；所述固体培养基由以下组分组成: 超纯水、10%醋酸铊溶液、PPLO琼脂、灭活马血清、25%酵母浸出液、青霉素、葡萄糖、丙酮酸钠、脱氧核糖核苷酸钠、牛牛心汤、牛肺消化液和0.4%酚红。

2.根据权利要求1所述的培养基,其特征在于:所述液体培养基配方为：10%醋酸铊溶液1-2.5mL/L、PPLO肉汤20-23g、灭活马血清100-120mL/L、25%酵母浸出液90-110 mL/L、青霉素200-300万单位、葡萄糖1-1.2g、丙酮酸钠1.8-2.1g、脱氧核糖核苷酸钠0.1-0.3g、牛心汤150-170 mL/L、牛肺消化液100-120 mL/L和0.4%酚红 4.3-4.6 mL/L，剩余体积用超纯水补够；作为优选，所述牛支原体液体培养基由以下组分组成：10%醋酸铊溶液1mL/L、PPLO肉汤21g、灭活马血清100mL/L、25%酵母浸出液100 mL/L、青霉素300万单位、葡萄糖1g、丙酮酸钠2g、脱氧核糖核苷酸钠0.1g、牛心汤150 mL/L、牛肺消化液100 mL/L和0.4%酚红 4.5 mL/L，剩余体积用超纯水补够。

3.根据权利要求1或2所述的培养基,其特征在于：所述固体培养基配方为：所述牛支原体固体培养基由以下组分组成：10%醋酸铊溶液1-2.5mL/L、PPLO琼脂30-33g、灭活马血清100-120mL/L、25%酵母浸出液90-110 mL/L、青霉素200-300万单位、葡萄糖1-1.2g、丙酮酸钠1.8-2.1g、脱氧核糖核苷酸钠0.1-0.3g、牛心汤150-170 mL/L、牛肺消化液100-120 mL/L和0.4%酚红 4.3-4.6 mL/L，剩余体积用超纯水补够；作为优选，所述牛支原体固体培养基由以下组分组成：10%醋酸铊溶液1mL/L、PPLO琼脂30g、灭活马血清100mL/L、25%酵母浸出液100 mL/L、青霉素300万单位、葡萄糖1g、丙酮酸钠2g、脱氧核糖核苷酸钠0.1g、牛心汤150mL/L、牛肺消化液100 mL/L和0.4%酚红 4.5 mL/L，剩余体积用超纯水补够。

4.根据权利要求1-3任一所述的培养基,其特征在于：所述酵母浸出液的制备方法为:将250g鲜酵母溶于1000 mL超纯水，搅拌均匀，充分溶解后煮沸15min，快速冷却，4000r/min离心15min，提取上清液，再煮沸15min，快速冷却，用K型澄清滤极过滤，再用0.22um无菌滤膜过滤除菌，置4℃保存备用。

5.根据权利要求1-4任一所述的培养基,其特征在于：所述牛心汤的制备方法为：将提出劲健的牛心搅碎，称取500g混合均匀放入4℃冰箱24h，出去血液和浮油，用纱布包裹隔，加水1000 mL煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块并挤压收集全部滤液，使用0.8um滤膜，加水补足1000mL，加入蛋白胨5g，NaCl 0.8g，磷酸盐0.6g，溶解后校正Ph值7.6-7.8，使用0.22um无菌滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存备用。

6.根据权利要求1-5任一所述的培养基,其特征在于：将健康的牛肺搅碎，称取600 g放入2 L烧杯，加入1 L超纯水，在电炉上加热至80 ℃并不断搅拌，再加入8 g/L 碳酸钠溶液1L并搅拌，冷却至45℃后加入12 g胰酶溶液，在45 ℃条件下水浴3 h，过一会搅拌一次并不断除去液面油脂，边搅拌边加入16 mL浓盐酸，加入煮沸15 min，先经双层纱布过滤，3000r/min离心15 min，滤纸过滤后煮沸15 min，冷却至室温，用1 moL/L NaOH调pH至7.8，121℃高压灭菌15 min，4 ℃冰箱保存。

7.权利要求1-6任一所述的培养基的制备方法,其特征在于：所述液体培养基的制备方法为：将配方量的超纯水,10%的醋酸铂溶液,PPLO肉汤,葡萄糖,丙酮酸钠,脱氧核糖核苷酸钠，牛心汤, 牛肺消化液，0.4%酚红充分混匀,调Ph值为7.8,121℃高压灭菌15分钟,冷却至50-55℃,加入配方量的无菌的灭活的马血清,酵母浸出液,无菌的青霉素水溶液, 最后微调Ph值至7.8。

8.根据权利要求1-7所述的方法,其特征在于:所述固体培养基的制备方法为: 10%的醋酸铂溶液,PPLO肉汤,葡萄糖,丙酮酸钠,脱氧核糖核苷酸钠，牛心汤, 牛肺消化液，0.4%酚红充分混匀,调Ph值为7.8,121℃高压灭菌15分钟,冷却至50-55℃,加入配方量的无菌的灭活的马血清,酵母浸出液,无菌的青霉素水溶液, 最后微调Ph值至7.8，混匀后倒平板,得固体培养基。

9.应用权利要求1-8任一所述的牛支原体培养基对牛支原体分离纯化的方法,其特征在于:步骤如下：用无菌棉签,从活体病牛的鼻腔中取样,立即将棉签放入含有5mL培养基的试管中用力搅拌挤压,弃棉签，或将病死解剖牛的喉头、气管、肺脏、胸腔液或肿大的关节采样，或无菌条件下剪切小块病样组织接种到5mL的液体培养基，将试管放置37℃ CO₂培养箱中静置培养，每天观察培养基颜色变化情况，将变黄的培养液用0.22μm除菌滤膜过滤，重复培养过滤液两次后接种于牛支原体固体培养基中，5 % CO2 37 ℃静置培养2 d～5 d，40倍显微镜下观察菌落形态，然后选取单个菌落接种于液体培养基中培养,当液体由红色变为黄色后,重复该步骤;如此重复3次,即可得到纯化的牛支原体。