CN114752541B - 鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法及其应用 - Google Patents

鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114752541B
CN114752541B CN202210678327.9A CN202210678327A CN114752541B CN 114752541 B CN114752541 B CN 114752541B CN 202210678327 A CN202210678327 A CN 202210678327A CN 114752541 B CN114752541 B CN 114752541B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycoplasma gallisepticum
chicken
infected
tilmicosin
model
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210678327.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114752541A (zh
Inventor
袁生
严秀
周明虎
宋姝缇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujian Brady Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Foshan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Foshan University filed Critical Foshan University
Priority to CN202210678327.9A priority Critical patent/CN114752541B/zh
Publication of CN114752541A publication Critical patent/CN114752541A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114752541B publication Critical patent/CN114752541B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Feed For Specific Animals (AREA)
  • Fodder In General (AREA)

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法及其应用。该构建方法包括以下步骤：将含鸡毒支原体的培养液与烟酰胺和多聚赖氨酸混合，得到注射液，注射液中，鸡毒支原体的浓度为（4.8‑5）×109CFU/mL，烟酰胺的质量浓度为0.05‑0.1%，多聚赖氨酸的质量浓度为0.1‑1%，得到的注射液通过给鸡每次注射0.08‑0.15mL，每间隔6‑8h注射一次，连续注射42‑48h，注射结束后，得到鸡毒支原体感染鸡模型。通过该鸡毒支原体感染鸡模型进一步构建药动‑药效同步模型。该鸡毒支原体感染鸡模型的阳性率达到97.8%，通过药动‑药效同步模型得出最佳给药量为9.12mg/kg。

Description

鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法及其应用。
背景技术
鸡、火鸡、鹧鸪、雉、孔雀等都可自然感染鸡毒支原体，尤其是雏鸡最容易感染，感染后主要的临床症状表现为呼吸困难，咳嗽、流鼻涕、结膜炎等呼吸道症状。该病造成的死亡率较低，但是会降低产蛋率、增加产出畸蛋率、减缓生长速率和降低饲料比，这会给养殖场造成严重的损失。
替米考星对鸡毒支原体具有杀灭或抑制作用，但如果给药量过低，则杀灭作用不明显，如果给药量过高，则容易产生兽药残留，造成食品安全的问题。因此，探究合适的给药量是十分有必要的。
现有技术中构建鸡毒支原体感染鸡体外药动-药效（即PD-PK）模型的优势在于，体外模型操作简单，可重复性强，能对病原菌和药物进行针对性研究。但缺陷在于鸡毒支原体在体外培养液和鸡体内的环境是不一样的，这种差异会导致替米考星对鸡毒支原体的作用效果产生影响，并且体外模型没有考虑到宿主对鸡毒支原体和替米考星之间的相互作用。因此，体外模型的准确性不高。
另外，现有技术中采用的构建鸡毒支原体感染鸡体内模型的方法所需构建时间较长，且构建的感染模型阳性率不高，这使得构建成本大大提升。
因此，亟需提供一种新的鸡毒支原体感染鸡模型构建方法，该构建方法可大大缩短构建所需时间，且感染模型的阳性率高，进一步的，通过该构建方法进一步获取的模型能得知最佳的给药量，是十分有必要的。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法及其应用，通过本发明所述的构建方法所构建的鸡毒支原体感染鸡模型，可大大缩短构建所需时间，且鸡毒支原体感染鸡模型的阳性率高。通过该鸡毒支原体感染鸡模型进一步构建药动-药效同步模型，计算得到在鸡毒支原体感染鸡中最佳的给药量，可有效解决给药量过低，则杀灭作用不明显，或给药量过高，则容易产生兽药残留，造成食品安全问题、容易产生耐药突变株的技术问题。
本发明的发明构思为：本发明在构建鸡毒支原体感染鸡模型的过程中，将鸡毒支原体培养液与烟酰胺、多聚赖氨酸混合，得到注射液，所述注射液中，鸡毒支原体的浓度为（4.8-5）×109CFU/mL，烟酰胺的质量浓度为0.05-0.1%，多聚赖氨酸的质量浓度为0.1-1%。采用所述注射液对鸡每次注射0.8-0.15mL，每间隔8h注射一次，连续48h（该注射过程也称为对鸡进行攻毒的过程），攻毒结束后，第3-4天检测鸡毒支原体感染鸡模型的阳性率达到97.8%。成功构建鸡毒支原体感染鸡模型后，给药替米考星，获得给药后的药动学数据和药效学数据，进行PD-PK（药动-药效）同步拟合，通过建立PK-PD同步模型揭示药动学和药效学的内在联系。通过拟合时间、药物浓度与药物效应，推论出作用部位的药物的浓度以及效应，为进一步指导临床给药奠定基础。本发明在鸡毒支原体感染鸡模型中进一步构建药动-药效同步模型，可以计算和描绘出给药剂量、浓度和效应之间关系，得出最佳给药量为9.12mg/kg。本发明在鸡毒支原体感染鸡模型中构建药动-药效同步模型是一种鸡体内模型，优点在于不仅考虑了药物在鸡体内的变化，也考虑了机体对病原菌的免疫作用，体现了机体、病原菌，药物三者的综合作用关系，对药理基础研究具有重要意义。
本发明的第一方面提供鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法。
具体的，鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法，包括以下步骤：
将含鸡毒支原体的培养液与烟酰胺和多聚赖氨酸混合，得到注射液，所述注射液中，鸡毒支原体的浓度为（4.8-5）×109CFU/mL，烟酰胺的质量浓度为0.05-0.1%，多聚赖氨酸的质量浓度为0.1-1%，得到的注射液通过给鸡每次注射0.08-0.15mL，每间隔6-8h注射一次，连续注射42-48h，注射结束后，得到鸡毒支原体感染鸡模型。
优选的，所述注射液中，鸡毒支原体的浓度为（4.9-5）×109CFU/mL，烟酰胺的质量浓度为0.05-0.08%，多聚赖氨酸的质量浓度为0.1-0.5%。
优选的，得到的注射液通过给鸡每次注射0.1-0.15mL，每间隔7-8h注射一次，连续注射42-48h，注射结束后，得到鸡毒支原体感染鸡模型。
优选的，所述鸡为1-3日龄雏鸡。
优选的，所述多聚赖氨酸为多聚-L-赖氨酸，CAS号为25988-63-0。
优选的，所述含鸡毒支原体的培养液中的鸡毒支原体是经过了复壮处理。
进一步优选的，所述复壮处理的过程如下：将处于对数生长期的鸡毒支原体培养液以5500-6000r/min转速离心25-35min，得到沉淀，稀释得到浓度为（4.8-5）×109CFU/mL的菌液，对鸡进行气管注射攻毒，每次注射0.08-0.15mL，每间隔7-8h注射一次，连续注射48h，将鸡处死，取肺组织，放于离心管中，匀浆后稀释后滴于固体培养基上，用于分离鸡毒支原体，然后将分离出来的鸡毒支原体用于传代扩大培养。用于构建鸡毒支原体感染鸡模型的鸡毒支原体可以是直接分离出来的鸡毒支原体，也可以是传代扩大培养后的鸡毒支原体。
优选的，所述含鸡毒支原体的培养液包括鸡毒支原体和液体培养基。
进一步优选的，所述液体培养基的制备过程如下：称取40-47.40g鸡毒支原体培养基粉，用1L的水溶解后灭菌（例如放置于高压锅116℃下25-35min灭菌）待冷却至58-60℃后加入灭活的80-200mL猪血清和除菌的0.01-0.06g半胱氨酸和辅酶（辅酶包括还原型辅酶Ⅰ，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，简称NADH），以及30-40mg头孢喹肟，混合。液体培养基在0℃以下（例如-4℃）保存。
优选的，所述固体培养基的制备过程如下：称取4-5g琼脂粉末与40-48g鸡毒支原体培养基粉混合，加1L水溶解，溶解后，进行灭菌（例如放置于高压锅116℃下25-35min灭菌），待冷却至58-60℃时，加入灭活的80-200mL猪血清和除菌的0.01-0.06g半胱氨酸和辅酶（辅酶包括还原型辅酶Ⅰ，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，简称NADH），以及30-40mg头孢喹肟。固体培养基在0-4℃保存。
优选的，检测鸡毒支原体感染鸡模型是否感染成功的方法包括观察临床症状、解剖后观察病理变化、分离鸡毒支原体后在显微镜下观察形态特征、鸡毒支原体抗体检测中的任意一种或多种（多种是指两种或超过两种）。
鸡毒支原体感染鸡模型的临床症状包括鸡出现精神萎靡、咳嗽、眼角有黄色分泌物、结膜炎症状中的一种或多种。
解剖后观察病理变化：病理解剖后可看到气囊有黄色分泌物和/或肺组织肿胀充血。
分离鸡毒支原体后在显微镜下观察形态特征：在固体培养基上分离攻毒后的鸡肺中的鸡毒支原体，可以在显微镜下看到典型的鸡毒支原体菌落的的形态，呈现出针尖状凸起点。菌落中间厚，呈现黑色圆点，两边略透明。整体像煎鸡蛋一样。
鸡毒支原体抗体检测：采用鸡毒支原体抗体检测试剂盒对鸡血清进行检测。鸡毒支原体抗体检测试剂盒是常规产品。
本发明的第二方面提供鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法在构建药动-药效同步模型中的应用。
具体的，所述应用包括以下步骤：
（1）药动学参数获取：对通过上述构建方法所得的鸡毒支原体感染鸡模型进行给药替米考星，然后处死鸡，测试鸡肺组织中替米考星浓度，绘制不同给药剂量下的替米考星浓度-时间曲线；测试体外替米考星对鸡毒支原体的最小抑菌浓度（MIC）数据，结合替米考星浓度-时间曲线、最小抑菌浓度数据，获取药动学参数；
（2）药效学参数获取：对通过上述构建方法所得的鸡毒支原体感染鸡模型给药替米考星，处死鸡，取鸡肺，检测鸡毒支原体数目，绘制替米考星在感染鸡体内的杀菌曲线，获取药效学参数；
（3）将步骤（1）获取的药动学参数和步骤（2）获取的药效学参数进行同步拟合，获取鸡毒支原体感染鸡模型中构建药动-药效同步模型，计算出最佳给药量。
优选的，步骤（1）中，所述替米考星的给药量为1mg/kg-30mg/kg，即每Kg鸡体重，替米考星的给药量为1-30mg。
优选的，步骤（1）中，在给药后0-144h取10-20个时间点（优选0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144h）处死鸡，取鸡肺，检测肺组织中的替米考星含量。
优选的，采用液相色谱质谱联用仪（HPLC-MS/MS）检测肺组织中的替米考星含量。
采用液相色谱质谱联用仪检测肺组织中的替米考星含量属于本领域常规操作。得到每个给药剂量下的替米考星浓度-时间曲线。
优选的，采用WinNonlin 6.1.0软件进行替米考星浓度-时间曲线数据拟合处理。
优选的，步骤（2）中，还设置了生理盐水对照组。
优选的，步骤（3）中，所述同步拟合是采用WinNonlin 6.1.0软件中的SigmoidEmax模型非线性回归分析整合步骤（1）获取的药动学参数和步骤（2）获取的药效学参数。
通过以下公式计算每日的替米考星给药量：
每日的替米考星给药量=（AUC/MIC）breakpoint×MIC×CL/（fu×F）；
其中，(AUC/MIC)breakpoint代表产生相应的抗菌效应下的AUC/MIC折点，CL为药物在机体内的的清除率（CL取值为0.075），MIC体外替米考星对鸡毒支原体最小抑菌浓度，F为替米考星的绝对生物利用度（F取值为89.19%），fu为药物在靶组织的游离分数（当药物在靶组织时，药物游离分数fu为1）。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
（1）本发明在构建鸡毒支原体感染鸡模型的过程中，将鸡毒支原体培养液与烟酰胺、多聚赖氨酸混合，得到注射液，所述注射液中，鸡毒支原体的浓度为4.8-5×109 CFU/mL，烟酰胺的质量浓度为0.05-0.1%，多聚赖氨酸的质量浓度为0.1-1%。采用所述注射液对鸡每次注射0.08-0.15mL，每间隔6-8h注射一次，连续注射42-48h（该注射过程也称为对鸡进行攻毒的过程），攻毒结束后，第3-4天检测鸡毒支原体感染鸡模型的阳性率达到97.8%，表明本发明所述的构建方法在短时间内就可成功构建鸡毒支原体感染鸡模型。
（2）成功构建鸡毒支原体感染鸡模型后，给药替米考星，获得给药后的药动学数据和药效学数据，进行PD-PK（药动-药效）同步拟合，通过建立PK-PD同步模型揭示药动学和药效学的内在联系。通过拟合时间、药物浓度与药物效应，推论出作用部位的药物的浓度以及效应，为进一步指导临床给药奠定基础。本发明在鸡毒支原体感染鸡模型中构建药动-药效同步模型，可以计算和描绘出剂量、浓度和效应之间关系，得出最佳给药量为9.12mg/kg。相比体外模型，本发明技术方案模型既考虑到宿主（鸡）对替米考星的处置作用，又反映了宿主对鸡毒支原体的防御作用，所获得的结果更接近宿主、鸡毒支原体和替米考星三者相互作用后的真实药效效果。
附图说明
图1为本发明实施例1鸡毒支原体感染鸡模型中的感染鸡进行解剖获得的气囊图；
图2为本发明实施例1鸡毒支原体感染鸡模型中的感染鸡进行解剖获得的肺组织图；
图3为本发明实施例1鸡毒支原体感染鸡模型中的感染鸡肺组织中鸡毒支原体在显微镜下的形态图；
图4为本发明实施例3的步骤（2）中1mg/kg给药剂量下的替米考星浓度-时间曲线；
图5为本发明实施例3的步骤（2）中30mg/kg给药剂量下的替米考星浓度-时间曲线；
图6为本发明实施例3的步骤（3）中不同给药量下的杀菌曲线；
图7为本发明实施例3的药动学参数AUC/MIC与药效学参数E的拟合曲线。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
受试菌种：以下实施例所用鸡毒支原体为鸡毒支原体标准强毒株S6，购自中国兽医药品监察所。
试验动物：以下实施例所用鸡为3日龄BWEL-SPF雏鸡，购于鸡新兴大华农禽蛋有限公司。平均体重50±10g，健康状况良好，不携带致病菌。对雏鸡随机进行药物残留检测，未发现雏鸡肺中含有替米考星。试验前将雏鸡放置在安静、通风、洁净、养殖密度适中以及温度在26℃的环境下养殖一天，使其适应养殖环境。给予不含抗生素、洁净无发霉的全价饲料（全价饲料可由广州市金利穗丰饲料有限公司提供）和洁净的饮用水让其自由采食。
以下实施例所用多聚赖氨酸为多聚-L-赖氨酸，CAS号为25988-63-0，由SIGMA化学公司提供。
鸡毒支原体培养基粉属于常规产品，可由上海雅吉生物科技有限公司提供。
鸡毒支原体抗体检测试剂盒是常规产品，可由深圳邦泰生物工程有限公司提供。
实施例1：鸡毒支原体感染鸡模型的构建
鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法，包括以下步骤：
将含鸡毒支原体的培养液与烟酰胺和多聚赖氨酸（多聚-L-赖氨酸）混合，得到注射液，注射液中，鸡毒支原体的浓度为5×109CFU/mL，烟酰胺的质量浓度为0.1%，多聚赖氨酸的质量浓度为0.5%，得到的注射液通过给雏鸡（雏鸡数量为60只）每次注射0.15mL，每间隔8h注射一次，连续注射48h，最后一次注射结束后的第24小时，得到鸡毒支原体感染鸡模型；
含鸡毒支原体的培养液中的鸡毒支原体是经过了复壮处理，复壮处理的过程如下：将处于对数生长期的的鸡毒支原体培养液以6000r/min转速离心30min，得到沉淀，用液体培养基稀释沉淀，稀释得到浓度为5×109CFU/mL的菌液（菌液中鸡毒支原体的浓度为5×109CFU/mL），对雏鸡进行气管注射攻毒，每次注射0.1 mL，每间隔8h注射一次，连续注射48h，将雏鸡处死，取肺组织，放置于带钢珠球的离心管中，匀浆后稀释后滴于固体培养基上，用于分离鸡毒支原体，然后将分出来的鸡毒支原体用于传代扩大培养3代，然后用于鸡毒支原体感染鸡模型的构建；
含鸡毒支原体的培养液包括鸡毒支原体和液体培养基，液体培养基的制备过程如下：称取47.40g鸡毒支原体培养基粉，用1L的水溶解后灭菌（放置于高压锅116℃下30min灭菌）待冷却至60℃后加入灭活的100mL猪血清（猪血清由江苏科晶生物有限公司提供）和除菌的0.06g半胱氨酸和辅酶（辅酶为还原型辅酶Ⅰ，半胱氨酸和辅酶各为0.03g），以及32mg头孢喹肟，混合；
固体培养基的制备过程如下：称取4.8g琼脂粉末与47g鸡毒支原体培养基粉混合，加1L水溶解，溶解后，进行灭菌（例如放置于高压锅116℃下30min灭菌），待冷却至60℃时，加入灭活的100mL猪血清和除菌的0.03g半胱氨酸和0.03g辅酶（辅酶为还原型辅酶Ⅰ），以及32mg头孢喹肟，混合；
检测鸡毒支原体感染鸡模型是否感染成功的方法采用观察临床症状、鸡毒支原体抗体检测中。鸡毒支原体感染鸡模型的临床症状包括鸡出现精神萎靡、咳嗽、眼角有黄色分泌物、结膜炎症状。鸡毒支原体抗体检测：采用鸡毒支原体抗体检测试剂盒对鸡血浆进行检测，鸡毒支原体抗体检测试剂盒是常规产品，例如可由深圳邦泰生物工程有限公司提供。两种方法检测的结果如表1所示，都显示鸡毒支原体感染鸡模型的阳性率可达到98.3%，表明通过本发明构建的鸡毒支原体感染鸡模型的成功率高。
表1
检测方法 结果 阳性率（%）
观察临床症状 59只鸡出现精神萎靡、咳嗽、眼角有黄色分泌物、结膜炎症状 98.3
鸡毒支原体抗体检测 60只鸡鸡毒支原体抗体检测阳性 100
另外，通过对本实施例构建的鸡毒支原体感染鸡模型中的鸡毒支原体抗体检测阳性的鸡进行解剖后观察病理变化，结果如图1和图2所示。
图1为本发明实施例1鸡毒支原体感染鸡模型中的感染鸡进行解剖获得的气囊图；图2为本发明实施例1鸡毒支原体感染鸡模型中的感染鸡进行解剖获得的肺组织图；图1显示病理解剖后可看到感染鸡的气囊有黄色分泌物，图2显示可看到感染鸡的肺组织肿胀充血。其它的感染鸡也出现气囊有黄色分泌物、肺组织肿胀充血现象。
采集感染鸡的肺组织，分离鸡毒支原体，肉眼可见针尖状凸起点。放置于显微镜下观察（如图3所示，图3为本发明实施例1鸡毒支原体感染鸡模型中的感染鸡肺组织中鸡毒支原体在显微镜下的形态图，放大4倍），可见中间厚，四周薄的荷包蛋样的菌落。其它的感染鸡的肺组织中也都分离出鸡毒支原体。
在按照本实施例1的过程，重复进行第二次实验，得到的鸡毒支原体感染鸡模型的阳性率如表2所示。
表2
检测方法 结果 阳性率（%）
观察临床症状 58只鸡出现精神萎靡、咳嗽、眼角有黄色分泌物或结膜炎症状 96.7
鸡毒支原体抗体检测 60只鸡鸡毒支原体抗体检测阳性 100
在按照本实施例1的过程，重复进行第三次实验，得到的鸡毒支原体感染鸡模型的阳性率如表3所示。
表3
检测方法 结果 阳性率（%）
观察临床症状 59只鸡出现精神萎靡、咳嗽、眼角有黄色分泌物或结膜炎症状 98.3
鸡毒支原体抗体检测 60只鸡鸡毒支原体抗体检测阳性 100
三次重复实验的平均阳性率为（98.3%+96.7%+98.3%）/3=97.8%。表明通过本发明构建的鸡毒支原体感染鸡模型的成功率高。
实施例2：鸡毒支原体感染鸡模型的构建
与实施例1相比，实施例2中的注射液注中，鸡毒支原体的浓度为4.9×109CFU/mL，烟酰胺的质量浓度为0.1%，多聚赖氨酸的质量浓度为0.1%，得到的注射液通过给鸡每次注射0.1mL，每间隔7h注射一次，连续注射42h，最后一次注射结束后的第24小时，得到鸡毒支原体感染鸡模型，其余过程与实施例1相同。通过鸡毒支原体抗体检测试剂盒检测显示鸡毒支原体感染鸡模型的阳性率达到97.2%。
实施例3：药动-药效同步模型的构建
在鸡毒支原体感染鸡模型中构建药动-药效同步模型的方法，包括以下步骤：
（1）药动学参数获取：将按照实施例1的方法构建的鸡毒支原体感染鸡模型鸡240只（即此处的240只鸡是感染了鸡毒支原体的鸡），随机分为2组，每组120只，分别用1mg/kg、30mg/kg的给药剂量给药替米考星，给药前12小时禁食，每组在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144h处死8只，采用液相色谱质谱联用仪（HPLC-MS/MS）检测肺组织中的替米考星浓度，绘制不同给药剂量下的替米考星浓度-时间曲线（结果分别为图4和图5所示）；测试体外替米考星对鸡毒支原体的最小抑菌浓度（MIC）数据，结合替米考星浓度-时间曲线、最小抑菌浓度数据，获取药动学参数（药动学参数记为AUC/MIC，其中AUC表示替米考星浓度-时间曲线面积，MIC表示最小抑菌浓度）；MIC的测试过程为本领域常规过程，具体为：将鸡毒支原体培养至对数期，菌液计数107CFU/mL，用排枪将100μL的液体培养基加入至96孔板的1-8列中，取100μL替米考星溶液（替米考星溶液浓度为0.5μg/mL）加入至第1列，充分混匀后，得到混合液体，将混合液体100μL加入置于至第二列，依次类推直到第8列，进行二倍倍比稀释，接着在所有列中加入100μL的鸡毒支原体含量为107CFU/mL的液体培养基，第9、10列分别加入200μl液体培养基和200μL的鸡毒支原体含量为107CFU/mL的液体培养基作为阴性和阳性对照组，最后将pH为6.8的液体培养基加（第11列与第9列加入的液体培养基的区别仅在于第11列加入的液体培养基的pH调节至6.8）在第11列中作为生长终点对照组，然后放置在37°C培养箱中培养，每天观看颜色变化，当阳性对照组的颜色与生长终点对照组的一样时，即到了生长终点，此时1-8列中未发生颜色变化的最低的替米考星浓度即为其对鸡毒支原体的MIC，MIC值为0.0156μg/mL；
（2）药效学参数获取：将另外按照实施例1的方法构建的鸡毒支原体感染鸡模型鸡240只（即步骤（2）中的鸡与步骤（1）中的鸡都是分别按照步骤（1）的处理过程得到的），随机分为8组，每组30只，每组分别给药替米考星1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、30mg/kg和10mg/kg生理盐水（给生理盐水的作为对照组），每组在给药前，以及在给药后的24h、48h、72h处死8只，取鸡肺，检测鸡毒支原体数目，绘制替米考星在感染鸡体内的杀菌曲线（结果如图6所示），进一步获取药效学参数（药效学参数记为E，E表示感染鸡体内鸡毒支原体数目在给药后与给药前相比的变化量，用对数表示，记为ΔLog10CFU/g）；
（3）将步骤（1）获取的药动学参数和步骤（2）获取的药效学参数进行同步拟合，获取鸡毒支原体感染鸡模型中构建药动-药效同步模型，计算出最佳给药量；
步骤（3）中，同步拟合是采用WinNonlin 6.1.0软件中的Sigmoid Emax模型非线性回归分析整合步骤（2）获取的药动学参数和步骤（3）获取的药效学参数。
图4为本发明实施例3中1mg/kg给药剂量下的替米考星浓度-时间曲线；图5为本发明实施例3中30mg/kg给药剂量下的替米考星浓度-时间曲线；通过图4计算出给药量为1mg/kg所对应的AUC值为13.62μg·h/g，通过图5计算出给药量为30mg/kg所对应的AUC值为464.23μg·h/g。再按照步骤（2）的过程得到2mg/kg、4mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg所对应的AUC值。进而可计算不同给药量下对应的药动学参数AUC/MIC。
图6为本发明实施例3的步骤（3）中不同给药量下的杀菌曲线；从图6（图6中的纵坐标“Log10CFU/g”表示每单位肺组织中鸡毒支原体的数目，鸡毒支原体的数目用对数表示）中可以看出，随着给药量的增加，鸡毒支原体数目逐渐下降。
将每个给药量的0-24h、0-48h、0-72h时间段对应的药动学参数AUC/MIC、药效学参数E（ΔLog10CFU/g）的关系列于表4。
表4
Figure 167828DEST_PATH_IMAGE001
然后按照表4中给出的药动学参数AUC/MIC、药效学参数E（ΔLog10CFU/g）利用药动学软件WinNonlin 6.1.0软件中的Sigmoid Emax模型进行拟合，拟合得到的曲线其R2为0.9223（结果如图7所示，图7为本发明实施例3的药动学参数AUC/MIC与药效学参数E的拟合曲线），说明AUC/MIC能很好的反应药物浓度在鸡体内不同时间段的抗菌效应。也表明药动学参数AUC/MIC与药效学参数E具有很好的拟合特点。
通过以下公式计算每日的替米考星给药量：
每日的替米考星给药量=（AUC/MIC）breakpoint×MIC×CL/（fu×F）；
其中，(AUC/MIC)breakpoint代表产生相应的抗菌效应下的AUC/MIC折点，CL为药物在机体内的的清除率（CL取值为0.075），MIC体外替米考星对鸡毒支原体最小抑菌浓度（MIC取值为0.0156μg/mL），F为替米考星的绝对生物利用度（F取值为89.19%），fu为药物在靶组织的游离分数（当药物在靶组织时，药物游离分数fu为1）。
当(AUC/MIC)breakpoint表示在达到杀菌效果所需要的AUC/MIC参数，即肺中的鸡毒支原体下降3Log10CFU/g的时候，(AUC/MIC)breakpoint为6950.15，代入公式，得出替米考星在感染鸡毒支原体的雏鸡的最佳替米考星给药量为9.12 mg/kg。
对比例1
与实施例1相比，对比例1中的注射液不含烟酰胺，则攻毒时间需要持续到72h，阳性率只有93.3%。
对比例2
与实施例1相比，对比例2中的不使用多聚赖氨酸，则攻毒时间需要持续到72h，阳性率只有95%。
对比例3
与实施例1相比，对比例3中的注射液中鸡毒支原体的浓度为3×109CFU/mL，其它过程与实施例1相同，对比例3对应的阳性率只有93.3%。
需要指出的是，在本发明请求保护的技术方案内，改变工艺参数，取得的技术效果与实施例3类似。

Claims (4)

1.鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含鸡毒支原体的培养液与烟酰胺和多聚赖氨酸混合，得到注射液，所述注射液中，鸡毒支原体的浓度为（4.9-5）×109CFU/mL，烟酰胺的质量浓度为0.1%，多聚赖氨酸的质量浓度为0.1-0.5%，得到的注射液通过给鸡每次注射0.08-0.15mL，每间隔6-8h注射一次，连续注射42-48h，注射结束后，得到鸡毒支原体感染鸡模型；
所述含鸡毒支原体的培养液包括鸡毒支原体和液体培养基，所述液体培养基的制备过程如下：称取40-47.40g鸡毒支原体培养基粉，用1L的水溶解后灭菌，待冷却至58-60℃后加入灭活的80-200mL猪血清和0.01-0.08g半胱氨酸和辅酶，以及30-40mg头孢喹肟，混合；
所述鸡为1-3日龄雏鸡；
所述含鸡毒支原体的培养液中的鸡毒支原体是经过了复壮处理，所述复壮处理的过程如下：将含处于对数生长期的鸡毒支原体的培养液以5500-6000r/min转速离心25-35min，得到沉淀，稀释得到浓度为（4.8-5）×109CFU/mL的菌液，对鸡进行气管注射攻毒，每次注射0.08-0.15mL，每间隔7-8h注射一次，连续注射48h，将鸡处死，取肺组织，放于离心管中，匀浆，稀释后滴于固体培养基上，用于分离鸡毒支原体，然后将分离出来的鸡毒支原体用于传代扩大培养。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，检测鸡毒支原体感染鸡模型是否感染成功的方法包括观察临床症状、解剖后观察病理变化、分离鸡毒支原体后在显微镜下观察形态特征、鸡毒支原体抗体检测中的任意一种或多种。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述固体培养基的制备过程如下：称取4-5g琼脂粉末与40-48g鸡毒支原体培养基粉混合，加1L水溶解，溶解后，进行灭菌，待冷却至58-60℃时，加入灭活的80-200mL猪血清和除菌的0.03-0.08g半胱氨酸和辅酶，以及30-40mg头孢喹肟。
4.一种权利要求1-3中任一项所述的构建方法在构建药动-药效同步模型中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
（1）药动学参数获取：对通过所述构建方法所得的鸡毒支原体感染鸡模型进行给药替米考星，然后处死鸡，测试鸡肺组织中替米考星浓度，绘制不同给药剂量下的替米考星浓度-时间曲线；测试体外替米考星对鸡毒支原体的最小抑菌浓度数据，结合替米考星浓度-时间曲线、最小抑菌浓度数据，获取药动学参数；
（2）药效学参数获取：对通过所述构建方法所得的鸡毒支原体感染鸡模型给药替米考星，处死鸡，取鸡肺，检测鸡毒支原体数目，绘制替米考星在感染鸡体内的杀菌曲线，获取药效学参数；
（3）将步骤（1）获取的药动学参数和步骤（2）获取的药效学参数进行同步拟合，获取药动-药效同步模型，计算出给药量；
步骤（1）中，所述替米考星的给药量为1mg/kg-30mg/kg；
所述同步拟合是采用WinNonlin 6.1.0软件中的Sigmoid Emax模型非线性回归分析整合步骤（1）获取的药动学参数和步骤（2）获取的药效学参数。
CN202210678327.9A 2022-06-16 2022-06-16 鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法及其应用 Active CN114752541B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210678327.9A CN114752541B (zh) 2022-06-16 2022-06-16 鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210678327.9A CN114752541B (zh) 2022-06-16 2022-06-16 鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114752541A CN114752541A (zh) 2022-07-15
CN114752541B true CN114752541B (zh) 2022-09-13

Family

ID=82336381

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210678327.9A Active CN114752541B (zh) 2022-06-16 2022-06-16 鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114752541B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1244581A (zh) * 1999-06-25 2000-02-16 江苏省农业科学院畜牧兽医研究所 鸡毒支原体克隆致弱株
WO2009002922A2 (en) * 2007-06-26 2008-12-31 Idexx Laboratories, Inc. Single dose roxithromycin
KR20100033869A (ko) * 2008-09-22 2010-03-31 재단법인 전라남도생물산업진흥재단 재조합 ｍｓｐａ 단백질을 이용한 마이코플라즈마 시노비애감염증의 혈청진단 방법
CN108949606A (zh) * 2017-06-29 2018-12-07 南京天邦生物科技有限公司 一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺
CN109913396A (zh) * 2019-04-22 2019-06-21 华中农业大学 一种液体培养基及利用其分离培养鸡毒支原体的方法
WO2021213949A1 (en) * 2020-04-20 2021-10-28 Intervet International B.V. A combination of vaccines to prophylactically treat a pig
CN114467855A (zh) * 2022-01-14 2022-05-13 广东海大集团股份有限公司 一种多病因气囊炎雏鸡模型的构建方法及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1244581A (zh) * 1999-06-25 2000-02-16 江苏省农业科学院畜牧兽医研究所 鸡毒支原体克隆致弱株
WO2009002922A2 (en) * 2007-06-26 2008-12-31 Idexx Laboratories, Inc. Single dose roxithromycin
KR20100033869A (ko) * 2008-09-22 2010-03-31 재단법인 전라남도생물산업진흥재단 재조합 ｍｓｐａ 단백질을 이용한 마이코플라즈마 시노비애감염증의 혈청진단 방법
CN108949606A (zh) * 2017-06-29 2018-12-07 南京天邦生物科技有限公司 一种鸡毒支原体高密度发酵培养工艺
CN109913396A (zh) * 2019-04-22 2019-06-21 华中农业大学 一种液体培养基及利用其分离培养鸡毒支原体的方法
WO2021213949A1 (en) * 2020-04-20 2021-10-28 Intervet International B.V. A combination of vaccines to prophylactically treat a pig
CN114467855A (zh) * 2022-01-14 2022-05-13 广东海大集团股份有限公司 一种多病因气囊炎雏鸡模型的构建方法及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Pharmacokinetic/pharmacodynamic profiles of baicalin against Mycoplasma gallisepticum in an in vivo infection model;Jiaxin Bao et al;《Poultry Science》;20211231;第1-9页 *
替米考星在健康鸡和鸡毒支原体感染鸡体内药动学研究;叶小妹;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）农业科技辑》;20200815(第08期);第2-4节 *
替米考星用于鸡毒支原体和大肠杆菌混合感染的临床试验;陈凤梅等;《中国家禽》;20050910(第21期);第17-19页 *
氢化可的松诱导鸡毒支原体感染模型的建立;谢道远等;《中国家禽》;20160610(第11期);第19-22页 *
鸡毒支原体SC克隆致弱株免疫原性测试――开放动物模型的建立与应用;邵国青等;《中国预防兽医学报》;19990501(第05期);第356-358页 *
鸡毒支原体人工发病封闭模型的建立;邵国青等;《江苏农业学报》;19981125(第04期);第42-44页 *
鸡毒支原体人工发病模型的建立;赖月辉等;《广东畜牧兽医科技》;20180618(第03期);第42-44页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114752541A (zh) 2022-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104189898A (zh) 铜绿假单胞菌疫苗及其制备方法
CN111254121A (zh) 一种沙门氏菌噬菌体及在防治沙门氏菌感染的疾病的药物中的应用
CN110607344A (zh) 一种兽用抗菌药物头孢喹肟pk/pd模型的构建方法及应用
CN110060784A (zh) 鸡毒支原体对达氟沙星的耐药判定标准试验方法
CN114752541B (zh) 鸡毒支原体感染鸡模型的构建方法及其应用
CN109568301A (zh) 一种没食子酸、大黄酸复合配方制备方法及其应用
CN111249264B (zh) 没食子酸在逆转猪链球菌对抗生素耐药性中的用途
CN104096222B (zh) 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
CN106834168B (zh) 一种猪链球菌2型弱毒株及其应用
CN116286671A (zh) 一株沙门氏菌噬菌体sp8、噬菌体组合物及其应用
CN113957007B (zh) 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗
CN110075289A (zh) 一种副猪嗜血杆菌、猪链球菌与胸膜肺炎放线杆菌三联灭活疫苗及其应用
CN106267176A (zh) 鸡传染性鼻炎疫苗组合物及其制备方法和应用
CN101249069B (zh) 一种替米考星长效注射液及其制备方法
CN101829321A (zh) 一种预防黄颡鱼红头病的疫苗
CN105727275B (zh) 一种鸭肝炎二价活疫苗及其制备方法
Fernandez et al. Efficacy of phosphomycin in the control of Escherichia coli infection of broiler chickens
CN108624522B (zh) 一种副鸡禽杆菌菌株及其应用
CN111675746A (zh) 科罗索酸及其衍生物在制备抗柔嫩艾美耳球虫的药物中的应用
CN110172524A (zh) 制定鸡产气荚膜梭菌对阿维拉霉素的耐药判定标准的方法
CN111154678B (zh) 马流产沙门氏菌驴源株及其在制备驴副伤寒灭活疫苗中的应用
CN103937706B (zh) 猪鼻支原体菌株及其灭活疫苗和应用
CN109125339A (zh) 一种miRNA抑制剂在制备抗结核菌药物中的应用
CN114736877B (zh) 一株杀鱼爱德华氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN115137733B (zh) 熊去氧胆酸在制备mcr-3酶抑制剂中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221202

Address after: 355300 No.1 Lianxi Road, rural village, suburb of Zherong County, Ningde City, Fujian Province

Patentee after: FUJIAN BRADY PHARMACEUTICAL CO.,LTD.

Address before: No.33 Guangyun Road, Shishan town, Nanhai District, Foshan City, Guangdong Province

Patentee before: FOSHAN University

TR01 Transfer of patent right