CN109929772A - 一种鸭疫里默氏杆菌病区域优势血清型菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及两株鸭疫里默氏杆菌病区域优势血清型菌株及其应用。所述菌株为鸭疫里默氏杆菌RAHB‑1和鸭疫里默氏杆菌RAHB‑2，已保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)。将鸭疫里默氏杆菌RAHB‑1和鸭疫里默氏杆菌RAHB‑2接种培养获得的菌液混合后，经甲醛灭活、加氢氧化铝胶混合制备得到用于预防鸭浆膜炎的疫苗，所述疫苗安全性高，成本低廉，免疫效果好，容易吸收，为疫苗的临床应用提供了基本保证，且易于推广。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌病区域优势血清型菌株及其应用。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)病是重要的水禽细菌病，是严重危害养鸭业的重要疾病之一，是由鸭疫里默氏杆菌引起家鸭、火鸡、鹅和其它多种禽类的一种接触性传染病，又名鸭传染性浆膜炎，其主要的剖检病理变化为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、干酪性输卵管炎等。各种年龄的鸭均可感染，雏鸭最易感，2～6周龄多发，发病率和死亡率较高，而且常常与鸭大肠杆菌病混合感染。随着养鸭业的日益发展和集约化程度的提高，鸭疫里默氏杆菌病的发生日趋严重，给养鸭业造成了严重的经济损失。目前国内无有效的疫苗上市，主要通过抗菌药物控制本病。虽然抗菌药物能迅速控制本病，但停药后极易复发，且易产生耐药性，可引起禽产品中药物残留和食品安全问题。由于鸭疫里默氏杆菌感染宿主范围广，血清型众多，不同血清型之间缺乏免疫保护，给该病的防治工作带来很大困难，所以筛选出免疫原性好的优势血清型菌株生产针对性强的灭活疫苗对于防治该地的鸭疫里默氏杆菌病效果更好，可大大减少药物应用，对避免细菌耐药菌株的产生、减少药物残留、促进人类的健康具有重要的现实意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供两株鸭疫里默氏杆菌病区域优势血清型菌株及其应用。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
两株鸭疫里默氏杆菌病区域优势血清型菌株，其中一株分类命名为鸭疫里默氏杆菌 RAHB-1(Riemerella anatipestifer RAHB-1)，已于2018年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏号为CCTCC NO： M2018805；另外一株分类命名为鸭疫里默氏杆菌RAHB-2(Riemerellaanatipestifer RAHB-2)，已于2018年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M2018806。
上述鸭疫里默氏杆菌病区域优势血清型菌株的特性如下：
1)形态和生化特性：革兰氏染色为阴性短小杆菌、不运动、无芽孢，单个或成双，少数呈链状排列，瑞氏染色呈现两极浓染；生化特性符合细菌分类学中本菌的特性；
2)培养特性：在含5％小牛血清的TSA中厌氧培养24～48小时，形成圆形凸起、边缘整齐、透明、有光泽、呈奶油状的菌落；在麦康凯培养基上不生长；在含5％小牛血清的TSB中培养24～48小时，液体浑浊。
3)血清学特性：鸭疫里默氏杆菌RAHB-1(Riemerella anatipestifer RAHB-1)为Ⅰ型、鸭疫里默氏杆菌RAHB-2(Riemerella anatipestifer RAHB-1)为Ⅱ型。
4)毒力：将鸭疫里默氏杆菌RAHB-1、鸭疫里默氏杆菌RAHB-2菌株分别于含5％小牛血清的TSB中单独培养16～18小时得到各菌株的菌液0.5ml(含活菌0.2～0.5亿cfu)，然后将各菌液于腿部肌肉分别注射3～4周龄健康易感鸭10只，观察可得：皆出现明显临床症状，14日内死亡或活鸭内脏有明显病变。
5)免疫原性：用1周龄健康易感鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗(所述疫苗是由鸭疫里默氏杆菌RAHB-1和鸭疫里默氏杆菌RAHB-2分别接种培养获得的菌液混合均匀，再经甲醛灭活、加氢氧化铝胶混合后制备而成)0.3ml，21日后连同条件相同的对照鸭10只，腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌RAHB-1、鸭疫里默氏杆菌RAHB-2的混合菌液0.5ml(含活菌 0.2～0.5亿cfu)，所述的混合菌液是将鸭疫里默氏杆菌RAHB-1、鸭疫里默氏杆菌RAHB-2菌株分别于含5％小牛血清的TSB单独培养16～18小时得到的菌液混合得到的。观察14日，对照鸭全部发病或死亡，剖检后全部具有典型病变(反应在++以上)；免疫鸭保护10只，在观察结束时进行剖检，内脏无任何病变。
本发明中，所述的鸭疫里默氏杆菌病区域优势血清型菌株系对鸭疫里默氏杆菌病进行流行病学调查以获得鸭疫里默氏杆菌病的优势血清型，然后对湖北省不同地区分离的126株鸭疫里默氏杆菌，经培养特性、形态特征、生化特性、血清型鉴定、毒力试验和免疫原性试验，筛选而获得的两株致病性强、免疫原性好的优势血清型菌株。
所述的鸭疫里默氏杆菌菌株的分离方法如下：1)无菌操作取病、死亡鸭脑直接划线于含5％小牛血清的TSA平板上，置于烛缸中37℃培养24～48h，观察结果；2)从其中挑取可疑菌落，进行革兰氏染色和瑞氏染色，镜检，并划线于含5％小牛血清的TSA和麦康凯平板上，观察菌体形态及染色特征，结果可见分离菌在TSA中培养24小时后，形成圆形凸起、边缘整齐、透明、有光泽、呈奶油状的菌落；在麦康凯培养基上不生长；革兰染色为阴性短小杆菌、不运动、无芽孢，单个或成双，少数呈链状排列；瑞氏染色呈现两极浓染；3)从 TSA平板上挑取圆形隆起、光滑的菌落在含5％小牛血清的TSA平板上于烛缸中37℃进行纯培养24～48h，再次染色、镜检，若菌体形态和染色特性符合鸭疫里默氏杆菌的形态和染色特性时，挑取剩余的半个菌落接种于含5％小牛血清的TSA斜面培养基，烛缸中37℃培养 24～48h，即为分离纯化细菌。
一种用于预防鸭浆膜炎的疫苗，是由所述鸭疫里默氏杆菌RAHB-1和鸭疫里默氏杆菌 RAHB-2分别接种培养获得的菌液混合均匀，再经甲醛灭活、加氢氧化铝胶混合后制备而成。
上述用于预防鸭浆膜炎的疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)制苗用菌液的制备：将鸭疫里默氏杆菌RAHB-1和鸭疫里默氏杆菌RAHB-2分别接种至培养基上培养一段时间，收获培养物后，按体积比1︰1混合得到混合菌液，控制混合菌液中的活菌含量为100～150亿cfu/mL；
(2)灭活菌液的制备：将步骤(1)所得混合菌液进行甲醛灭活，并进行灭活检验确认无菌生长后，得到灭活菌液；
(3)配苗：向灭活菌液中加入氢氧化铝胶生理盐水，同时加入少量硫柳汞，充分搅拌均匀后，制备得到用于预防鸭浆膜炎的氢氧化铝胶疫苗。
上述方案中，所述培养基为：含5％小牛血清的TSB培养基，所述培养条件为：37℃摇床振荡培养16～18h。
上述方案中，所述甲醛灭活的方法为：按菌液总质量的0.15％加入甲醛溶液，经37℃摇床灭活48h。
上述方案中，所述配苗的组分配比为：按体积比每4份灭活菌液加1份氢氧化铝胶生理盐水，同时按总质量0.005％加入硫柳汞。
上述制备所得氢氧化铝胶疫苗的免疫效力检测：用1周龄健康易感鸭10只，每只颈部皮下注射氢氧化铝胶疫苗0.3ml，21日后连同条件相同的对照鸭10只，腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌RAHB-1、鸭疫里默氏杆菌RAHB-2的混合菌液0.5ml(含活菌0.2～0.5亿cfu)，所述的混合菌液是将鸭疫里默氏杆菌RAHB-1、鸭疫里默氏杆菌RAHB-2菌株分别于含5％小牛血清的TSB单独培养16～18小时得到的菌液按体积比1:1混合得到的；观察14日，对照鸭全部发病或死亡，剖检后全部具有典型病变(反应在++以上)；免疫鸭保护10只，保护率达100％。
上述制备所得氢氧化铝胶疫苗的成品检验：①物理性状：本品静置后，上层为淡黄色澄明液体，下层为白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。②无菌检验：按《中华人民共和国兽药典 (2010年版)》附录42进行，应无菌生长。③甲醛或硫柳汞含量测定：分别按《中华人民共和国兽药典(2010年版)》附录20、附录10进行，甲醛残留量不超过0.2wt％，硫柳汞残留量不超过0.01wt％。④安全检验：用1周龄的健康易感鸭10只，各腿部肌肉注射疫苗0.6mL，观察14日，注苗局部无严重反应，且全部健活为合格。⑤效力检验：用1周龄的健康易感鸭10只，各颈部皮下注射疫苗0.3mL，21日后，连同条件相同的对照鸭10只，各腿部肌肉注射活菌悬液0.5mL(含活菌0.2～0.5亿cfu)；观察14日，对照鸭应全部发病或死亡，免疫鸭应至少保护8只为合格。
上述两株鸭疫里默氏杆菌病区域优势血清型菌株在用于防控鸭浆膜炎的新诊断技术和疫苗制备领域中的应用。
本发明的有益效果如下：1)本发明筛选获得的两株鸭疫里默氏杆菌病血清型菌株是来源于湖北地区的优势血清型菌株，毒力强，免疫原性强，将其制备成疫苗针对性强；2)采用本发明所述鸭疫里默氏杆菌RAHB-1和鸭疫里默氏杆菌RAHB-2制备的疫苗免疫效果好，保护力强，安全性高，成本低廉，容易吸收，为疫苗的临床应用提供了基本保证，易于推广。
附图说明
图1为PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，其中M：Marker；1：RAHB-1；2：RAHB-2；3：鸭大肠杆菌；4：禽多杀性巴氏杆菌；5：鸭黄病毒；6：阴性对照。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
鸭疫对鸭疫里默氏杆菌病进行流行病学调查以获得鸭疫里默氏杆菌病的优势血清型，然后对湖北省不同地区分离的126株鸭疫里默氏杆菌，经培养特性、形态特征、生化特性、血清型鉴定、毒力试验和免疫原性试验，筛选而获得的两株致病性强、免疫原性好的优势血清型菌株。具体制备方法如下：
1.病料来源：湖北新洲等养鸭场送检或采集的临床具有神经症状、剖检具有心包炎、肝周炎和气囊炎等典型病变的组织。
2.主要试剂：Tryptic Soy Agar(TSA)和Tryptic Soy Broth(TSB)购自Difco公司；麦康凯琼脂购自杭州微生物试剂有限公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司； DL2 000DNA Marker、2×EasyTaq PCR SuperMix购自北京全式金生物制品有限公司。
3.分离方法
3.1细菌的分离：无菌操作取病、死亡鸭脑、心脏和肝脏直接划线于含5％小牛血清的 TSA平板上，置于烛缸中37℃培养24～48h，观察结果；从其中挑取可疑菌落，进行革兰氏染色和瑞氏染色，镜检，并划线于含5％小牛血清的TSA和麦康凯平板上，观察菌体形态及染色特征。结果可见分离菌在TSA中培养24小时后，形成圆形凸起、边缘整齐、透明、有光泽、呈奶油状的菌落；在麦康凯培养基上不生长；革兰染色为阴性短小杆菌、不运动、无芽孢，单个或成双，少数呈链状排列；瑞氏染色呈现两极浓染；从TSA平板上挑取圆形隆起、光滑的菌落在含5％小牛血清的TSA平板上于烛缸中37℃进行纯培养24～48h，再次染色、镜检；若菌体形态和染色特性符合鸭疫里默氏杆菌的形态和染色特性时，挑取剩余的半个菌落接种于含5％小牛血清的TSA斜面培养基，烛缸中37℃培养24～48h，即为分离纯化细菌。
3.2PCR产物的扩增和产物鉴定：1)PCR引物：合成鸭疫里默氏杆菌camp基因引物，扩增片段长度为610bp。引物序列如下：上游引物5-‘ctaggatccgtaagtggtgggcataca’-3，下游引物5-‘tcgaagcttatcttgcagtagccgttg’-3。由上海生物技术服务有限公司合成。2)模板的制备：将待检菌株于含5％小牛血清的TSB烛缸中37℃培养24～48h，取菌液1ml，10 000r/min离心10min，弃上清，加1ml双蒸水重悬沉淀，沸水浴5～10min，同样离心后取上清作模板，于4℃保存备用。3)PCR反应体系和条件：在PCR反应管中加入2×EasyTaq PCR SuperMix25ul、上下游引物各1μL、DNA模板4μL，最后加灭菌ddH2O补至50μL；95℃预变性5min； 94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸50s，共35个循环；最后72℃延伸10min。4)PCR 反应产物的检测：PCR反应完毕后的扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果，并将PCR阳性产物送上海生物工程有限公司测序。将待检菌株细菌和鸭大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌和鸭黄病毒等进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳。结果：鸭大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌和鸭黄病毒均为阴性，而新分离菌PCR结果与预期设计的扩增片段大小相符，约为610bp(见图1)，测序结果表明与GenBank中RA的camp基因在核苷酸水平上的同源性为93～97％。表明从发病组织中分离细菌为鸭疫里默氏杆菌。
4.血清型鉴定：挑取TSA平板上单菌落用TSB培养，进行血清型鉴定。玻片凝集试验表明分离菌株鸭疫里默氏杆菌RAHB-1(Riemerella anatipestifer RAHB-1)只与1型RA阳性血清发生凝集反应，琼脂扩散试验表明分离菌株只与1型RA阳性血清反应出现清晰可见的沉淀线，从而判定分离菌株为1型RA；玻片凝集试验表明分离菌株鸭疫里默氏杆菌RAHB-2(Riemerella anatipestifer RAHB-2)只与Ⅱ型RA阳性血清发生凝集反应，琼脂扩散试验表明分离菌株只与Ⅱ型RA阳性血清反应出现清晰可见的沉淀线，从而判定分离菌株为Ⅱ型RA。
5.毒力：将鸭疫里默氏杆菌RAHB-1、鸭疫里默氏杆菌RAHB-2菌株分别于含5％小牛血清的TSB中单独培养16～18小时得到各菌株的菌液0.5ml(含活菌0.2～0.5亿cfu)，然后将各菌液于腿部肌肉分别注射3-4周龄健康易感鸭10只，观察可得：皆出现明显临床症状，14日内死亡或活鸭内脏有明显病变。
6.免疫原性：用1周龄健康易感鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗(所述疫苗是由鸭疫里默氏杆菌RAHB-1和鸭疫里默氏杆菌RAHB-2分别接种培养获得的菌液混合均匀，再经甲醛灭活、加氢氧化铝胶混合后制备而成)0.3ml，21日后连同条件相同的对照鸭10只，腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌RAHB-1、鸭疫里默氏杆菌RAHB-2的混合菌液0.5ml(含活菌 0.2～0.5亿cfu)，所述的混合菌液是将鸭疫里默氏杆菌RAHB-1、鸭疫里默氏杆菌RAHB-2菌株分别于含5％小牛血清的TSB单独培养16～18小时得到的菌液混合得到的。观察14日，对照鸭全部发病或死亡，剖检后全部具有典型病变(反应在++以上)；免疫鸭保护10只，在观察结束时进行剖检，内脏无任何病变。
实施例2鸭疫里默氏杆菌病区域优势血清型菌株的应用
用鸭疫里默氏杆菌RAHB-1和鸭疫里默氏杆菌RAHB-2接种适宜的培养基，收获培养物，经甲醛灭活后，加氢氧化铝胶混合制成氢氧化铝胶苗，用于预防鸭疫里默氏杆菌病即鸭浆膜炎。
1、制苗用菌液制备：鸭疫里默氏杆菌RAHB-1和鸭疫里默氏杆菌RAHB-2分别接种含5％小牛血清的TSB中，置37℃摇床振荡培养24～48h，以体积比1︰1混合，得混合菌液。取样进行纯粹检验及活菌计数，按《中华人民共和国兽药典(2010年版)》附录42进行纯粹检验，应纯粹。按《中华人民共和国兽药典(2010年版)》附录19进行活菌计数，活菌含量 100～150亿cfu/mL。
2、灭活菌液的制备：将制备的疫苗用甲醛进行灭活，并进行灭活检验，得灭活菌液。具体方法：按菌液总量的0.15％分别加入甲醛溶液，经37℃摇床灭活48h，然后取样接种至 TSA琼脂平板，置烛缸于37℃培养72h，观察有无细菌生长，菌液灭活后应无菌生长。
3、配苗：按体积比每4份灭活的菌液加1份氢氧化铝胶生理盐水，同时按总量加入0.005％硫柳汞，充分搅拌。
4、检验分装：根据《中华人民共和国兽药典(2010年版)》附录42，取样进行无菌检验，得：无菌检验合格，应无菌生长，后混合分装，分装时随时搅拌使其混合均匀。
成品检验：①物理性状：本品静置后，上层为淡黄色澄明液体，下层为白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。②无菌检验：按《中华人民共和国兽药典(2010年版)》附录42进行，应无菌生长。③甲醛或硫柳汞含量测定：分别按《中华人民共和国兽药典(2010年版)》附录 20、附录10进行，甲醛残留量不超过0.2wt％，硫柳汞残留量不超过0.01wt％。④安全检验：用1周龄的健康易感鸭10只，各腿部肌肉注射疫苗0.6mL，观察14日，注苗局部无严重反应，且全部健活为合格。⑤效力检验：用1周龄的健康易感鸭10只，各颈部皮下注射疫苗 0.3mL，21日后，连同条件相同的对照鸭10只，各腿部肌肉注射活菌悬液0.5mL(含活菌 0.2～0.5亿cfu)。观察14日，对照鸭应全部发病或死亡，免疫鸭应至少保护8只为合格。
本发明制备所得疫苗的免疫效果好，保护力强：用1周龄健康易感鸭10只，每只颈部皮下注射上述制备的疫苗0.3ml，21日后连同条件相同的对照鸭10只，各腿部肌肉注射鸭疫里默氏杆菌RAHB-1、鸭疫里默氏杆菌RAHB-2的混合菌液0.5ml(含活菌0.2～0.5亿cfu)，所述的混合菌液是将鸭疫里默氏杆菌RAHB-1、鸭疫里默氏杆菌RAHB-2菌株分别于含5％小牛血清的TSB单独培养16～18小时得到的菌液按1:1体积比混合得到的；观察14日，对照鸭全部发病或死亡，剖检后全部具有典型病变(反应在++以上)；免疫鸭保护10只，保护率达100％。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (7)
1.两株鸭疫里默氏杆菌病区域优势血清型菌株，其中一株分类命名为鸭疫里默氏杆菌RAHB-1(Riemerella anatipestifer RAHB-1)，已于2018年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M2018805；另外一株分类命名为鸭疫里默氏杆菌RAHB-2(Riemerella anatipestifer RAHB-2)，已于2018年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M2018806。
2.一种用于预防鸭浆膜炎的疫苗，其特征在于，所述疫苗是由权利要求1所述鸭疫里默氏杆菌RAHB-1和鸭疫里默氏杆菌RAHB-2分别接种培养获得的菌液混合均匀，再经甲醛灭活、加氢氧化铝胶混合后制备而成。
3.权利要求2用于预防鸭浆膜炎的疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制苗用菌液的制备：将鸭疫里默氏杆菌RAHB-1和鸭疫里默氏杆菌RAHB-2分别接种至培养基上培养一段时间，收获培养物后，按体积比1︰1混合得到混合菌液，控制混合菌液中的活菌含量为100～150亿cfu/mL；
(2)灭活菌液的制备：将步骤(1)所得混合菌液进行甲醛灭活，并进行灭活检验确认无菌生长后，得到灭活菌液；
(3)配苗：向灭活菌液中加入氢氧化铝胶生理盐水，同时加入少量硫柳汞，充分搅拌均匀后，制备得到用于预防鸭浆膜炎的氢氧化铝胶疫苗。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养基为：含5％小牛血清的TSB培养基，所述培养的条件为：37℃摇床振荡培养16～18h。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述甲醛灭活的方法为：按菌液总质量的0.15％加入甲醛溶液，经37℃摇床灭活48h。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述配苗的组分配比为：按体积比每4份灭活菌液加1份氢氧化铝胶生理盐水，同时按总质量0.005％加入硫柳汞。
7.权利要求1所述两株鸭疫里默氏杆菌病区域优势血清型菌株在用于防控鸭浆膜炎的新诊断技术和疫苗制备领域中的应用。
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