CN109913396B - 一种液体培养基及利用其分离培养鸡毒支原体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种液体培养基，其由基础培养基和辅助培养基混合制备而成，基础培养基包含以下质量浓度(g/L)的组分：氯化钠3～7、氯化钾0.3～0.6、十二水合磷酸氢二钠1.5～3.5、七水硫酸镁0.1～0.4、磷酸二氢钾0.1～0.2、葡萄糖10～15、水解乳蛋白6～8以及酵母浸粉6～7；辅助培养基包含以下体积浓度(mL/L)的组分：胎牛血清40～80、青霉素1～2、酚红2～3、DMEM高糖培养基40～80、精氨酸8～10、半胱氨酸8～10以及辅酶I8～10。还公开该培养基的制备方法及利用该培养基分离培养鸡毒支原体的方法，提供更优越的生长的条件，加快代谢，利于缩短鸡毒支原体分离时间及提高分离率。

Description

一种液体培养基及利用其分离培养鸡毒支原体的方法

技术领域

本发明涉及兽医生物学技术领域领域，特别涉及一种液体培养基及利用其分离培养鸡毒支原体的方法。

背景技术

目前在养殖业中具有潜伏性感染的疾病主要是鸡毒支原体疾病，鸡毒支原体是鸡霉形体的一种。禽类常见致病的支原体可归为三类：鸡毒支原体、滑液支原体和火鸡支原体，其中鸡毒支原体对禽类养殖的危害最大。鸡毒支原体感染鸡只后会致鸡群爆发鼻窦炎、气管炎和气囊炎为主的慢性呼吸道疾病并伴随继发症状。鸡毒支原体疾病致死率较低，通常会导致病鸡生长缓慢、饲料转化率降低、肉鸡胴体品质下降以及蛋鸡产蛋率降低；另外鸡毒支原体感染鸡只后会导致病鸡的免疫力下降，从而增加其它病原体感染的机率。鸡毒支原体是禽类养殖场的一种常见呼吸道病原菌，在特定的情况下可随空气进入呼吸道定殖，通过吸附在呼吸道纤毛和上皮细胞表面而发挥作用。鸡毒支原体产生多种代谢物质和毒素，会引起呼吸道粘膜上皮细胞功能障碍，并且鸡毒支原体可以移行至肺和气囊导致肺和气囊病变，造成肺和气囊积液等。鸡毒支原体感染的典型特征表现为体重严重消瘦、咳嗽、流鼻涕和呼吸时发出啰音，病程缓慢并且较长。感染鸡毒支原体的家禽具有多种临床表现，即使没有明显的临床症状，也可能对家禽养殖业产生重大经济影响。该病也可引起其他继发性和混合性感染，降低鸡的生长速率以及饲料的转化率，并可引起鸡群的大量并发性死亡给养殖业带来不可估量的后果和经济损失。

目前很多抗生素在治疗鸡毒支原体感染方面效果较佳，但是随着用药时间的延长以及临床上不合理的药物治疗等，鸡毒支原体对药物的耐药性也随之产生。耐药性的产生对临床用药造成了巨大的影响，从而对细菌耐药性进行动态监控对阻止耐药性的蔓延和临床更加合理用药非常重要。因此临床分离鸡毒支原体菌株对鸡毒支原体对各种抗菌药物的敏感性检测意义重大，但是由于鸡毒支原体的分离培养比较困难，因此对临床后续研究造成巨大的困难。药物对鸡毒支原体的敏感性检测可以更加深入的了解菌株的耐药程度，但药物敏感性检测的前提需要一种高分离率的分菌方法和优质的鸡毒支原体培养方法做支撑。

鸡毒支原体临床分离菌株的获得是鸡毒支原体对药物敏感性检测的最直接的方法。临床分离菌株是将目的菌株通过专业的分菌以及培养技术从杂菌群中获得纯化后的单菌落的方法，传统方法采用解剖的肺等组织中分离鸡毒支原体，不能保证动物的完整性，并且用于培养鸡毒支原体的培养基，每代培养时间需要3-7天，由于分离菌株需要多代不断的筛选，需要耗费大量培养基，也造成耗时较长，分离率低等问题。因此，提供一种能提高鸡毒支原体临床分离率和缩短培养时间的分离方法，对于解决鸡毒支原体临床分离菌株所存在的问题以及临床后续研究意义重大。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种液体培养基，成分简单易得，用量较少，并且DMEM高糖、2种氨基酸及辅酶I的协同作用有利于鸡毒支原体生长，利于快速筛选单菌落的鸡毒支原体。

本发明还提供一种液体培养基的制备方法，通过此制备方法制备的液体培养基呈现酒红色，便于传代培养时通过颜色变化直接判断含有鸡毒支原体培养物的传代时间。

本发明还有一个目的是提供一种利用液体培养基分离培养鸡毒支原体的方法，通过采集喉头拭子方式和含有DMEM高糖、2种氨基酸及辅酶I的分离培养鸡毒支原体的培养基相结合，利于鸡毒支原体的生长，并提高了分离率及缩短了筛选时间。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种液体培养基，所述液体培养基是由基础培养基和辅助培养基混合制备而成，其中，所述基础培养基包含以下质量浓度的组分：氯化钠 3～7g/L、氯化钾 0.3～0.6g/L、十二水合磷酸氢二钠 1.5～3.5g/L、七水硫酸镁 0.1～0.4g/L、磷酸二氢钾 0.1～0.2g/L、葡萄糖 10～15g/L、水解乳蛋白6～8g/L以及酵母浸粉 6～7g/L；

所述辅助培养基包含以下体积百分比浓度的组分：胎牛血清 40～80mL/L、青霉素1～2mL/L、酚红2～3mL/L、DMEM高糖培养基40～80mL/L、精氨酸 8～10mL/L、半胱氨酸8～10mL/L以及辅酶I 8～10mL/L。

优选的是，所述基础培养基包含以下质量浓度的组分：氯化钠 6.26g/L、氯化钾0.5g/L、十二水合磷酸氢二钠 2g/L、七水硫酸镁 0.25g/L、磷酸二氢钾 0.125g/L、葡萄糖12.5g/L、水解乳蛋白6.25g/L以及酵母浸粉 6.25g/L；

所述辅助培养基包括以下体积百分比浓度的组分：胎牛血清 80mL/L、青霉素1.25mL/L、酚红2.5mL/L、DMEM高糖培养基80mL/L、精氨酸 10mL/L、半胱氨酸10mL/L以及辅酶I 10mL/L。

本发明还提供一种液体培养基的制备方法，将所述基础培养基的各种组分按配比溶解混合均匀后，用1mol/L NaOH调pH至7.8～8.2，密封，在105°C下高压蒸汽灭菌20min，放置于0～4°C条件下保存；

将所述辅助培养基中的酚红、精氨酸、半胱氨酸辅酶I分别溶解为质量浓度为1%、2%、1%和1%的溶液，青霉素溶解为10⁶IU/mL，再将所述辅助培养基中各组分分别无菌过滤后密封保存，使用时按照所述辅助培养基的添加比例与所述基础培养基混合。

本发明还提供一种利用所述的液体培养基分离培养鸡毒支原体的方法，包含以下的方法步骤：

步骤1：采集疑似呼吸道疾病活鸡的喉头拭子，并将所述喉头拭子上的粘液转入按上述制备方法制备的液体培养基中，于0～4℃静置过夜，得到培养液；

步骤2：所述培养液经无菌过滤，收集过滤液，将所述过滤液按体积比10～15%接种至所述液体培养基中进行液体培养至培养基变色，得到第一代变色培养物；

步骤3：将所述第一代变色培养物进行传代增菌，增菌变色的培养液涂布于固体培养基中养5～7天，挑取单菌落，得到鸡毒支原体。

优选的是，步骤1中所述喉头拭子上的粘液转入所述液体培养基的时间不超过20s；

步骤1中自所述静置过夜开始至步骤2中所述过滤开始之间不超过24h。

优选的是，步骤2中所述液体培养的条件为：37～38℃，5～7%CO₂；所述无菌过滤是采用0.22μm无菌滤头过滤所述培养液。

优选的是，所述固体培养基是在所述液体培养基的基础上，按质量浓度15～20g/L的比例添加琼脂，再于105℃下高压蒸汽灭菌20min后制备成筛选纯化鸡毒支原体的平板。

优选的是，步骤3中所述增菌变色的培养液涂布的体积为：每块所述平板涂布50～100μL；

所述固体培养的条件为：37～38℃、5～7%CO₂以及相对湿度65～80%。

优选的是，所述单菌落是以所述增菌变色的培养液涂布于所述固体培养基培养后，肉眼观察到针尖状大小的透明菌落，并且显微镜下能观察到所述透明菌落为油煎蛋状菌落为基准。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明公开的液体培养基中不但含有鸡毒支原体生长需要的基本营养物质，还包括DMEM高糖培养液和3种鸡毒支原体生长需要的氨基酸辅助营养物质，通过辅助营养物质和基本营养物质的协同作用，有利于促进鸡毒支原体的快速生长及代谢，进而利于缩短分离培养的时间，提高分离率。

本发明还公开了利用液体培养基分离培养鸡毒支原体的方法，通过采集喉头拭子，快速转移到本发明的液体培养基中作为运输培养基进行静置保存，并采用无菌滤膜除菌的方法得到的过滤液即为初始培养物，然后用所述液体培养基对初始培养物进行培养传代，此分离过程克服了传统分菌过程中使用醋酸铊造成对实验员和动物均不安全的不利因素，通过使用合适的无菌滤头进行除菌，操作简便，且避免了醋酸铊对鸡毒支原体的潜在影响，提高了鸡毒支原体的临床分离率。另外，通过DMEM高糖和菌株所需氨基酸的加入改善了现有培养基只能提供鸡毒支原体生长所需要的基本营养物质的现状，其中由于DMEM培养液是培养细胞不可或缺的一部分，而鸡毒支原体在细胞中潜在生长情况最好，DMEM高糖培养液的加入可营造一个细胞生长的营养条件，更加利于鸡毒支原体的生长，同时还能为鸡毒支原体生长提供非必需氨基酸如甘氨酸、微量元素如铁离子、促进代谢的中间产物如丙酮酸等成分，而精氨酸、半胱氨酸以及辅酶I的加入改善了鸡毒支原体生长对氨基酸的需求，而DMEM高糖和2种氨基酸及辅酶I同时加入协同促进鸡毒支原体代谢进程，进而缩短传代培养时间，提供分离率。

综上所述，本发明公布的液体培养基成分简单、易于获得且价格低廉，同时还能满足鸡毒支原体生长所需的多种营养物质，利于鸡毒支原体的快速生长，进而实现了缩短分离时间及提高分离率；同时利用该培养基分离培养鸡毒支原体的方法，是将该培养基应用于活鸡中采集喉头拭子分离鸡毒支原体的方法中，既保留动物的完整性，还减少醋酸铊造成对实验员和动物的不安全因素，并且该方法分离筛选鸡毒支原体单菌落的时间仅需要5～7天，鸡毒支原体的菌量可以达到10¹⁴CCU/mL，相对于传统分离方法大大缩短鸡毒支原体的分离时间，提高了鸡毒支原体的活菌滴度，在临床分离鸡毒支原体上具有可行性。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的利用液体培养基分离培养鸡毒支原体的方法的流程图；

图2为本发明所述的临床分离鸡毒支原体M19的PCR鉴定结果；

图3为本发明所述的临床分离鸡毒支原体M19在倒置显微镜下的状态（4×）。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种液体培养基，所述液体培养基是由基础培养基和辅助培养基混合制备而成，其中，所述基础培养基包含以下质量浓度的组分：氯化钠 3～7g/L、氯化钾 0.3～0.6g/L、十二水合磷酸氢二钠 1.5～3.5g/L、七水硫酸镁 0.1～0.4g/L、磷酸二氢钾 0.1～0.2g/L、葡萄糖 10～15g/L、水解乳蛋白6～8g/L以及酵母浸粉 6～7g/L；

所述辅助培养基包含以下体积百分比浓度的组分：胎牛血清 40～80mL/L、青霉素1～2mL/L、酚红2～3mL/L、DMEM高糖培养基40～80mL/L、精氨酸 8～10mL/L、半胱氨酸8～10mL/L以及辅酶I 8～10mL/L。

一个优选方案中，所述基础培养基包含以下质量浓度的组分：氯化钠 6.26g/L、氯化钾 0.5g/L、十二水合磷酸氢二钠 2g/L、七水硫酸镁 0.25g/L、磷酸二氢钾 0.125g/L、葡萄糖 12.5g/L、水解乳蛋白6.25g/L以及酵母浸粉 6.25g/L；

所述辅助培养基包括以下体积百分比浓度的组分：胎牛血清 80mL/L、青霉素1.25mL/L、酚红2.5mL/L、DMEM高糖培养基80mL/L、精氨酸 10mL/L、半胱氨酸10mL/L以及辅酶I 10mL/L。

在上述方案中，液体培养基中除包含传统培养基中鸡毒支原体生长需求的基本营养物质、抑制剂、指示剂等物质外，尤其含有DMEM高糖培养液和精氨酸、半胱氨酸及辅酶I，相比传统培养基，可以提供鸡毒支原体生长需要的非必需氨基酸、微量元素以及促进物质代谢的中间物质等成分，促进鸡毒支原体的快速生长，以使该培养基各成分在适宜的温度、pH等条件下协同作用，缩短每代的生长时间，提高分离率。

本发明提供一种液体培养基的制备方法，将所述基础培养基的各种组分按配比溶解混合均匀后，用1mol/L NaOH调pH至7.8～8.2，密封，在105°C下高压蒸汽灭菌20min，放置于0～4°C条件下保存；

将所述辅助培养基中的酚红、精氨酸、半胱氨酸及辅酶I分别溶解为质量浓度为1%、2%、1%和1%的溶液，青霉素溶解为10⁶IU/mL，再将所述辅助培养基中各组分分别无菌过滤后密封保存，使用时按照所述辅助培养基的添加比例与所述基础培养基混合。

在上述方案中，经上述方法制备的液体培养基为酒红色，使用本培养基分离筛选鸡毒支原体时，有酒红色变为橙黄色，即判断为含有鸡毒支原体的变色产物产生，易于判断传代的时间。

本发明还提供一种利用液体培养基分离培养鸡毒支原体的方法，包括以下方法步骤：

步骤1：用一次性无菌鼻腔植绒拭采集疑似呼吸道疾病活鸡的喉头拭子，并将所述喉头拭子上的粘液转入所述液体培养基中，于0～4℃静置过夜，得到培养液；

步骤2：所述培养液经无菌过滤，收集过滤液，将所述过滤液按体积比10～15%接种至所述液体培养基中进行液体培养至培养基变色，得到第一代变色培养物；

步骤3：将所述第一代变色培养物进行传代增菌，增菌变色的培养液涂布于固体培养基中固体培养5-7天，挑取单菌落，得到鸡毒支原体。

在上述方案中，实验室外分离鸡毒支原体是用专业的一次性无菌鼻腔植绒拭子采集疑似呼吸道疾病鸡的喉头拭子，随即放入液体培养基中用力涮去喉头拭子上的粘液，丢弃拭子，将带有喉头粘液的液体培养基放入4℃静置培养过夜（不超过24h，且涮去喉头拭子上的粘液是分离整个过程不能超过20s，避免引入更多的外界杂菌），轻拿轻放，然后通过培养过夜得到的培养液，经无菌滤膜过滤，除去粘液中本身的杂菌，此过程简单易操作，且避免也使用醋酸铊抑菌对实验人员和动物本身带来的不安全性或者对鸡毒支原体潜在的影响；再通过获得的过滤液经本发明液体培养基的传代培养进行增菌分离纯化，除了和传统培养基一样提供鸡毒支原体生长必须的基本营养物质以外，还提供了促进生长代谢的营养物质，以缩短每代的生长时间，提高分离率。通过本发明份液体培养基及再该方法下使用使用的培养条件的协同作用下，可使得分离培养鸡毒支原体的时间仅需5-7天，鸡毒支原体的菌量可以达到10¹⁴CCU/mL。

一个优选方案中，步骤1中所述喉头拭子上的粘液转入所述液体培养基的时间不超过20s；

步骤1中自所述静置过夜开始至步骤2中所述过滤开始之间不超过24h。

在上述方案中，时间的限制主要是为避免引入更多的外界环境中的杂菌，增加分离鸡毒支原体的难度。

一个优选方案中，步骤2中所述液体培养的条件为：37～38℃，5～7%CO₂；所述无菌过滤是采用0.22μm无菌滤头过滤所述培养液。

在上述方案中，根据鸡毒支原体具有可以滤过0.22μm无菌滤膜的特性而选择的滤膜；本发明液体培养的最佳条件为37.5℃、6%CO₂。

一个优选方案中，所述固体培养基是在所述液体培养基的基础上，按质量浓度15～20g/L的比例添加琼脂，再于105℃下高压蒸汽灭菌20min后制备成筛选纯化鸡毒支原体的平板。

一个优选方案中，步骤3中所述增菌变色的培养液涂布的体积为：每块所述平板涂布50～100μL；

所述固体培养的条件为：37～38℃、5～7%CO₂以及相对湿度65～80%。

一个优选方案中，所述单菌落是以所述增菌变色的培养液涂布于所述固体培养基培养后，肉眼观察到针尖状大小的透明菌落，并且显微镜下能观察到所述透明菌落为油煎蛋状菌落为基准。

在上述方案中，在传代培养时，过滤后的培养物进行传代，并将传代变色的培养物立即进行传代，増菌后即可进行涂布固体培养基制成的平板；对于未变色的则进行盲传，5天盲传一次，直至3代后仍未变色，则弃去，期间若有污染的培养物则也需要弃去，这些操作的目的也是为快速筛选到鸡毒支原体的单菌落，对于増菌涂布平板的菌液（每块平板涂布体积为50～100μL），根据上述的判断标准可以挑取获得鸡毒支原体的单菌落，但是若要进行活菌滴度、检出率及检出数等测定还需要在挑取单菌落的基础上用固体培养基继续纯化3代，以便于检出数据的准确性。

以下实施例中，为了使培养基的颜色变化更便于细菌生长代谢过程中观察，其中酵母浸粉购自英国Oxoid有限公司；水解乳蛋白（Difco）购自BIOSHARP生物科技有限公司。胎牛血清为浙江天杭生物科技股份有限公司生产。

下述实施例中试验方法所涉及的培养基所需的各种试剂，如无特殊说明，均为市售或者国药，特殊说明的均为特定的公司销售。

实施例1

利用液体培养基分离培养鸡毒支原体的方法，包括以下步骤：

步骤1：一次性无菌鼻腔植绒拭子采集疑似呼吸道疾病活鸡的喉头拭子，并将所述喉头拭子上的粘液立即转入液体培养基中（不超过20s），于0℃静置过夜，得到培养液；

步骤2：所述培养液用0.22μm无菌滤膜过滤，收集过滤液，将所述过滤液按体积比10%接种至所述液体培养基中，在37℃、5%CO₂条件下进行液体培养至培养基变色，得到第一代变色培养物；

步骤3：将所述第一代变色培养物按体积比10%接种于所述液体培养基，在37℃、5%CO₂条件下进行传代增菌直至变色，增菌变色的培养液按每块平板涂布50μL的比例均匀涂布于固体培养基上，在37℃、5% CO_2、相对湿度60%的培养环境中固体培养5天，挑取单菌落，得到鸡毒支原体。

其中，所述液体培养基是由基础培养基和辅助培养基混合制备而成，所述基础培养基包含以下质量浓度的组分：氯化钠 3g/L、氯化钾 0.3g/L、十二水合磷酸氢二钠 1.5g/L、七水硫酸镁 0.1g/L、磷酸二氢钾 0.1g/L、葡萄糖 10g/L、水解乳蛋白6g/L以及酵母浸粉6g/L；将基础培养基各成分搅拌混匀后，用1moL/L NaOH调PH至8.0（±0.2）左右，在105℃条件下高压蒸汽灭菌20min，放置4℃保存。

所述辅助培养基包含以下质量浓度的组分：胎牛血清 40mL/L、青霉素1mL/L、酚红2mL/L、DMEM高糖培养基40mL/L、精氨酸 8mL/L、半胱氨酸8mL/L以及辅酶I 8mL/L。将辅助培养基中的酚红、精氨酸、半胱氨酸及辅酶I 分别溶解为质量浓度为1%、2%、1%和1%的溶液，青霉素为100万IU/mL，再用无菌的0.22μm滤膜对辅助培养基中各组分分别过滤除菌后，按照上述添加比例添加至基础培养基中，随后按照实验需要定量分装。

固体培养基是在液体培养基组分的基础上按15g/mL添加琼脂后在105℃下高压蒸汽灭菌20min，再倒入无菌培养皿中制成平板，冷却后可用于涂布菌液。

上述实施例中，分离培养鸡毒支原体的平均时间为6～8天。

实施例2

利用液体培养基分离培养鸡毒支原体的方法，包括以下步骤：

步骤1：一次性无菌鼻腔植绒拭子采集疑似呼吸道疾病活鸡的喉头拭子，并将所述喉头拭子上的粘液立即转入液体培养基中（不超过20s），于4℃静置过夜，得到培养液；

步骤2：所述培养液用0.22μm无菌滤膜过滤，收集过滤液，将所述过滤液按体积比12%接种至所述液体培养基中，在37.5℃、5%CO₂条件下进行液体培养至培养基变色，得到第一代变色培养物；

步骤3：将所述第一代变色培养物按体积比12%接种于所述液体培养基，在37.5℃、6%CO₂条件下进行传代增菌，增菌变色的培养液按每块平板涂布80μL的比例均匀涂布于固体培养基上，在37.5℃、6% CO_2、相对湿度75%的培养环境中固体培养7天，挑取单菌落，得到鸡毒支原体。

其中，所述液体培养基是由基础培养基和辅助培养基混合制备而成，所述基础培养基包含以下质量浓度的组分：氯化钠 6.26g/L、氯化钾 0.5g/L、十二水合磷酸氢二钠2g/L、七水硫酸镁 0.25g/L、磷酸二氢钾 0.125g/L、葡萄糖 12.5g/L、水解乳蛋白6.25g/L以及酵母浸粉 6.25g/L；将基础培养基各成分搅拌混匀后，用1moL/L NaOH调PH至8.0（±0.2）左右，在105℃条件下高压蒸汽灭菌20min，放置4℃保存。

所述辅助培养基包括以下体积百分比浓度的组分：胎牛血清 80mL/L、青霉素1.25mL/L、酚红2.5mL/L、DMEM高糖培养基80mL/L、精氨酸 10mL/L、半胱氨酸10mL/L以及辅酶I 10mL/L。将辅助培养基中的酚红、精氨酸、半胱氨酸及辅酶I 分别溶解为质量浓度为1%、2%、1%和1%的溶液，青霉素为100万IU/mL，再用无菌的0.22μm滤膜对辅助培养基中各组分分别过滤除菌后，按照上述添加比例添加至基础培养基中，随后按照实验需要定量分装。

固体培养基是在液体培养基组分的基础上按18g/L添加琼脂后在105℃下高压蒸汽灭菌20min，再倒入无菌培养皿中制成平板，冷却后可用于涂布菌液。

上述实施例中，分离培养鸡毒支原体的平均时间为5～7天。

实施例3

利用液体培养基分离培养鸡毒支原体的方法，包括以下步骤：

步骤1：一次性无菌鼻腔植绒拭子采集疑似呼吸道疾病活鸡的喉头拭子，并将所述喉头拭子上的粘液立即转入液体培养基中（不超过20s），于4℃静置过夜，得到培养液；

步骤2：所述培养液用0.22μm无菌滤膜过滤，收集过滤液，将所述过滤液按体积比15%接种至所述液体培养基中，在38℃、7%CO₂条件下进行液体培养至培养基变色，得到第一代变色培养物；

步骤3：将所述第一代变色培养物按体积比15%接种于所述液体培养基，在38℃、7%CO₂条件下进行传代增菌直至变色，进行传代增菌，增菌变色的培养液按每块平板涂布100μL的比例均匀涂布于固体培养基上，在38℃、7% CO_2、相对湿度85%的培养环境中固体培养7天，挑取单菌落，得到鸡毒支原体。

其中，所述液体培养基是由基础培养基和辅助培养基混合制备而成，所述基础培养基包含以下质量浓度的组分：氯化钠7g/L、氯化钾0.6g/L、十二水合磷酸氢二钠3.5g/L、七水硫酸镁0.4g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、葡萄糖15g/L、水解乳蛋白8g/L以及酵母浸粉7g/L；将基础培养基各成分搅拌混匀后，用1moL/L NaOH调PH至8.0（±0.2）左右，在105℃条件下高压蒸汽灭菌20min，放置4℃保存。

所述辅助培养基包含以下质量浓度的组分：胎牛血清80mL/L、青霉素2mL/L、酚红3mL/L、DMEM高糖培养基80mL/L、精氨酸10mL/L、半胱氨酸10mL/L以及辅酶I 10mL/L。将辅助培养基中的酚红、精氨酸、半胱氨酸及辅酶I 分别溶解为质量浓度为1%、2%、1%和1%的溶液，青霉素为100万IU/mL，再用无菌的0.22μm滤膜对辅助培养基中各组分分别过滤除菌后，按照上述添加比例添加至基础培养基中，随后按照实验需要定量分装。

固体培养基是在液体培养基组分的基础上按20g/L添加琼脂后在105℃下高压蒸汽灭菌20min，再倒入无菌培养皿中制成平板，冷却后可用于涂布菌液。

上述实施例中，分离培养鸡毒支原体的平均时间为6～9天。

为了更好的体现本发明技术方案相对于其他技术方案的优越性，以现有技术中PPLO培养基作为对照1，同时为证明DMEM高糖培养液和精氨酸、半胱氨酸及辅酶I共同加入可促进鸡毒支原体生长，还将实施例2中培养基组分中去除精氨酸、半胱氨酸及辅酶I作为对照2，与实施例2进行对比实验分别进行临床鸡毒支原体的分离和分离株菌量滴度测定实验。

根据上述，对照2中液体培养基包含基础培养基和辅助培养基，基础培养基包含以下质量浓度的组分：氯化钠 6.26g/L、氯化钾 0.5g/L、十二水合磷酸氢二钠 2g/L、七水硫酸镁 0.25g/L、磷酸二氢钾 0.125g/L、葡萄糖 12.5g/L、水解乳蛋白6.25g/L以及酵母浸粉6.25g/L；辅助培养基包括以下体积百分比浓度的组分：胎牛血清 80mL/L、青霉素1.25mL/L、酚红2.5mL/L以及DMEM高糖培养基80mL/L。

试验一：不同培养基对养殖场鸡毒支原体分离率对比试验

1、试验方法

1）在养殖场分离鸡毒支原体一般是用专业的一次性无菌鼻腔植绒拭子采集疑似鸡呼吸道患病鸡的喉头拭子，随即放入本发明实施例2的液体培养基、对照1的液体培养基和对照2的液体培养基中用力涮去拭子上的粘液，丢弃拭子，将带有喉头粘液的培养基放入4°C培养过夜（分菌整个过程不能超过20s），得到培养液。

2）用PCR鉴定培养液，若为阳性则进行下一步纯化。使用无菌的0.22μm滤头进行除杂；除杂后的培养物需接种到实施例2的固体培养基、对照1的固体培养基和对照2的固体培养基中放置于37°C，5%CO_2、相对湿度85%条件下培养，待样品变色后要立即移植于固体培养基上进行涂板，培养5～7天后，肉眼对光若能看到针尖状大小的菌落，且在4倍倒置显微镜下可观察到“油煎蛋”状菌落，则为鸡毒支原体，进行PCR鉴定，鉴定引物和体系分别为表1和表2。

3）挑取单菌落继续进行纯化3代得到较纯的单菌落鸡毒支原体，可用于后续鸡毒支原体检出数、检出率的测定。对于未变色的培养物，继续盲传三代仍未变色则可弃去，纯化过程中污染的培养物也要弃去。

表1 鸡毒支原体PCR鉴定引物序列

表2 PCR体系构成

2、结果

2.1 3种培养基对临床鸡毒支原体分离率的试验结果

表3 3种培养基对临床鸡毒支原体分离率的试验结果的对比

从表3为3种培养基对临床鸡毒支原体分离率的实验结果可得出，相比现有对照1的PPLO培养基采用同样的分离条件分离培养的鸡毒支原体的检出率为40%，病原分离的平均时间为10～12天，而实施例2的检出率提高30%，平均检出时间最多可相差7天。

对照2和实施例2相比，检出率相差5%，分离的平均时间时间相差1～4天，由于本发明的液体培养基是在改良的FM-4培养基的基础上进行的改进和优化，说明DMEM的加入，有利于缩短分离时间，提高检出率，而DMEM和精氨酸、半胱氨酸及辅酶I同时加入，可通过相互的协同作用，进一步提高检出率，并在一周之内检测出鸡毒支原体。

2.2 实施例2临床分离鸡毒支原体的PCR鉴定结果

如图2所示，M 为DL500 DNA Marker，从上到下的条带依次是500 bp，300 bp，350bp，200 bp，150 bp，100 bp，50 bp；阳为阳性对照；阴为阴性对照，其余为实施例2临床分离的鸡毒支原体M19（三个重复，由左至右依次为M19₁，M19₂，M19₃），从图1可看出利用实施例2的分离培养方法筛选出的鸡毒支原体M19三个重复样品均为阳性，说明利用实施例2的分离方法成功分离出鸡毒支原体。

2.3实施例2临床分离鸡毒支原体在倒置显微镜下的状态（4×）

如图3所示，实施例2临床分离的鸡毒支原体M19在4×倒置显微镜观察到透明的菌落呈现油煎蛋的形状，据此可判断此时的固体培养基上已经形成单菌落的鸡毒支原体。

试验二：不同培养基活菌滴度的对比试验

1、试验方法

1.1 鸡毒支原体活菌滴度试验菌株

活菌滴度试验所选取的菌株为鸡毒支原体F疫苗株（苗得园等，畜牧兽医学报，2000.31（3），255-261）、标准菌株PG31（购自中国兽医微生物菌种保藏中心，保藏号为CVCC352）和临床分离鸡毒支原体M19（临床养殖场分离），通过实施例2的培养基、对照1的培养基和对照2的培养基分别测定这3株不同来源但均为鸡毒支原体的活菌滴度，从各方面更全面的证明培养基的类别是否更适合鸡毒支原体的生长。将这3株菌株分别接种于实施例2的液体培养基、对照1的液体培养基、对照2的液体培养基，待菌株传代复壮后，按照体积比12%的比例继续传代，放置37.5°C，6%CO₂培养箱中保存，培养基由红色变为橙黄色后，立即取出。

1.2 3种培养基中活菌滴度的测定

通过CCU测定法进行菌落计数。因支原体可代谢葡萄糖而产酸，该特性可致液体培养基发生变化，再以适当的指示剂进行检验，便可应用于间接测定培养物的含量。此方法称之为颜色变化单位(CCU)滴度实验。

将0.9mL实施例2的液体培养基、对照1的液体培养基以及对照2的液体培养基分装于无菌试管；将第1支试管中加入生长良好的液体培养物100μL，充分混匀；取第1支试管中100μL菌液于第2支试管中，充分混匀。依次顺序作10倍递减稀释，稀释至第20管，即10^-20，于37°C，5%CO₂恒温培养箱中培养，连续10天观察结果；同时设第21管为空白对照，当观察试管中颜色能发生变化的最高稀释度为该菌株的活菌滴度（CCU/mL），假设稀释度为10^-1的第1管到第9管(10^-9)均发生颜色变化，而稀释度为10^-10的第10管始终未发生颜色变化，则可判定该株鸡毒支原体的CCU数值为10⁹，其第1管液体培养物的滴度为10⁹CCU/mL，第9管的滴度为10CCU/mL。每个试验分别有3个平行。

2、结果

1.1 鸡毒支原体F疫苗株接种3种培养基CCU测定结果（如表4所示）

表4鸡毒支原体F疫苗株接种3种培养基CCU测定结果

1.2鸡毒支原体标准菌株PG31接种3种培养基CCU测定结果（如表5所示）

表5 鸡毒支原体PG31接种3种培养基CCU测定结果

1.3鸡毒支原体临床分离菌株M19接种3种培养基CCU测定结果（如表6所示）

表6鸡毒支原体M19接种3种培养基CCU测定结果

从表4-表6的结果看出，对于3种不同的菌种，实施例2的活菌滴度都明显高于对照1，而对照2和实施例2的培养基分离培养的鸡毒支原体虽然都能达到大于等于10¹⁴CCU/mL，但是最高检出率的检出时间实施例2要早于对照2，说明培养基中加入精氨酸、半胱氨酸及辅酶I可以促进DMEM高糖培养液及其他成分的相互协同作用，进而加快鸡毒支原体的生长速度，进而缩短检出时间，提高检出率。另外，对于同一菌株，3种培养基的活度滴度、检出时间、检出率同样遵循上述的规律。因此，从鸡毒支原体临床分离方法来看，该方法操作简便，且所用时间短，检测率高，而且避免使用醋酸铊可能导致的危害，同样可以将鸡毒支原体纯化分离出来，并且能使鸡毒支原体的检出时间缩短，检出率提高以及活菌滴度达到大于等于10¹⁴CCU/mL，也说明了本发明的液体培养基中DMEM高糖培养液和精氨酸、半胱氨酸及辅酶I的协同作用达到缩短分离培养时间，提高检出率，同时本发明的液体培养基对临床分离菌株来说要优于PPLO培养基。

综上所述，在FM培养基的基础上改进得到的本发明的液体培养基，成分简单易得，用量较少，可节约成本，适合大批量生产，同时相比现有传统培养基仅提供鸡毒支原体需要的基本成分的现状，经本发明提供的液体培养基各种成分的协同作用为鸡毒支原体生长创造更好的培养条件，促进物质代谢，进而缩短了分离和纯化时的生长时间，还提高了活菌滴度，该培养基更适合用于鸡毒支原体的分离培养方法中，也适宜用于运输培养基保存分离前的试验样品。

本发明利用上述液体培养基从活鸡中分离培养鸡毒支原体的方法，通过采集喉头拭子的方式使鸡毒支原体可以从活鸡中给检测分离纯化出来，保留了动物的完整性，避免由于菌株分离造成动物的浪费；而且用静置过滤除菌的方法代替了使用醋酸铊的方法，使实验人员和动物资源更加的安全无害。获得的单菌落鸡毒支原体后，通过固体培养基连续纯化3次，可以得到纯度更加高、活力更强菌株，更加有利于实验后期药物敏感性的检测。因此，在本发明所使用的温度、时间、pH等条件下制备的液体培养基，结合分离纯化鸡毒支原体的方法，能够在更短的时间内分离得到活菌滴度达到10¹⁴CCU/mL的鸡毒支原体，更加适用于临床生产。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与附图。

Claims (6)

1.一种利用液体培养基分离培养鸡毒支原体的方法，其特征在于，包含以下的方法步骤：

步骤1：采集疑似呼吸道疾病活鸡的喉头拭子，并将所述喉头拭子上的粘液转入液体培养基中，喉头拭子上的粘液转入所述液体培养基的时间不超过20s，于0～4℃静置过夜，得到培养液；

步骤2：所述培养液经无菌过滤，收集过滤液，静置过夜开始至过滤开始之间不超过24h，将所述过滤液按体积比10～15％接种至所述液体培养基中进行液体培养至培养基变色，得到第一代变色培养物；

步骤3：将所述第一代变色培养物进行传代增菌，增菌变色的培养液涂布于固体培养基中培养5～7天，挑取单菌落，得到鸡毒支原体；

所述液体培养基是由基础培养基和辅助培养基混合制备而成，其中，所述基础培养基包含以下质量浓度的组分：氯化钠3～7g/L、氯化钾0.3～0.6g/L、十二水合磷酸氢二钠1.5～3.5g/L、七水硫酸镁0.1～0.4g/L、磷酸二氢钾0.1～0.2g/L、葡萄糖10～15g/L、水解乳蛋白6～8g/L以及酵母浸粉6～7g/L；

所述辅助培养基包含以下体积百分比浓度的组分：胎牛血清40～80mL/L、青霉素1～2mL/L、酚红2～3mL/L、DMEM高糖培养基40～80mL/L、精氨酸8～10mL/L、半胱氨酸8～10mL/L以及辅酶I8～10mL/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基的制备方法是将所述基础培养基的各种组分按配比溶解混合均匀后，用1mol/L NaOH调pH至7.8～8.2，密封，在105℃下高压蒸汽灭菌20min，放置于0～4℃条件下保存；

将所述辅助培养基中的酚红、精氨酸、半胱氨酸、 辅酶I分别溶解为质量浓度为1％、2％、1％和1％的溶液，青霉素溶解为10⁶IU/mL，再将所述辅助培养基中各组分分别无菌过滤后密封保存，使用时按照所述辅助培养基的添加比例与所述基础培养基混合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述液体培养的条件为：37～38℃，5～7％CO2；所述无菌过滤是采用0.22μm无菌滤头过滤所述培养液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体培养基是在液体基础培养基的基础上，按质量浓度15～20g/L的比例添加琼脂，再于105℃下高压蒸汽灭菌20min后，与液体辅助培养基混合制备成筛选纯化鸡毒支原体的平板。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中所述增菌变色的培养液涂布的体积为：每块平板涂布50～100μL；

所述固体培养的条件为：37～38℃、5～7％CO₂以及相对湿度65～80％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单菌落是以所述增菌变色的培养液涂布于所述固体培养基培养后，肉眼观察到针尖状大小的透明菌落，并且显微镜下能观察到所述透明菌落为油煎蛋状菌落为基准。

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