CN105176882B - 一种牛摩氏摩根菌性关节炎灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种牛摩氏摩根菌性关节炎灭活疫苗及其制备方法，其步骤为通过病原分离、16S rRNA测序，确定病原为摩氏摩根菌，命名为摩氏摩根菌NL‑1株，保藏编号为CCTCC NO：M2015583。将此菌接种到培养基扩大培养，收获培养物，灭活后按4:1（V/V）比例加入氢氧化铝佐剂混合得到灭活疫苗。本发明所述摩氏摩根菌灭活疫苗免疫效果确实，免疫牛可获得至少5个月的保护期，能达到预防和控制牛摩氏摩根菌性关节炎的良好效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为一种牛摩氏摩根菌性关节炎灭活疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
摩氏摩根菌归属于肠杆菌科摩根菌属，由Morgan于1906年首次发现。该菌是一种腐物寄生菌，在自然界中广泛分布，常存在于人和动物的肠道内，是引起严重感染的条件致病菌。据报道称，摩氏摩根菌对多种动物有致病性，如海狸鼠、鳖、蛇、锦鲤、袋鼠、龟、猪和鸡等。该菌的感染能引起体表皮肤和肌肉溃烂、脓肿以及多种内脏器官的出血。此外，摩氏摩根菌还是医院继发性感染致病菌，引起人的肺炎、菌血症、尿道感染、胃肠炎、关节炎等。
牛摩氏摩根菌性关节炎是由摩氏摩根菌引起牛的一种疫病。该病在临床上可分为急性型和慢性型。急性型表现为中毒样症状，患牛急性死亡；慢性型常表现为关节炎，主要为膝关节肿大、关节液增多化脓，脓液伴有特殊气味的恶臭，患牛最终以淘汰或死亡为转归。目前，临床上主要以抗生素和化学药物对牛摩氏摩根菌性关节炎进行预防和控制，但抗生素的长期应用易产生耐药性，化学药物会造成残留、水体和环境的污染，而采用疫苗免疫则可以避免这些弊端。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以氢氧化铝为佐剂的牛摩氏摩根菌性关节炎灭活疫苗，使其免疫牛后副作用小，免疫产生时间早、免疫力强，免疫保护期长。
本发明利用从患关节炎的病牛关节液中分离得到的致病菌摩氏摩根菌（Morganella morganii ）NL-1，并于2015年9月28日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2015583。
本发明的目的是通过如下的方法实现的。
一种牛摩氏摩根菌性关节炎灭活疫苗，所述疫苗中含摩氏摩根菌NL-1菌量80-400亿CFU/mL、 20%（V/V）氢氧化铝佐剂。
所述牛摩氏摩根菌性关节炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：
1）制备菌液；
2）制备氢氧化铝佐剂；
3）配制疫苗，取菌液保存液与氢氧化铝佐剂混合成黄色混悬液，分装后密封保存。
制备菌液步骤主要由以下步骤完成：将摩氏摩根菌NL-1按0.1%接种量接种到发酵培养基，37℃培养24小时，调整到菌液浓度为100-500亿CFU/mL，再加入甲醛使其最终体积浓度为0.5%，置4℃灭活72小时制成灭活菌液。
制备氢氧化铝佐剂的步骤主要由以下步骤完成：将8wt.% AlCl3和4wt.% NaOH溶液按1:0.955的体积比混合，得到氢氧化铝胶体，115℃高压灭菌15min。
将菌液保存液与氢氧化铝佐剂按体积比4:1（V/V）比例混合成黄色混悬液，密封保存于4-8℃中，有效期6个月。
所述发酵培养基中含氯化钠1wt.%、蛋白胨1wt.%、酵母膏0.5wt.%、葡萄糖1wt.%和新生牛血清1%（V/V）。
本发明所述摩氏摩根菌NL-1制成的牛摩氏摩根菌性关节炎灭活疫苗，一次免疫可达到80%以上的保护力，免疫保护期至少可持续5个月，其免疫保护效果确实，制备工艺简单，具有良好的应用前景。
本发明的优点在于：该灭活疫苗制备方法简单、疫苗保藏和运输条件要求低、疫苗无毒力返强的风险、疫苗免疫后的保护效果好。
具体实施方式
实施例1
摩氏摩根菌NL-1（CCTCC NO：M2015583）的分离和鉴定
1. 无菌采取患关节炎病牛的关节液，划线接种于普通营养琼脂培养基上，37℃培养24h，挑取单个菌落获得纯培养物后，转接于普通营养琼脂斜面培养基上保存，供动物回归试验和鉴定用。普通营养琼脂平板上典型菌落为圆形，直径约1.5~2.0mm，无色或浅黄色，半透明，表明光滑、湿润，边缘整齐，无水溶性色素，培养物伴有特殊气味的恶臭。
2. 取上述斜面上纯培养菌，制成涂片标本，经革兰氏染色镜检细菌形态。再接种于普通营养培养基扩大培养，以109 CFU细菌接种两月龄犊牛的膝关节腔。革兰氏染色显示该菌为革兰氏阴性杆菌。动物回归试验能复制出摩氏摩根菌性关节炎，且能回收到病原。
3. 提取细菌基因组，用通用引物扩增16S rRNA。上游引物为fD1，序列为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物为rP1，序列为5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。将扩增得到的序列与GenBank中的序列进行BLAST分析。结果显示，与摩氏摩根菌16S rRNA基因序列的同源性为99%。
4. 根据细菌形态和培养特性，并结合16S rRNA基因序列测定结果，判定供试菌为摩氏摩根菌，并将该菌名命为摩氏摩根菌NL-1。
实施例2
摩氏摩根菌NL-1（CCTCC NO：M2015583）灭活疫苗的制备和安全性检测
1. 摩氏摩根菌NL-1（CCTCC NO：M2015583）灭活疫苗制备
将摩氏摩根菌NL-1划线接种于普通营养琼脂平板，挑取单个菌落转接到发酵培养基中进行扩大培养，作为种子液。将种子液按0.1%（V/V）接种量接种到发酵培养基，37℃180rpm培养24小时，即为培养好的疫苗菌液。调整疫苗菌液中活菌数为100-500亿CFU/mL，加入体积终浓度为0.5%的甲醛，于4℃灭活72小时。疫苗菌液灭活后按体积比1:4加入氢氧化铝佐剂，混合制得牛摩氏摩根菌性关节炎灭活疫苗。
2. 摩氏摩根菌NL-1（CCTCC NO：M2015583）灭活疫苗的安全性检测
a.无菌检测：取0.2mL牛摩氏摩根菌性关节炎灭活疫苗，涂布普通营养琼脂平板3块，37℃倒置培养24h-48h，观察有无细菌生长。结果为阴性，说明无细菌污染。
b.动物毒性试验：
（1）将牛摩氏摩根菌性关节炎灭活疫苗经腹腔注射5周龄BALB/c小鼠10只，每只小鼠注射0.5mL；再取10只5周龄BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌生理盐水0.5mL，作为对照组。观察7天。观察期间，灭活疫苗注射组和对照组小鼠均活泼健康，说明灭活疫苗安全。
（2）随机选取30日龄健康荷斯坦公犊牛15头，分为两组，每组5头。疫苗一组：颈部三角区肌肉注射2mL本发明的疫苗；疫苗二组：两侧颈部三角区肌肉各注射2mL（共4mL）本发明的疫苗；对照组：颈部三角区肌肉注射2mL灭菌生理盐水。观察30天。观察期间，疫苗一组、疫苗二组和对照组的犊牛均健康活泼，早晚体温、采食量和日增重差异均不显著，说明本发明的组织灭活疫苗安全。
实施例3
摩氏摩根菌NL-1（CCTCC NO：M2015583）灭活疫苗的免疫效果评价
随机选取体重相近、健康荷斯坦公犊牛90头，分为三组。疫苗组：30头犊牛于30日龄颈部三角区肌肉注射2mL本发明的疫苗，60日龄再次注射本发明的疫苗2mL；对照组：30头犊牛于30日龄颈部三角区肌肉注射2mL灭菌生理盐水，60日龄再次注射灭菌生理盐水2mL；正常对照组：30头犊牛作为正常对照组，不注射。实验动物观察6个月，观察期所有实验动物都采用相同的饲养管理方法。计算整个观察期实验动物由摩氏摩根菌引起的发病率和死亡率；计算2-4月龄，5-7月龄平均日增重。
结果：犊牛免疫摩氏摩根菌NL-1灭活疫苗后，由摩氏摩根菌引起的发病率和死亡率显著降低，2-4月龄平均日增重显著增加，5-7月龄平均日增重也明显增加。详细结果见表1、表2和表3。
表1 摩氏摩根菌NL-1灭活疫苗接种程序及剂量
注：二免在第一次免疫后的第30天进行。
表2 摩氏摩根菌NL-1灭活疫苗免疫后牛摩氏摩根菌性关节炎的发病率及死亡率
表3 摩氏摩根菌NL-1灭活疫苗免疫后牛平均日增重
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福清市默克兽医院
<120> 一种牛摩氏摩根菌性关节炎灭活疫苗及其制备方法
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acggttacct tgttacgact t 21
Claims (7)
1. 一种牛摩氏摩根菌，其特征在于：所述菌为摩氏摩根菌（Morganella morganii ）NL-1，已于2015年9月28日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏号为CCTCC NO：M2015583。
2.含有权利要求1所述牛摩氏摩根菌的一种牛摩氏摩根菌性关节炎灭活疫苗，其特征在于：所述疫苗中含摩氏摩根菌NL-1菌量80-400亿CFU/mL、体积分数为20%氢氧化铝佐剂。
3.一种如权利要求2所述牛摩氏摩根菌性关节炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：
1）制备菌液；
2）制备氢氧化铝佐剂；
3）配制疫苗，取菌液保存液与氢氧化铝佐剂混合成黄色混悬液，分装后密封保存。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：制备菌液步骤主要由以下步骤完成：将牛摩氏摩根菌NL-1按0.1%接种量接种到发酵培养基，37℃培养24小时，调整到菌液浓度为100-500亿CFU/mL，再加入甲醛使其最终体积浓度为0.5%，置4℃灭活72小时制成灭活菌液。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：制备氢氧化铝佐剂的步骤主要由以下步骤完成：将8wt.% AlCl3和4wt.% NaOH溶液按1:0.955的体积比混合，得到氢氧化铝胶体，115℃高压灭菌15min。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：将菌液保存液与氢氧化铝佐剂按体积比4:1（V/V）比例混合成黄色混悬液，密封保存于4-8℃中，有效期6个月。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基中含氯化钠1wt.%、蛋白胨1wt.%、酵母膏0.5wt.%、葡萄糖1wt.%和新生牛血清1%（V/V）。
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| Morganella morganii osteomyelitis complicated by secondary septic knee arthritis: a case report;Semmi Koyuncu et al;《Acta Orthop Traumatol Ture》;20121231;第46卷(第6期);摘要 * |
| 患病大鲵摩氏摩根菌的分离有鉴定;李瑞伟;《畜牧与收益》;20141231;第46卷(第1期);28-31 * |
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