CN1244581A

CN1244581A - 鸡毒支原体克隆致弱株

Info

Publication number: CN1244581A
Application number: CN 99114277
Authority: CN
Inventors: 邵国青; 钱建飞; 侯继波; 何家惠; 还红华; 王继春; 倪艳秀
Original assignee: Institute Of Animal Husbandry And Veterinary Medicine Jiangsu Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Animal Husbandry And Veterinary Medicine Jiangsu Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 1999-06-25
Filing date: 1999-06-25
Publication date: 2000-02-16
Anticipated expiration: 2019-06-25
Also published as: CN1128214C

Abstract

本发明提供一株鸡毒支原体克隆弱毒株,该株由S6株三次固体克隆后无细胞培养致弱至168代次以上,形成有免疫原性的弱毒菌株。该株安全,不返强,易检测,有较强的免疫原性,能有效地预防鸡慢性呼吸道病。该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号是:CGMCCNo.0397。

Description

鸡毒支原体克隆致弱株

本发明属微生物新菌株。

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)是鸡慢性呼吸道病(Chronic Respiratory Disease of Chicken，CRD)的主要病原，因其广泛的致病性和严重的经济损失而引起重视。近年来，MG的研究从常规的病原分离，血清学试验，免疫和药物控制发展到分子生物学研究，使人们从本质上更深入地了解了MG的属性，并为MG感染的控制提供了新技术。从家禽中分离的支原体有20种之多，但危害鸡群的主要有3种：MG，滑液囊支原体(M.Synoviae.MS)、火鸡支原体(M.Meleagritis MM)。MS不同分离株致病力差异较大，主要病变在滑液囊、腱鞘和关节，也有的引起产蛋减少。MM引起火鸡传染性窦炎和火鸡气囊炎。危害最大是MG感染，它引发的症状表现在呼吸系统，主要病变在气囊。本病分布于世界各地，死亡率不高，少数可达20％-30％，发病率高达90％以上，使幼鸡生长不良，产蛋减少，造成重大损失。国外许多重型种鸡场均已消灭了本病。据1990年江苏省7个市25个鸡场调查，阳性率达48.5％，目前CRD在大型鸡场已成为与马立克氏病、法氏囊病、产蛋减少综合症(EDS-76)并列重要的威胁养鸡的四大病害之一。

MG菌体细小，卵圆形，直径约0.25-0.5微米，革兰氏阴性，姬姆萨氏染色和瑞氏染色着色良好，能发酵葡萄糖，培养时营养要求较高，在固体培养基上5-6天形成光滑圆形半透明小菌落，直径0.2-0.3毫米，中心稍有突起。

7日龄鸡胚卵黄囊接种，部分于5-7天后死亡，并产生特征性病变：呼吸道干酪样渗出物，关节脓肿，肝脾肿大，心包炎，全身水肿，肝脏坏死，连续传代死亡更加规律明显，在胚中卵黄囊和绒毛膜中含毒量最高。

病原在感染鸡上呼吸道存在较多，下呼吸道、气囊、卵巢、输卵管中也能分离到。能凝集鸡红细胞，感染鸡有血凝抑制抗体，故可用HI诊断本病。

病原抵抗力不强，20℃鸡粪中存活1-3天，卵黄中37℃可存活8周，对热有一定抵抗力，45℃可存活1小时，低温下在鸡舍的尘埃、粪便、饲料或饮水中可长期生存。MG冻干组织4℃可存活14年。一般消毒药均能将其迅速杀死，对青霉素、新霉素、多粘霉素、磺胺类药物及低浓度的醋酸铊(1∶4000)有抵抗力，对链霉素和其他许多广谱抗生素如土霉素、金霉素、氯霉素、卡那霉素及红霉素等敏感，阳性鸡场使用泰乐菌素、强力霉素、利高霉素、林可霉素(Linco-spectin 100)、支原净(泰妙灵Tiamulin)、高力米先(Gallimycin)及北里霉素等均有较好疗效。

由于MG只有一个血清型，为防制CRD，国外研究了许多疫苗株，如日本的G250株，法国的CP株，美国的F株，澳大利亚的Ts株，但均存在一些问题。S6株是MG的一个中毒株，国内免疫病理学试验也证明其毒力不强，免疫原性较差。

本发明的目的是提供一株鸡毒支原体克隆弱毒株，该株由S6株三次固体克隆后无细胞培养致弱至168代次以上，形成有免疫原性的弱毒菌株。该株安全，不返强，易检测，有较强的免疫原性，能有效地预防鸡慢性呼吸道病。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：支原体(Mycoplasma，M.亦称支原体)，最早由Nocard和Roux(1898)由牛传染性胸膜肺炎病例中分离到，第一种支原体即丝状支原体牛型亚种(M.mycoidessubsp.bovi/M.mycoides subsp.mycoides)分离后由于其性质难以界定，遂将这一大类微生物命名为类胸膜肺炎微生物(PPLOs)。五十年代中期，始用支原体这一名称。1967年，Edward和Frundt建议将其由裂殖菌纲分出来，单独成立一个新纲：软膜体纲(Mollicutes柔膜菌纲，软皮体纲)，支原体因缺少光合色素(叶绿素)，有别于裂殖藻纲；缺少坚硬的细胞壁和细胞壁成份，有别于裂殖菌纲；可以进行无细胞培养而有别于滤过性病毒。它是最小的能够自我复制的原核生物，基因组大小只有典型细菌的20-40％。国际细菌系统分类委员会软膜体纲分类分会(ICSB-ISTM)将软膜体纲分四个目：目I：支原体目(Order I，Mycoplasmatales)；目II：昆虫原体目(OrderII，Entomoplasmatales)；目III：无胆甾原体目(OrderIII，Acholoplasmatales)；目IV：厌氧原体目(OrderIV，Anaeroplasmatales)。支原体目下设一个科即支原体科(FamilyI，Mycoplasmataceae)，科内置两属：支原体属(Mycoplasma)，属内有120种；尿原体属(Ureaplasma)，属内有6种，常见的动物支原体属此两属。

鸡毒支原体克隆致弱株(以下简称JS99克隆株)的分类地位为：

原核生物界(Procaryotae)

软壁菌门(Teneribacteria)

软膜体纲(Mollicutes)

支原体目(Order I，Mycoplasmatales)

支原体科(FamilyI，Mycoplasmataceae)

支原体属(Mycoplasma)

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)

鸡毒支原体迄今全世界只有一个种，其模式株为：PG31(ATCC19610，NCTC10115)，S6，A5969.

鸡毒支原体JS99克隆株经系列生化试验证明为支原体属成员，生长抑制试验检测血清型证明与鸡毒支原体S6株为同一种。

目前，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是：CGMCC NO.0397。

下面对本发明的培养及鉴定作进一步描述：一、无细胞培养常用培养基配方A。牛心汤 1000ml烟酰胺 30mg葡萄糖 10g灭能马血清 200ml酚红 25mg25％酵母浸出液 40mlPH 8.0^*固体培养基1％琼脂B牛心消化汤 1000ml乳蛋白水解物 5gNaCl 5g25％酵母浸出液 50-100mlNAD(COI) 0.02g酚红 0.01-0.02g精氨酸 0.1-0.2gEagles最低需要培养液中维生素(100×) 10ml猪血清 150ml醋酸铊 0.25g青霉素 1000u/mlPH7.2^*固体培养基加1％琼脂，NAD为MS培养所必需C.改良的Hayflick培养基PPLO肉汤(Difco) 70ml马或猪血清 15-20ml20％酵母浸出液 5ml葡萄糖 1g精氨酸 0.2g1％酚红 0.1-0.2ml醋酸铊(1∶80) 1ml青霉素 1000u/mlD.牛心浸汁 75ml灭能健猪血清 12.5ml新鲜酵母浸液 1.3ml 1％酚红 0.2ml0.4％醋酸铊 1mlPH7.2^*牛心浸汁含1％葡萄糖，0.5％NaCl，0.5％多聚蛋白胨(Polypeptone)，10磅10分钟高压灭菌后保存，固体培养基用pplo琼脂3.5g加水75ml溶解，另加15ml猪血清，1.3ml新鲜酵母浸液。E Friis改进培养基：取成年健兔净肌肉和兔心肌125克，磨碎，煮沸30分钟，冷却过滤，上清1000毫升，加0.2％葡萄糖(A.R.)，20％灭能的健康猪血清，2.5％新鲜酵母浸出汁，所有材料低温下用1N NaOH溶液校正其pH到7.8，Φ0.1μl minipore滤器过滤去除细菌和支原体后，分装贮存于4℃冰箱内备用。二鸡毒支原体JS99株鉴定方法A 瑞氏染色法镜检：涂片、固定、干燥后，瑞氏染色，置显微镜下油镜1600倍，可见分散的大量具有特定多形态的菌体。B 固体菌落：鸡毒支原体JS99克隆株培养物作10⁶-10¹⁰稀释后，接种子PPLO Agar固体平板中，7％CO₂ 37℃培养4-8天可见特异性固体菌落，脐状明显，并对鸡红细胞有较强的血凝性。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、毒力较弱有安全性，并具有较好的免疫原性；

2、固体菌落脐状明显，血凝性强，易于检测；

3、连续在鸡上7代回归不返强，150-170代有免疫原性。

其试验结果如下：一、致弱和安全性试验结果1.材料与方法1.1试验材料1.1.1培养基：按常规方法配制Friis、KM₂、牛心汤培养基及PPLO固体培养基。1.1.2试验菌种：MG JS-99克隆株对照菌种：MG W 3野毒株，本室由CRD病鸡中分离，经与标准血清作生长抑制、凝集抑制试验鉴定证明为MG。1.1.3试验鸡由南京东郊种鸡场提供，SPF旦由扬州大学农学院提供。1.2菌种克隆

MG JS-99克隆株在Friis培养基上复状后，上清作10(6)～10(9)稀释(含0～10(2)ccu/ml)，按0.5ml/皿接种固体平板，37℃厌气培养36h-72h后，低倍镜下挑出单菌落克隆，在液体培养基上增殖后，重复上述步骤。经三次克隆后的培养物以标准血清鉴定为MG。1.3连续回归试验将MG JS-99克隆株F108培养物按0.5ml/只点眼、滴鼻接种1日龄京白雏鸡，到15日龄无菌采集试验鸡肺、气管、气囊样进行MG分离，分离物鉴定后，同上法重复，完成三次MG本动物回归。第三次分离物F126作10(3)稀释，卵黄囊接种9日龄SPF胚，每只0.1ml。鸡胚孵出后由雏鸡气管、肺、气囊中分离支原体，分离物鉴定后再接种SPF胚，在鸡胚中再实现连续三次回归。最后获得经本动物六次回归的MG JS-99克隆株F141培养物。1.4气管环致病性试验无菌手术采取一日龄雏鸡气管，Hank′s液轻洗后剪成0.5mm宽的气管环，随机分装于含pH7.5 MEM培养液的小瓶中，加入MG稀释培养物0.1ml(10(4)ccu/ml)。37℃培养，每天镜检，记录纤毛运动百分率，试验分为四组，每组4瓶，每瓶5环。1.5肉鸡致病性试验 6日龄AA肉鸡40只，抽样检测HA抗体阴性。随机分为三组，分别按0.5ml/只点眼、滴鼻接种MG JS-99克隆株F150、MG JS-99克隆株F144(第六次回归培养物)、W3野毒和MG培养基，14日后采血测HA抗体，同时检查临床症状和气囊病变。1.6免疫反应性试验 7日龄HA检测阴性的海赛克斯雏鸡30只随机分为3组，每组10只，第一组左胸气囊注射MG JS-99克隆株F153培养物0.5ml，第二组点眼，滴鼻MG JS-99克隆株F153培养物0.5ml，第三组空白对照，45日龄检查HA抗体，并观察临床症状和气囊病变。2.结果2.1回归试验表一MG JS-99克隆株F108六次连续回归试验结果

回归次数接种物代次回归对象 MG分离率气囊病率试验组对照组试验组对照组
回归次数接种物代次回归对象 MG分离率气囊病率试验组对照组试验组对照组	1 F108 1日龄雏鸡 6/6 0/3 0/6 0/32 F113 1日龄雏鸡 6/6 0/3 0/6 0/33 F121 1日龄雏鸡 5/6(1)0/3 0/6 0/34 F126 9日龄SPF胚 4/4(2)5 F134 9日龄SPP胚 3/3(2)6 F136 9日龄SPP胚 5/5

注：(1)一例气管、肺、气囊样均污染，分离未果。

(2)分别有1、2枚SPF胚在孵化中死亡。

历时两年的六次连续回归试验获得了不同回归代次的六株MG：F113、F121、F126、F134、F136、F141(结果如表一)，3次动物感染试验，从鸡体中均分离出MG，但并不引起气囊病变，初步显示MG JS-99克隆株F108，F113，F121对雏鸡已安全。第六次回归分离株F144经肉鸡致病性试验也证明并无返强现象(见表三)。本试验表明，MG JS-99克隆株F108以上代次培养物在鸡群中自然感染时可排除其返强的可能性。2.2不同毒株气管环培养致病性试验

由表二可见，气管环在MEM培养基中纤毛运动保持9天，证明气管环培养可靠。对纤毛运动的抑制作用，野毒株最强，弱毒三次回归株次之，MG JS-99克隆株F137最小。后两者差异不大，但与前者比较，差异明显。2.3肉鸡致病性试验

由表三可见，MG JS-99克隆株F150大剂量(10(8)～10(9)ccu)感染雏鸡不引起临床症状和气囊病变，连续经过本动物三次水平传播和三次垂直传播后的回归毒株仍很安全，而野毒株不仅能引起轻微的临床症状，还有明显的气囊病变。20日龄HA抗体检测还表明MG JS-99克隆株F150有较强的免疫原性。表二不同毒株对气管环培养纤毛运动的影响

感染菌株不同比例纤毛运动天数纤毛运动总分⁽¹⁾ 纤毛运动总天数50％ 25％ 10％
感染菌株不同比例纤毛运动天数纤毛运动总分⁽¹⁾ 纤毛运动总天数50％ 25％ 10％	JS-99F137 0 5⁽²⁾ 2 1.45 7JS-99F121⁽³⁾0 4 2 1.20 6W3野毒株 0 0 5 0.50 5MEM对照 2 4 3 2.30 9

注：(1))纤毛运动比例和运动天数之积的累计值。

(2)表示可连续5天观察到平均每环(10环累计平均数)有25％以上纤毛运动。

(3)3次回归分离株表三肉鸡致病性试验结果

接种内容 HA抗体阳性/试验鸡临床表现气囊病变⁽¹⁾6日龄 20日龄 - + ++ +++
接种内容 HA抗体阳性/试验鸡临床表现气囊病变⁽¹⁾6日龄 20日龄 - + ++ +++	JS-99F150 0/5 10/10 正常 10JS-99F144⁽²⁾0/5 10/10 正常 8 2W3野毒 0/10 8/10 轻度呼吸困难 2 1 6 1空白对照 0/5 1/10 正常 10

注：(1))气囊病变的评分标准：-，气囊透明；+，轻度混浊；++，少数小米粒大黄白色厚斑：+++，条块状黄白色干酪样物。气囊病变两侧有++或一侧有+++以上的试验鸡判为致病鸡。(2)六次回归培养物2.4免疫原性试验

左胸气囊接种和点眼、滴鼻感染鸡，45日龄HA检查均呈强阳性(10/10，10/10)，没有明显的临床症状，气囊病变均呈阴性。空白对照HA8/10阴性。结果表明MG JS-99F153有较强的免疫原性，同时也表明它为一安全、低毒株。

二、免疫原性试验结果1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌种JS-99克隆株F156，强毒株MG W3，强毒株MG HS2，NDV IV系弱毒和IBV H52弱毒。1.1.2透明塑料隔离器北京农业大学实验动物中心研制，试验时隔离器经过氧乙酸消毒后置于恒温、空气过滤的紫外消毒房间中。1.1.3氨水 25～28％，AR级，南京化工公司化工建材厂产。1.1.4试验鸡与饲养条件 SPF来航鸡，由山东农科院家禽研究所提供种蛋，消毒蛋壳后，孵化20d，过氧乙酸再消毒蛋壳后移入隔离器中出雏；48h内出壳且生长良好的雏鸡作试验鸡，隔离器饲养，饲养条件：温度25～29℃，湿度60～75％；饲料为普通混合料分装成小袋，每袋1～2kg，250md剂量的Co60辐照灭菌；饮水为蒸气高压灭菌的自来水。1.2诱导因子氨的浓度选择试验

关闭隔离器风机后，向隔离器内灭菌平皿中分别加入2、4、6、8、10ml氨水，挥发15min后，加盖取出平皿，测量挥发量，并计算隔离器内氨浓度。隔离器内氮浓度[1/1000000(质量分数)]＝氨水挥发量(ml)×100隔离器体积(m³)

维持2h，观察6只SPF鸡的反应。1.3 70/1000 000(质量分数)氨环境对鸡毒支原体人工发病的影响

20日龄试验鸡10只分为3组，第一组4只，测定MG攻毒后经70/1000 000(质量分数)氨刺激后的致病性；第二组4只，测定MG直接攻毒后的致病性：第三组2只，经氨刺激不攻毒对照。

攻毒方法：将MG W3F 11和HS2F524h培养物按1∶1混和，攻毒鸡点眼、滴鼻0.2ml，左胸气囊注射0.2ml。氨应激试验在攻毒后6h进行，吸6ml氨水溶液在平皿中挥发，15min后余5.6ml，隔离器内氨浓度达到70/1000 000(质量分数)，维持2h，每日进行2次，连续4d。攻毒后12天，扑杀试验鸡，剖检并记录气囊病变。1.4NDV、IBV弱毒诱导CRD人工发病试验

20日龄SPF鸡10只，分为三组，第一组4只滴鼻接种10头份NDV和IBV弱毒苗，10min后进行MG人工感染；第二组4只，仪作MG攻毒；第三组2只滴鼻接种10头份NDV、IBV弱毒苗，作不攻毒对照，攻毒后第12d扑杀试验鸡，剖检记录气囊病变。1.5NDV、IBV弱毒诱导和氨环境刺激的联合作用对CRD人工发病影响试验

30日龄SPF鸡13只分为三组，第一组7只进行NDV、IBV弱毒诱导(同1.4)及MG人工感染，并在70/1000,000(质量分数)氨环境下刺激；第二组4只，仅作MG攻毒；第三组2只进行NDV、IBV弱毒诱导及氨刺激，作不攻毒对照，发病检验同1.3。1.6 MG JS-99克隆株F156培养物免疫原性试验

MG JS-99克隆株F156 24h培养物(10(9)～10(11)ccu)按0.5ml/只点眼、滴鼻接种3日龄SPF鸡，免疫后逐日观察临诊表现，并于第10d、20d、30d抽血样，按常规方法(9)对血清样品作MG HA和HI检测，采血后免疫鸡、对照鸡分别标记后分批转入另一隔离器，按1.5第一组方法攻毒，攻毒后逐日观察临诊症状，12d后迫杀，解剖记录气囊病变。2结果2.1不同氨浓度环境下SPF鸡的反应观察结果见表l。由表1可见，30/1000 000～50/1000 000(质量分数)氨浓度不能引起持续明显的应激作用，而85/1000 000以上氨浓度会对鸡造成严重的伤害，甚至休克、死亡，70/1000 000的氨浓度可作为较适宜的应激条件。表1不同氨浓度下试验鸡的应激反应氨浓度(1/1000 000(质量分数)) 试验鸡反应

30 时有闭目，饮水、采食、活动正常

50 时有闭目、啄笼，饮食基本正常

70 羞明，常闭眼，偶有咳嗽，有时蹲伏，饮食减少

85 羞明，甩头，咳嗽，后期挤成一堆，挣扎不起

100 眼睑紧闭，呼吸困难，休克2.2 70/1000 000(质量分数)氨环境对MG人工发病的影响

结果见表2。由表2可见，单纯氨刺激不能引起试验鸡临诊症状和气囊病变，单纯用MG攻毒也仅引起轻度气囊病变，而增加氨应激作用后试验鸡大部分发病(3/4)，并表现一定症状。2.3NDV、IBV弱毒诱导CRD人工发病影响

结果见表3。由表3可见，经NDV、IBV弱毒诱导，MG人工感染的致病性明显增强，2/4可判为发病鸡，而单纯攻毒仅见3/4试验鸡有轻度气囊病变，未攻毒对照鸡气囊无病理变化表2 70/1000 000(质量分数)氨环境对MG人工发病的影响

组别试验鸡试验内容攻毒症状气囊病变^*只数 - + ++ +++
组别试验鸡试验内容攻毒症状气囊病变^*只数 - + ++ +++	1 4 攻毒，70/1000 000 2/4表现轻度呼吸困难5 1 3(质量分数)氨应激2 4 仅攻毒正常 1 33 2 不攻毒，70/1000 000 正常 2(质量分数)氨应激

^*气囊病变的评判标准：-气囊透明；+轻度混浊；++少数芝麻大小黄白色厚斑；+++条块状黄白色干酪样物气囊病变两侧有++或一侧有+++以上的试验鸡判为发病鸡。2.4弱毒诱导和氨环境刺激联合作用对MG人工感染的影响表3 NDV、IBV 弱毒诱导对CRD人工发病的膨响

组别试验鸡试验内容气囊病变^*
组别试验鸡试验内容气囊病变^*	只数 - + ++ +++1 4 NDV、IBV弱毒诱导，MG攻毒1 1 22 4 MG攻毒 1 33 2 NDV、IBV弱毒接种 2

表4两种诱因对MG人工感染的影响

组别试验鸡试验内容攻毒后症状气囊病变只数 - + ++ +++
组别试验鸡试验内容攻毒后症状气囊病变只数 - + ++ +++	1 7 NDV、IBV弱毒诱导，2/7表现呼吸困难 6 1MG攻毒、氨应激2 4 MG攻毒无异常 2 23 2 NDV、IBV弱毒接种，正常 2氨应激

由表4可见，经NDV、IBV弱毒诱导后，MG攻毒鸡经氨环境刺激，12d后完全发病(7/7)，从而建立了MG人工感染的动物模型。2.5MG JS-99克隆株免疫原性测定

结果见表5。试验组1.3、2.4、3.4不免疫不攻毒试验对照鸡在整个试验过程中未表现可视的呼吸道症状，血清学检查阴性及气囊病变阴性结果证明本批SPF来航鸡质量可靠。SPF蛋孵化前提取其卵黄抗体作HA和HI检测亦呈阴性。MG S6克隆致弱株通过回归试验、气管环培养纤毛运动损伤试验及动物试验已证明了它的安全性。本试验所有免疫鸡均未表现任何呼吸困难，气囊病变亦不明显，进一步证明了这一结论。试验鸡血清HA、HI检测结果除2.1组外均基本相符，试验鸡免疫接种20d后开始有抗体出现，30d后大部分(7/8)呈阳性。由1.2、2.2、3.2结果，利用NDV、IBV诱导，并在氨环境的刺激作用下进行MG强毒人工感染效果确实，这样保证了免疫鸡攻毒保护率的可靠性。免疫组及对照组攻毒后3～4d均有表现轻度呼吸困难，10d均恢复。而1.1、2.1、3.1分别与1.2、2.2、3.2组试验鸡病理解剖气囊病变结果表现出明显的差异，免疫鸡气囊多轻度变浊，免疫后10d、20d、30d攻毒保护率分别达80％、75％、87.5％，近期免疫效果证明，MG S6克隆致弱株有良好的免疫原性。表5.MG JS-99克隆株F156培养物免疫SPF来航鸡10d、20d、30d攻毒保护率的测定

组别试验内容鸡数免疫天数血清阳性率气囊病变攻毒免疫攻毒 HA HI - + ++ +++ 保护率
组别试验内容鸡数免疫天数血清阳性率气囊病变攻毒免疫攻毒 HA HI - + ++ +++ 保护率	1.1 + + 5 10 0/5 0/5 3 1 1 80％1 1.2 - + 3 0/3 0/3 1 21.3 - - 3 0/3 0/3 32.1 + + 4 20 4/4 1/4 2 1 1 75％2 2.2 - + 3 0/3 0/3 1 22.3 + - 2 20 1/2 0/2 22.4 - - 2 0/2 0/2 23.1 + + 8 30 8/8 7/8 7 1 87.5％3 3.2 - + 7 0/7 0/7 6 13.3 + - 2 30 0/2 0/2 1 13.4 - - 2 0/2 0/2 2

Claims

1.鸡毒支原体克隆致弱株，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是：CGMCC NO.0397。