CN106635865B - 一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基，每1000ml培养基中包括有以下组分：PPLO肉汤10.5 g、脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09 g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03 g、葡萄糖5.0 g、水解乳蛋白5.0 g、25%新鲜酵母浸出液60 ml、无菌猪血清100 ml、无菌马血清100 ml、氨苄青霉素100 mg、10%醋酸铊1 ml；并提供了其制备方法及应用。本发明的有益效果为：本发明提供的一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基及其制备方法和应用，与现有技术相比，具有生长迅速和滴度高的特点，分离出牛鼻支原体的成功率高。

Description

一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽医生物技术领域，具体涉及一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基及其制备方法和应用。

背景技术

牛鼻支原体（Mycoplasma bovirhinis），可引起牛肺炎、乳腺炎、结膜炎和生殖道炎症。牛鼻支原体是一种重要却往往被忽视的病原。早在1947年Edward 报道从流产奶牛生殖道分离到一株支原体（Edward , D. G et al. 1947)，后经鉴定并命名为牛鼻支原体（Edward and Freundt，1956）。牛鼻支原体呈全世界范围分布。我国陈嘉棣等人在1985年报道从上海奶牛场分离到该菌，生理生化特性与定型菌株基本一致（陈嘉棣等，1985）。近些年，关于该菌与其他细菌如牛支原体、溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌混合感染，造成牛肺炎的病例屡见不鲜，给养牛业造成了严重经济损失，逐渐引起了兽医工作者、研究人员的重视。

牛鼻支原体是一类特殊的微生物，无细胞壁、由于其基因组很小、基因组中编码氨基酸和辅助因子合成的基因很少，导致其生物合成和代谢的能力相当有限，仅在特定的环境下生存，因此牛鼻支原体对体外培养基的选择也相当苛刻，需要从中摄取胆固醇、脂肪酸、核酸前体和能量来源等营养成分来促进自身繁殖。牛鼻支原体主要感染牛。关于牛鼻支原体的鉴定，目前主要依靠生理生化特性鉴定、聚合酶链式反应（Kobayashi H et al,1998; Miles K et al. 2004）和免疫试验包括生长抑制试验、代谢抑制试验、免疫荧光试验，而聚合酶链式反应和免疫实验均涉及牛鼻支原体纯培养物的分离与培养；而目前分离牛鼻支原体使用的主要为GS培养基和SP-4培养基，仍存在活菌滴度较低、繁殖能力差等问题，易产生漏诊；因此，本领域亟需高效、快速分离诊断牛鼻支原体的培养基以及分离纯化牛鼻支原体的方法，进而开展牛鼻支原体病原特性、培养特性、致病机理、疫苗制备、诊断与防控等研究。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基，每1000ml培养基中包括有以下组分：PPLO肉汤10.5 g、脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09 g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03g、葡萄糖5.0 g、水解乳蛋白5.0 g、25%新鲜酵母浸出液60 ml、无菌猪血清100 ml、无菌马血清100 ml、氨苄青霉素100 mg、10%醋酸铊1 ml。

进一步的，上述的一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基，所述培养基为液体培养基形式或固体培养基形式。

进一步的，上述的一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基，所述用于牛鼻支原体分离纯化的液体培养基中，每1000ml液体培养基是由以下组分制备得到的：PPLO肉汤10.5g、脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09 g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03 g、葡萄糖5.0 g、水解乳蛋白5.0 g、25%新鲜酵母浸出液60ml、1%酚红2.5 ml、无菌猪血清100 ml、无菌马血清100 ml、氨苄青霉素100 mg、10%醋酸铊1ml、余量为去离子水。

进一步的，上述的一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基，所述用于牛鼻支原体分离纯化的固体培养基中，每1000ml固体培养基是由以下组分制备得到的：PPLO肉汤10.5g、脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09 g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03 g、葡萄糖5.0 g、水解乳蛋白5.0 g、25%新鲜酵母浸出液60ml、无菌猪血清100 ml、无菌马血清100 ml、氨苄青霉素100 mg、10%醋酸铊1 ml、琼脂粉15.0 g、余量为去离子水。

本发明的第二个目的是提供了上述一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基的制备方法，每1000ml液体培养基的制备方法为：

1）称取脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03 g、葡萄糖5.0 g，加490 ml去离子水混匀，加热溶解，再加入1%酚红2.5 ml，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为A液；

2）称取PPLO肉汤10.5 g、水解乳蛋白5.0 g，量取60 ml 25%新鲜酵母浸出液，加去离子水至300 ml，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为B液；

3）待A液、B液晾至50℃-55℃混合后，再在其中加入无菌猪血清和马血清各100ml，再加入滤过除菌100 mg/ml氨苄青霉素1 ml和灭菌的10%醋酸铊1 ml，用灭菌去离子水调至1000 ml，用灭菌1 M NaOH调pH值到7.2-7.4，充分摇匀，得到液体培养基，置4℃保存备用。

进一步的，上述一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基的制备方法，每1000ml固体培养基的制备方法为：

1）称取脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03 g、葡萄糖5.0 g，加490 ml去离子水混匀，加热溶解，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为A液；

2）称取PPLO肉汤10.5 g、水解乳蛋白5.0 g、琼脂粉15.0 g，量取60 ml/L 25%新鲜酵母浸出液，加去离子水至300 ml，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为B液；

3）待A液、B液晾至50℃-55℃混合后，再在其中加入无菌猪血清和马血清各100ml，再加入滤过除菌100 mg/ml的氨苄青霉素1 ml和灭菌的10%醋酸铊1 ml，用灭菌去离子水调至1000 ml，用灭菌1M NaOH调pH值到7.2-7.4，摇匀，倒平皿，得到固体培养基，置4℃保存备用。

进一步的，上述的一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基的制备方法，所述25%新鲜酵母浸出液的制备方法为：取鲜酵母500g，加入去离子水2000 ml中，搅拌溶解，用盐酸溶液调pH值至4.5-5.0，80℃水浴30分钟，3000 转/分离心20分钟，取上清液，将上清液用1 MNaOH调pH值至7.8，煮沸，置室温放凉后用双层滤纸过滤，再补水至2000 ml，即得到25%新鲜酵母浸出液，-20℃保存备用；所述盐酸溶液中，按照体积比浓盐酸：水为1：1。

采用上述方法制备得到的酵母浸出液具备以下优点：不断搅拌可使酵母的溶解性增加，浸出液为透明状，淡黄色至黄色；通过调节pH值，使酵母中丰富的蛋白质、氨基酸、维生素及微量元素等营养成分最大限度的析出。

本发明的第三个目的是提供了上述一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基在牛鼻支原体分离纯化方法中的应用。

进一步的，上述的应用，所述牛鼻支原体分离纯化的方法包括以下步骤：

1）用无菌棉签采集牛的鼻拭子或无菌条件下剪切一小块肺脏组织接种到4.5 ml的液体培养基中，用液体培养基作3个以上的十倍稀释，稀释到10^-3，置37℃恒温培养箱中培养；同时取0.1 ml梯度稀释样品分别接种固体培养基，置37℃ 5%CO₂培养箱培养；每天观察液体培养基的颜色变化和有无絮状物出现，若5天仍不见液体培养基颜色变化，按1:10比例盲传接种至液体培养基和固体培养基进行培养；24小时若肉眼观察出现混浊时，表示有细菌污染，应将培养物经0.45μm的滤膜过滤后移植，按1:10的比例转接到新的液体培养基或用接种环在固体培养基上划线培养；若24小时后仍未出现颜色变化及混浊，继续在37℃恒温培养箱中培养，待颜色变黄后立即转接新的液体培养基和固体培养基；

2）上述固体培养基培养5-7天，低倍镜下观察菌落的形态及生长情况，用接种环无菌刮取平板上的菌落或用无菌巴氏吸管将带有单个菌落的琼脂块吸出，接种到新的液体培养基中培养生长，再将变黄的培养物接种到固体培养基上；重复该步骤，确保分离到支原体特征菌落；

3）上述培养支原体特征菌落生长变黄的液体培养物，在继代之前，用0.45μm的滤膜过滤以除去杂菌或细胞聚集物，有利于纯化，取0.2 ml过滤培养物原液加到1.8 ml液体培养基中做连续10倍稀释，稀释到10^-7，置37℃恒温培养箱中培养；取100μL原液和不同稀释度的培养物分别涂布在固体培养基中，37℃ 5%CO₂培养箱培养5-7天，固体培养基长出肉眼可见的针尖大小、灰白色小菌落；用低倍显微镜观察，可见边缘较为整齐，中间部分致密、边缘疏松的“油煎蛋”样菌落（部分菌株菌落无中心脐）。培养物怀疑为L型细菌时，用未加抗生素和醋酸铊的固体培养基继代3-5代，观察是否恢复正常形态。

4）将固体培养基置低倍显微镜下观察，选取单个特征菌落并在平板底部做好标记；用接种环刮取平板上的单个菌落或用灭菌巴氏吸管吸取单一菌落接种到4.5 ml液体培养基中培养，当pH值下降，液体由红色变为黄色时，重复步骤3）整体和步骤4）的前部操作；如此重复3次，得到纯化的牛鼻支原体，冻存管中培养物和甘油混合至甘油终浓度为25%，置-80℃保存。

步骤1）和2）表明，初次分离支原体时，病料有时本身含有其他杂菌污染，可能会影响支原体的分离。因此，在首次接种液体培养基，均需做固体培养基培养；若5天仍不见培养基颜色变化，按1:10比例盲传接种至固体培养基进行培养；24小时若肉眼观察出现混浊时，表示有细菌污染，应将培养物经0.45 μm的滤膜过滤后移植，按1:10的比例转接到新的液体培养基或用接种环在固体培养基上划线培养。若24小时内液体培养基未发生颜色变化和混浊，需继续放置在培养箱中培养，每日观察，待pH下降、液体变黄时转接新的液体培养基和固体培养基进行增殖和分离。实际操作中，由于病料的来源、类型不同，支原体在分离初期生长的速度也不尽相同，因此需多次重复步骤2)，确保分离到支原体特征性菌落。

本发明对培养基进行了营养成分的筛选，PPLO肉汤是支原体生长基础液，脑心浸出液中含有多种多肽、脂肪、生长因子和激素等，水解乳蛋白含有多种必须的氨基酸，这些物质是促进支原体的生长和繁殖的重要物质；通过添加氯化钠、硫酸镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖多种盐和能量物质，为支原体生长提供合适的渗透压、离子环境和能量；通过添加猪血清和马血清，向支原体提供丰富的胆固醇和必需的饱和或不饱和脂肪酸；通过添加新鲜酵母浸出液，提供了牛鼻支原体生长所需的氮源、维生素及微量元素等营养成分；通过添加氨苄青霉素和醋酸铊可抑制其他细菌和霉菌生长，对支原体无抑制效果，可避免培养基污染，同时使培养基的在2-8℃保存期由之前的1-2月延长到6个月。经反复实验表明，本发明的培养基能有效促进牛鼻支原体的生长，仅24小时即可生长，生长滴度可达10⁹ CCU/ml；而在未添上述成分之前，生长24小时生长滴度才能达到10⁷-10⁸ CCU/ml。

利用上述培养基对牛鼻支原体分离纯化，是在固体培养基上分离菌落，将分离的单个支原体菌落移入液体培养基中培养生长，然后进行液体培养物的过滤、稀释、涂板和挑单菌落进行增殖的纯化步骤，重复上述步骤直至得到纯化的牛鼻支原体。利用本发明的培养基进行牛鼻支原体分离纯化的成功率高，经正确采集标本并及时处理的前提下，通过病料接种、盲传培养和分离，到后来液体培养物的过滤、稀释、涂板、挑取支原体单菌落增殖的纯化步骤，均能从临床病料中成功分离纯化出牛鼻支原体。

本发明的有益效果为：本发明提供的一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基及其制备方法和应用，与现有技术相比，具有生长迅速和滴度高的特点，分离出牛鼻支原体的成功率高。

附图说明

图1显示为纯化的牛鼻支原体在本发明固体培养基上的菌落形态（40×）。

具体实施方式

所用制剂来源：

PPLO肉汤，为美国BD公司产品，货号为2625084。

脑心浸出液，为美国BD公司产品，货号为237500。

酚红为sigma公司产品，货号为P3532。

氨苄青霉素为sigma公司产品，货号为A0166。

马血清为Hyclone公司产品，货号为SH30074.03。

猪血清为GIBCO公司产品，货号为2625084。

水解乳蛋白，为北京索莱宝科技有限公司产品，货号为L8100。

鲜酵母为安琪公司产品。

氯化钠、硫酸镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖和其他试剂均为国产分析纯试剂。

实施例1：

本发明培养基的制备：

1、本发明的牛鼻支原体培养基由液体培养基和固体培养基组成：

1000ml液体培养基配方为：PPLO肉汤10.5 g/L、脑心浸出液8.0 g/L、氯化钠4.0g/L、硫酸镁0.05 g/L、氯化钾0.2 g/L、氯化钙0.09 g/L、磷酸氢二钠0.024 g/L、磷酸二氢钾0.03 g/L、葡萄糖5.0 g/L、水解乳蛋白5.0 g/L、25%新鲜酵母浸出液60 ml/L、1%酚红2.5ml/L、无菌猪血清100 ml/L、无菌马血清100 ml/L、氨苄青霉素100 mg/L、10%醋酸铊1 ml/L、余量为去离子水。

配制1000 ml本发明液体培养基的方法如下：称取脑心浸出液8.0 g、氯化钠（NaCl）4.0 g、硫酸镁（MgSO₄.7H₂O）0.05 g、氯化钾（KCl）0.2 g、氯化钙（CaCl_2。2H₂O）0.09 g、磷酸氢二钠（Na₂HPO_4。12H₂O）0.024 g、磷酸二氢钾（KH₂PO₄) 0.03 g、葡萄糖5.0 g，加490 ml去离子水混匀，在磁力搅拌器中加热溶解（100℃），再加入1%酚红2.5 ml，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为A液；称取10.5 g PPLO肉汤、5.0 g水解乳蛋白，量取60 ml 25%新鲜酵母浸出液，加240 ml去离子水至300 ml，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为B液；待A液、B液晾至50-55℃左右混合，再在其中加入无菌猪血清和马血清各100 ml，滤过除菌氨苄青霉素（100 mg/ml）1 ml，1 ml 灭菌10%醋酸铊（1g溶于10 ml去离子水），用5.5 ml灭菌去离子水调至1000 ml，用灭菌0.1 ml 1 M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值到7.2，充分摇匀，置4℃保存备用。

1000ml固体培养基配方为：PPLO肉汤10.5 g/L、脑心浸出液8.0 g/L、氯化钠4.0g/L、硫酸镁0.05 g/L、氯化钾0.2 g/L、氯化钙0.09 g/L、磷酸氢二钠0.024 g/L、磷酸二氢钾0.03 g/L、葡萄糖5.0 g/L、水解乳蛋白5.0 g/L、25%新鲜酵母浸出液60 ml/L、无菌猪血清100 ml/L、无菌马血清100 ml/L、氨苄青霉素100 mg/L、10%醋酸铊1 ml/L、琼脂粉15.0g/L、余量为去离子水。

配制1000 ml本发明固体培养基的方法如下：称取脑心浸出液8.0 g、氯化钠（NaCl）4.0 g、硫酸镁（MgSO₄.7H₂O）0.05 g、氯化钾（KCl）0.2 g、氯化钙（CaCl_2。2H₂O）0.09 g、磷酸氢二钠（Na₂HPO_4。12H₂O）0.024 g、磷酸二氢钾（KH₂PO₄) 0.03 g、葡萄糖5.0 g，加490 ml去离子水混匀，在磁力搅拌器中加热溶解（100℃），混合后115℃高压灭菌20分钟，作为A液；称取10.5 g PPLO肉汤、5.0 g水解乳蛋白、琼脂粉15.0 g，量取60 ml 25%新鲜酵母浸出液，加去离子水至300 ml，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为B液；待A液、B液晾至50-55℃左右混合，再在其中加入无菌猪血清和马血清各100 ml，滤过除菌氨苄青霉素（100 mg/ml）1ml，1 ml 灭菌10%醋酸铊（1g溶于10 ml去离子水），用8.0 ml灭菌去离子水调至1000 ml，用0.1 ml 用灭菌1 M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值到7.2，充分摇匀，倒直径90 mm平皿，置4℃保存备用。

上述25%新鲜酵母浸出液的制备方法为：取鲜酵母500 g，加入去离子水2000 ml中，搅拌溶解，用浓盐酸：水=1:1（体积比）调pH值至4.5-5.0，80℃水浴（瓶内温度）30分钟，3000 转/分离心20分钟，取上清液。将上清液用1 M NaOH（4 g溶于100 ml去离子水）调pH值至7.8，煮沸，置室温放凉后用双层滤纸过滤，再补水至2000 ml，-20℃保存备用。

实施例2：

本发明培养基和现有技术几种培养基的比较试验：

1、本发明培养基与现有技术几种培养基活菌滴度比较试验：

1.1 将牛鼻支原体模式株PG43株（购自美国菌种保藏中心ATCC，湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编430072，编号ATCC 27748）和牛鼻支原体自行分离菌株GS01株（中国典型培养物保藏中心CCTCC，编号M2016393，保藏日期2016年7月14日）接种本发明的牛鼻支原体培养基和现有技术2种培养基，种子继代复壮后，分别按10% (V/V) 的比例接种对应培养基，37℃恒温培养，当培养基的颜色变黄、pH值由7.2 降至6.2-6.3 时，无菌取出培养物。

1.2 活菌滴度（CCU）测定。方法如下：取12支试管，每管加对应液体培养基4.5 ml，在第1管中加入0.5 ml生长良好的牛鼻支原体培养液，用振荡器充分混匀，换新的移液管，从第1管吸取0.5 ml加入到第2管中，依次进行10倍稀释至第11管，第11管中弃去0.5 ml培养液；得到培养液的稀释度分别为10^-1-10^-11，第12管为对应培养基对照。试验管设3个重复。将试管置37℃恒温培养箱中静置培养，每天观察颜色变化，连续观察14天，发生颜色变化的最高稀释度即为该培养物的活菌滴度，用颜色变化单位（CCU）表示。试验重复3次。

2、结果：

2.1 牛鼻支原体PG43株接种3种培养基3次生长试验CCU测定结果见表1。

表1

2.2 牛鼻支原体GS01株接种3种培养基3次生长试验CCU测定结果见表2。

牛鼻支原体PG43株和GS01株分别接种3种培养基3次生长试验CCU测定结果显示，在同样条件下，使用本发明培养基培养牛鼻支原体的生长时间为1天，GS培养基为2天，SP-4培养基为2天；使用本发明培养基培养牛鼻支原体3次CCU测定结果均为10⁹CCU/ml，而GS培养基为10⁷-10⁸CCU/ml，SP-4培养基3次CCU测定结果均为10⁸CCU/ml，说明本发明的牛鼻支原体培养基具有生长迅速和活菌滴度高的特点。

实施例3：

应用实施例

制备的培养基分离纯化牛鼻支原体的方法如下：

1、用无菌棉签采集牛的鼻拭子，接种到4.5 ml的液体培养基中，用力挤压，弃去棉签。用液体培养基作3个十倍稀释，稀释到10^-3，将梯度稀释样品置37℃恒温培养箱中培养，每天观察液体培养基的颜色变化和有无絮状物出现。5天后无论液体培养物颜色变化与否，进行盲传，将液体培养物接种到固体培养基中进行培养；24小时若肉眼观察出现混浊，可将培养物经0.45 μm的滤膜过滤后移植，按1:10的比例转接到新的液体培养基或用接种环在固体培养基上划线培养；若24小时仍未出现颜色变化及混浊，继续培养，待颜色变黄后立即转接新的液体培养基和固体培养基；

2、 固体培养基培养5-7天，低倍镜下观察菌落的形态及生长情况，用一次性灭菌巴氏吸管吸取单一菌落接种到4.5 ml液体培养基中培养，再将变黄的培养物接种到固体培养基，重复该步骤，直到得到支原体特征菌落。如果经过一代盲传不能得到特征菌落，可以进行多代盲传，直至得到特征菌落。通常情况下，经过三代盲传后即会分离出特征菌落，如果三代盲传后还没有发现特征菌落，那该培养物中可能不含有支原体。

3、上述接种支原体特征菌落生长变黄的液体培养物，用0.45 μm的滤膜过滤。取0.2 ml过滤培养物（原液）加到1.8 ml液体培养基中做连续10倍稀释，稀释到10^-7；取100 μL原液和不同稀释度的培养物分别涂布在固体培养基中，37℃ 5%CO₂培养箱培养5天，固体培养基长出肉眼可见的针尖大小、灰白色小菌落；在低倍显微镜观察到边缘较为整齐，中间部分致密、边缘疏松的圆形菌落。

4、选取单个菌落并在平板底部做好标记，用一次性灭菌巴氏吸管吸取单一菌落接种到4.5 ml液体培养基中培养，当液体由红色变为黄色时，重复该步骤；如此重复3次，得到纯化的牛鼻支原体，如图1所示，在冻存管中将培养物和甘油混合至甘油终浓度为25%，置-80℃保存。

实施例4：

应用实施例：

制备的培养基分离纯化牛鼻支原体的方法如下：

1、无菌条件下取病样肺脏组织，剪碎至米粒大小，取剪碎病样肺脏组织0.5 g接种到4.5 ml的液体培养基中，用液体培养基至少作3个十倍稀释，稀释到10^-3，将梯度稀释样品置37℃恒温培养箱中培养，每天观察液体培养基的颜色变化和有无絮状物出现。5天后无论液体培养物颜色变化与否，进行盲传，将液体培养物接种到固体培养基中进行培养；24小时若肉眼观察出现混浊，可将培养物经0.45 μm的滤膜过滤后移植，按1:10的比例转接到新的液体培养基或用接种环在固体培养基上划线培养；若24小时仍未出现颜色变化及混浊，继续培养，待颜色变黄后立即转接新的液体培养基和固体培养基；

2、 固体培养基培养5-7天，低倍镜下观察菌落的形态及生长情况，用一次性灭菌巴氏吸管吸取单一菌落接种到4.5 ml液体培养基中培养，再将变黄的培养物接种到固体培养基，重复该步骤，直到得到支原体特征菌落。如果经过一代盲传不能得到特征菌落，可以进行多代盲传，直至得到特征菌落。通常情况下，经过三代盲传后即会分离出特征菌落，如果三代盲传后还没有发现特征菌落，那该培养物中可能不含有支原体。

3、上述接种支原体特征菌落生长变黄的液体培养物，用0.45 μm的滤膜过滤。取0.2 ml过滤培养物（原液）加到1.8 ml液体培养基中做连续10倍稀释，稀释到10^-7；取100 μL原液和不同稀释度的培养物分别涂布在固体培养基中，37℃ 5%CO₂培养箱培养5天，固体培养基长出肉眼可见的针尖大小、灰白色小菌落；在低倍显微镜观察到边缘较为整齐，中间部分致密、边缘疏松的圆形菌落。

4、选取单个菌落并在平板底部做好标记，用一次性灭菌巴氏吸管吸取单一菌落接种到4.5 ml液体培养基中培养，当液体由红色变为黄色时，重复该步骤；如此重复3次，即可得到纯化的牛鼻支原体，在冻存管中将培养物和甘油混合至甘油终浓度为25%，置-80℃保存。

实施例5: 本发明培养基与现有技术几种培养基牛鼻支原体分离的敏感性试验

在相同的条件下，用本发明所提供的牛鼻支原体培养基与现有技术2种培养基对牛鼻支原体PCR阳性的15份牛鼻拭子进行分离。具体方法如下：将15份牛鼻拭子分别接种本发明所提供的牛鼻支原体培养基与现有技术培养基（培养基中均含有抑制杂菌生长的醋酸铊、青霉素或氨苄青霉素），用相应液体培养基作3个十倍稀释，稀释到10^-3，置37℃恒温培养箱中培养，每天观察培养基颜色变化情况，观察至3周。根据培养物的颜色变化情况和PCR鉴定，判定牛鼻支原体的分离情况。3种培养基牛鼻支原体病料检出率比较结果见表3。

表3

结果显示，本发明所提供的牛鼻支原体培养基对牛鼻支原体PCR阳性的15份鼻拭子分离培养，牛鼻支原体的检出率为100.0%，而现有技术GS培养基牛鼻支原体的检出率为80.0%，SP-4培养基牛鼻支原体的检出率为93.3%，说明本发明的牛鼻支原体培养基的检出率高于现有技术培养基。

活菌滴度和病料的检出率结果表明，本发明的牛鼻支原体培养基与现有技术相比，具有生长迅速和滴度高的特点，分离出牛鼻支原体的成功率高。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于牛鼻支原体分离纯化的液体培养基，其特征在于，每1000ml液体培养基是由以下组分制备得到的：PPLO肉汤10.5 g、脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09 g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03 g、葡萄糖5.0 g、水解乳蛋白5.0 g、25%新鲜酵母浸出液60 ml、1%酚红2.5 ml、无菌猪血清100 ml、无菌马血清100 ml、氨苄青霉素100 mg、10%醋酸铊1 ml、余量为去离子水；

所述25%新鲜酵母浸出液的制备方法为：取鲜酵母500g，加入去离子水2000 ml中，搅拌溶解，用盐酸溶液调pH值至4.5-5.0，80℃水浴30分钟，3000 转/分离心20分钟，取上清液，将上清液用1 M NaOH调pH值至7.8，煮沸，置室温放凉后用双层滤纸过滤，再补水至2000ml，即得到25%新鲜酵母浸出液，-20℃保存备用；所述盐酸溶液中，按照体积比浓盐酸：水为1：1。

2.一种用于牛鼻支原体分离纯化的固体培养基，其特征在于，所述用于牛鼻支原体分离纯化的固体培养基中，每1000ml固体培养基是由以下组分制备得到的：PPLO肉汤10.5 g、脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09 g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03 g、葡萄糖5.0 g、水解乳蛋白5.0 g、25%新鲜酵母浸出液60 ml、无菌猪血清100 ml、无菌马血清100 ml、氨苄青霉素100 mg、10%醋酸铊1 ml、琼脂粉15.0g、余量为去离子水；

所述25%新鲜酵母浸出液的制备方法为：取鲜酵母500g，加入去离子水2000 ml中，搅拌溶解，用盐酸溶液调pH值至4.5-5.0，80℃水浴30分钟，3000 转/分离心20分钟，取上清液，将上清液用1 M NaOH调pH值至7.8，煮沸，置室温放凉后用双层滤纸过滤，再补水至2000ml，即得到25%新鲜酵母浸出液，-20℃保存备用；所述盐酸溶液中，按照体积比浓盐酸：水为1：1。

3.一种权利要求1所述的用于牛鼻支原体分离纯化的液体培养基的制备方法，其特征在于，每1000ml液体培养基的制备方法为：

1）称取脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09 g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03 g、葡萄糖5.0 g，加490 ml去离子水混匀，加热溶解，再加入1%酚红2.5 ml，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为A液；

2）称取PPLO肉汤10.5 g、水解乳蛋白5.0 g，量取60 ml 25%新鲜酵母浸出液，加去离子水至300 ml，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为B液；

3）待A液、B液晾至50℃-55℃混合后，再在其中加入无菌猪血清和马血清各100 ml，再加入滤过除菌100 mg/ml氨苄青霉素1 ml和灭菌的10%醋酸铊1 ml，用灭菌去离子水调至1000 ml，用灭菌1 M NaOH调pH值到7.2-7.4，充分摇匀，得到液体培养基，置4℃保存备用。

4.一种权利要求2所述的用于牛鼻支原体分离纯化的固体培养基的制备方法，其特征在于，每1000ml固体培养基的制备方法为：

1）称取脑心浸出液8.0 g、氯化钠4.0 g、硫酸镁0.05 g、氯化钾0.2 g、氯化钙0.09 g、磷酸氢二钠0.024 g、磷酸二氢钾0.03 g、葡萄糖5.0 g，加490 ml去离子水混匀，加热溶解，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为A液；

2）称取PPLO肉汤10.5 g、水解乳蛋白5.0 g、琼脂粉15.0 g，量取60 ml/L 25%新鲜酵母浸出液，加去离子水至300 ml，混合后115℃高压灭菌20分钟，作为B液；

3）待A液、B液晾至50℃-55℃混合后，再在其中加入无菌猪血清和马血清各100 ml，再加入滤过除菌100 mg/ml的氨苄青霉素1 ml和灭菌的10%醋酸铊1 ml，用灭菌去离子水调至1000 ml，用灭菌1M NaOH调pH值到7.2-7.4，摇匀，倒平皿，得到固体培养基，置4℃保存备用。

5.根据权利要求1或2所述的一种用于牛鼻支原体分离纯化的培养基在牛鼻支原体分离纯化方法中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述牛鼻支原体分离纯化的方法包括以下步骤：

1）用无菌棉签采集牛的鼻拭子或无菌条件下剪切一小块肺脏组织接种到4.5 ml的液体培养基中，用液体培养基作3个以上的十倍稀释，稀释到10^-3，置37℃恒温培养箱中培养；同时取0.1 ml梯度稀释样品分别接种固体培养基，置37℃ 5%CO₂培养箱培养；每天观察液体培养基的颜色变化和有无絮状物出现，若5天仍不见液体培养基颜色变化，按1:10比例盲传接种至液体培养基和固体培养基进行培养；24小时若肉眼观察出现混浊时，表示有细菌污染，应将培养物经0.45μm的滤膜过滤后移植，按1:10的比例转接到新的液体培养基或用接种环在固体培养基上划线培养；若24小时后仍未出现颜色变化及混浊，继续在37℃恒温培养箱中培养，待颜色变黄后立即转接新的液体培养基和固体培养基；

2）上述固体培养基培养5-7天，低倍镜下观察菌落的形态及生长情况，用接种环无菌刮取平板上的菌落或用无菌巴氏吸管将带有单个菌落的琼脂块吸出，接种到新的液体培养基中培养生长，再将变黄的培养物接种到固体培养基上；重复该步骤，确保分离到支原体特征菌落；

3）上述培养支原体特征菌落生长变黄的液体培养物，在继代之前，用0.45μm的滤膜过滤以除去杂菌或细胞聚集物，有利于纯化，取0.2 ml过滤培养物原液加到1.8 ml液体培养基中做连续10倍稀释，稀释到10^-7，置37℃恒温培养箱中培养；取100μL原液和不同稀释度的培养物分别涂布在固体培养基中，37℃ 5%CO₂培养箱培养5-7天，固体培养基长出肉眼可见的针尖大小、灰白色小菌落；

4）将固体培养基置低倍显微镜下观察，选取单个特征菌落并在平板底部做好标记；用接种环刮取平板上的单个菌落或用灭菌巴氏吸管吸取单一菌落接种到4.5 ml液体培养基中培养，当pH值下降，液体由红色变为黄色时，重复步骤3）整体和步骤4）的前部操作；如此重复3次，得到纯化的牛鼻支原体，冻存管中培养物和甘油混合至甘油终浓度为25%，置-80℃保存。