CN112646750A - 一种血清18型鸭疫里默氏杆菌及应用 - Google Patents

一种血清18型鸭疫里默氏杆菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种血清18型鸭疫里默氏杆菌及应用，该菌株命名为鸭疫里默氏杆菌YJ821‑18(Riemerella anatipestifer YJ821‑18)，保藏编号为CCTCC NO：M2020528，于2020年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心。该菌株具有稳定的生物学特性，对雏鸭有较强的致病性，且具有良好的免疫原性。将其制成油佐剂灭活疫苗安全可靠，能够产生较高水平的抗体，持续期长，并且对同源菌株攻毒的鸭具有非常好的保护效果，免疫后鸭的发病率和死亡率均明显减少，能够有效预防鸭疫里默氏杆菌病的流行。

Description

一种血清18型鸭疫里默氏杆菌及应用
技术领域
本发明属于兽医生物制品技术领域，具体涉及一种血清18型鸭疫里默氏杆菌及应用。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎、新鸭病、鸭疫综合征，是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的一种接触性急性或慢性败血性传染病，主要侵害2-7周龄的雏鸭，临诊上主要表现为眼和鼻分泌物增多，喘气，咳嗽，下痢，共济失调和头颈震颤，慢性经过的病鸭主要表现为脑膜炎症状、颈斜、生长缓慢或成僵鸭，病变以纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征，死亡率高达90％，给养鸭业造成巨大的经济损失。调查显示，我国各地均有鸭疫里默氏杆菌病的发生。由于RA具有抗原的多样性和变异性，因此血清型的种类多且复杂，但现在还未见报道公认的血清18型鸭疫里默氏杆菌。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种血清18型鸭疫里默氏杆菌及应用，该血清18型鸭疫里默氏杆菌安全性和免疫效果好。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种血清18型鸭疫里默氏杆菌，命名为鸭疫里默氏杆菌YJ821-18(Riemerellaanatipestifer YJ821-18)，保藏编号为CCTCC NO：M2020528，于2020年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心。
上述鸭疫里默氏杆菌YJ821-18在制备治疗鸭疫里默氏杆菌病药物中的应用。
进一步地，药物为疫苗，优选油包水型疫苗、水包油型疫苗或水包油包水型疫苗。
进一步地，血清18型鸭疫里默氏杆菌(鸭疫里默氏杆菌YJ821-18)与药学上可接受的载体或辅料组合构成药物，如单价苗、多价苗或联苗等。
进一步地，血清18型鸭疫里默氏杆菌(鸭疫里默氏杆菌YJ821-18)在药物如疫苗中含菌量为1×109CFU/ml以上。
本发明提供的血清18型鸭疫里默氏杆菌及应用，具有以下有益效果：
本发明提供的血清18型鸭疫里默氏杆菌即鸭疫里默氏杆菌YJ821-18具有稳定的生物学特性，对雏鸭有较强的致病性，且具有良好的免疫原性。将其制成油佐剂灭活疫苗安全可靠，能够产生较高水平的抗体，持续期长，并且对同源菌株攻毒的鸭具有非常好的保护效果，免疫后鸭的发病率和死亡率均明显减少，能够有效预防鸭疫里默氏杆菌病的流行。
附图说明
图1为待鉴定菌株革兰氏染色结果。
图2为待鉴定菌株16S rRNA PCR扩增结果。
图3为鉴定过程中高相似度序列比对结果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1血清18型鸭疫里默氏杆菌的分离和鉴定
1、材料
1.1血清
兔抗鸭疫里默氏菌1、2型阳性血清，由中国农业大学动物医学院传染病实验室赠送；
鸭疫里默氏菌1、2、3、4、5、6、7、8、10、11型阳性血清，自制。
1.2待检菌株
从上海地区疑似鸭疫里默氏菌感染的死亡鸭病料中分离得到的1株疑似菌株。
1.3已知血清型菌株
血清型1型、2型鸭疫里默氏杆菌株(也可以称鸭疫里默氏菌1型菌株、鸭疫里默氏菌2型菌株)，均购自中国兽医药品监察所；
血清型3型、4型、5型、6型、7型、8型、10型、11型鸭疫里默氏杆菌株，均由中国农业大学动物医学院传染实验室赠送。
1.4培养基
胰酶大豆琼脂平板(TSA)、胰酶大豆肉汤(TSB)、麦康盖琼脂平板、小牛血清。
1.5 16S rRNA PCR通用引物(795bp)，由上海生物工程技术服务有限公司合成。
2、方法
从上海地区疑似鸭疫里默氏菌感染的死亡鸭病料中分离得到的1株疑似菌株，并对其进行培养和鉴定，具体过程如下：
2.1培养特性
将待测菌株接种到TSA琼脂平板和麦康盖琼脂平板上，观察细菌生长情况、菌落形态等。
2.2菌体形态特性
挑选菌落，进行涂片、革兰氏染色，油镜下观察。
2.3血清型鉴定
2.3.1待鉴定菌株与已有阳性血清凝集
对待鉴定菌株与现有RA阳性血清进行玻片凝集试验，观察凝集结果，判断其血清型。
2.3.2已知血清型菌株与待鉴定菌株的阳性血清凝集
制备待鉴定菌株阳性血清：在TSA琼脂平板上进行细菌培养，收获菌液灭活，制备成油乳免疫原接种SPF鸡，免疫后7天采血鉴定，与待鉴定菌株产生凝集即可作为凝集用阳性血清。
将制备的待鉴定菌株阳性血清与已知血清型的RA菌株进行玻片凝集，观察凝集结果。
2.4PCR鉴定
用ddH2O作为空白对照，鸭疫里默氏菌1型菌株作为阳性对照，进行16S rRNA PCR扩增。扩增产物送检测序，测序结果在NCBI中进行Blast比对，根据其与Genbank中鸭疫里默氏菌序列的相似度数值判断该待鉴定菌株是否为鸭疫里默氏菌。
其中，进行16S rRNA PCR扩增时所用的引物为：
F：5’-CTACCAGGGTATCTAATCCT-3’；
R：5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’。
3、结果
3.1形态和培养特性
菌种接种于TSA琼脂平板，置37℃、5％CO2温箱中培养18～36小时，菌落表面光滑、乳白色、不透明、边缘整齐，凸起呈珠状或半圆，染色为革兰氏阴性短小杆菌(图1)。在麦康盖琼脂平板上无细菌生长。
3.2血清型鉴定
3.2.1待鉴定菌株与已有阳性血清凝集结果
待鉴定菌株与已有阳性血清凝集结果见表1，该菌株与1、2、3、4、5、6、7、8、10、11型阳性血清均不产生凝集。
表1待鉴定菌株与已有阳性血清凝集结果
Figure BDA0002907845120000051
注：“+”的数量表示凝集反应程度，达到“++”以上即为阳性结果，“-”表示无凝集
3.2.2已知血清型菌株与待鉴定菌株的阳性血清凝集
待鉴定菌株免疫原免疫SPF鸡后第7天采血，与待鉴定菌株可产生凝集，采血制备待鉴定菌株的阳性血清50ml，分装为1ml/支。
已知血清型菌株与待鉴定菌株的阳性血清凝集结果见表2，该阳性血清与1、2、3、4、5、6、7、8、10、11型菌株均不产生凝集。
表2待鉴定菌株与已有阳性血清凝集结果
Figure BDA0002907845120000052
注：“+”的数量表示凝集反应程度，达到“++”以上即为阳性结果，“-”表示无凝集
3.3PCR鉴定结果
3.3.1扩增结果
用ddH2O作为空白对照，鸭疫里默氏菌血清型1型菌株作为阳性对照，进行16SrRNA PCR扩增。待检菌株PCR扩增结果见图2。图2中，M为DNA Marker DL2000；1，ddH2O空白对照；2，待检菌株；3，鸭疫里默氏菌血清型1型菌株阳性对照。由图2可知，空白对照和阴性对照未扩增出条带，阳性对照和待检菌株均扩增出795bp左右的条带。
3.3.2测序结果
16S rRNA PCR扩增产物送检测序，测序结果与Genbank中鸭疫里默氏菌序列进行比对，待鉴定菌株与鸭疫里默氏菌序列相似度超过99％(图3)，可判断该待鉴定菌株为鸭疫里默氏菌。
综上所述，从上海地区分离到1株疑似鸭疫里默氏菌(RA)，经培养习性和菌落形态观察，染色镜检均为RA，但与实验室现有标准阳性血清均不产生凝集或凝集很弱，用该菌制备免疫原免疫SPF鸡制备阳性血清，该阳性血清与现有标准菌株均不产生凝集。进行16SrRNA PCR扩增并送样进行测序比对，确认该菌为鸭疫里默氏菌。判断为未知血清型RA，暂定为血清18型鸭疫里默氏杆菌，命名为鸭疫里默氏杆菌YJ821-18。
实施例2血清18型鸭疫里默氏杆菌的毒力研究
1、材料
1.1菌株
鸭疫里默氏菌1型菌株(YJ821-1)、2型菌株(YJ821-2)、18型菌株(YJ821-18)株。
1.2培养基
含5％小牛血清的胰酶大豆琼脂(TSA)
1.3试验动物
血清鸭疫里默氏菌抗体检测为RA阴性的健康雏鸭。
2、方法
2.1菌种培养
取液氮保存的F2代鸭疫里默氏菌的基础菌种各一只，划线于TSA平板上，37℃、5％CO2温箱培养24～48小时，挑取典型菌落涂布接种于TSA平板，37℃、5％CO2温箱培养24～48小时，用30％灭菌甘油生理盐水洗下菌苔，比浊法调整活菌计数，分装后-80℃冻存。
2.2菌液检验
2.2.1纯粹检验
按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验。
2.2.2活菌计数
按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行活菌计数。
2.3毒力试验
2.3.1攻毒前准备
攻毒当天取出制备的冻存3个血清型的F3代鸭疫里默氏菌株各1支，根据计数结果，用生理盐水进行10倍系列稀释，作为攻毒用菌液，并进行活菌复计数。将160只14日龄试验雏鸭随机分成16组，即15个攻毒组和1个健康对照组，每组10只。
2.3.2预攻毒试验
各攻毒组分别颈部皮下注射1～8×104CFU/ml、1～8×105CFU/ml、1～8×106CFU/ml、1～8×107CFU/ml、1～8×108CFU/ml的1型(YJ821-1)、2型(YJ821-2)、18型(YJ821-18)的菌液，1ml/只，健康对照组雏鸭颈部皮下注射灭菌生理盐水1ml/只，注射后隔离饲养。观察记录发病、死亡情况，用Reed-Muench氏法计算LD50。
2.3.3LD50计算公式
距离比例r＝(高于50％死亡率-50)÷(高于50％死亡率-低于50％死亡率)；
lg(半数致死量菌液稀释度)＝高于50％死亡率稀释度倒数得对数+距离比例×稀释倍数的对数；
LD50＝活菌计数×攻毒剂量/半数致死量菌液稀释度。
2.3.4对不同日龄不同途径试验鸭的毒力试验
将190只试验雏鸭随机分成19组，即18个试验攻毒组和1个健康对照组，每组10只。试验鸭于健康舍中饲养至10、15、21、28、35、45日龄时，经颈部皮下，分别注射预实验选择的攻毒剂量；同条件下，健康对照组不做处理。隔离饲养。同步同条件做15日龄腿部肌肉注射途径毒力试验。观察记录发病、死亡情况，计算发病率和死亡率。
2.3.5鸭传染性浆膜炎的发病判定标准
以下症状出现2项以上可判定为鸭传染性浆膜炎发病：
(1)发病雏鸭表现为精神沉郁，减食至不食，粪便为黄绿色，稀薄；
(2)出现缩颈和嗜睡，鼻孔流出黏性的液体状分泌物；
(3)“划水状”神经痉挛，两腿伸直翻弓直到死亡；
(4)急性发病剖解见肝脏肿大，出血，少量心包积液；
(5)后期死亡剖解可见心包膜、肝表面等浆膜上的纤维素渗出物即“三包炎”病变。
3、结果
3.1菌种培养及检验结果
F2代RA-1型(YJ821-1)、2型(YJ821-2)、18型(YJ821-18)各菌种经37℃、5％CO2温箱培养24～48小时后，用30％灭菌甘油生理盐水洗下，分装，标记为F3代。制备的F3代鸭疫里默氏菌1型(YJ821-1)菌株20支，活菌计数为4.56×109CFU/ml；2型(YJ821-2)菌株35支，活菌计数为5.48×109CFU/ml；18型(YJ821-18)菌株18支，活菌计数为4.33×108CFU/ml。纯粹检验结果纯净。分装为1.0ml/支，部分-80℃冻存，部分液氮冻存。YJ821菌种培养及检验结果见表3。
表3 F3代鸭疫里默氏菌种的培养及检验结果
Figure BDA0002907845120000091
3.2对14日龄雏鸭的毒力
10日后，10只健康对照组雏鸭全部键活，试验组不同梯度的鸭疫里默氏菌1型(YJ821-1)、2型(YJ821-2)、18型(YJ821-18)菌对14日龄雏鸭的毒力试验结果见表4。
3.2.1 14日龄试验鸭的YJ821-1菌攻毒试验结果
攻毒鸭出现精神沉郁，减食或不食，粪便为黄绿色，稀薄；“划水状”神经痉挛，两腿伸直翻弓或死亡。观察及剖解结果显示，用4.56×104CFU的RA1型(YJ821-1)菌皮下注射的10只14日龄雏鸭，发病6只，死亡0只；4.56×105CFU注射的发病8/10，死亡3/10；4.56×106CFU注射的发病10/10，死亡5/10；4.56×107CFU注射的发病10/10，死亡8/10；4.56×108CFU注射的发病10/10，死亡10/10。攻毒试验结果见表4。
YJ821-1 LD50计算：距离比例r＝(53.3-50)÷(53.3-17.6)＝0.0924lg(半数致死量菌液稀释度)＝lg1000+0.0924×lg10＝3.0924
LD50＝4.56×109×1/103.0924＝3.69×106CFU
Reed-Muench氏法计算得到YJ821-1对14日龄雏鸭的LD50＝3.69×106CFU。后续试验采用1～8×107CFU作为RA1型(YJ821-1)菌的攻毒菌数。
3.2.2 14日龄试验鸭的YJ821-2菌攻毒试验结果
攻毒鸭出现精神沉郁，不食，“划水状”神经痉挛，两腿伸直翻弓或死亡。观察及剖解结果显示，用5.48×104CFU的RA2型(YJ821-2)菌皮下注射10只14日龄雏鸭，发病8只，死亡2只；5.48×105CFU注射的发病9/10，死亡4/10；5.48×106CFU和5.48×107CFU注射的均发病10/10，死亡8/10；5.48×108CFU注射的发病10/10，死亡10/10。攻毒试验结果见表4。
YJ821-2 LD50计算：距离比例r＝(77.8-50)÷(77.8-37.5)＝0.6896lg(半数致死量菌液稀释度)＝lg1000+0.6898×lg10＝3.6898
LD50＝5.48×109×1/103.6898＝1.12×106CFU
Reed-Muench氏法计算得到YJ821-1对14日龄雏鸭的LD50＝1.12×106CFU。后续试验采用1～8×107CFU作为攻毒菌数。
3.2.3 14日龄试验鸭的YJ821-18菌攻毒试验结果
攻毒鸭出现精神沉郁，不食，两腿伸直翻弓或死亡。观察及剖解结果显示，用4.33×104CFU的18型(YJ821-18)菌皮下注射14日龄雏鸭10只，发病8只，死亡1只；4.33×105CFU注射的发病8/10，死亡1/10；4.33×106CFU注射的发病10/10，死亡2/10；4.33×107CFU和4.33×108CFU注射的，均发病10/10，死亡10/10。攻毒试验结果见表4。
YJ821-18 LD50计算：距离比例r＝(68.8-50)÷(68.8-33.3)＝0.5296lg(半数致死量菌液稀释度)＝lg1000+0.5296×lg10＝3.5296
LD50＝4.33×108×1/103.5296＝1.28×105CFU
Reed-Muench氏法计算得到YJ821-1对14日龄雏鸭的LD50＝1.28×105CFU。后续试验采用1～8×106CFU作为YJ821-18菌株的攻毒菌数。
表4 F3代3种血清型的鸭疫里默氏菌对14日龄雏鸭的毒力试验结果
Figure BDA0002907845120000111
3.3颈部皮下注射RA菌对不同日龄鸭的毒力
10日后，10只健康对照组雏鸭全部键活，试验组鸭分别注射预实验选择的攻毒梯度(YJ821-1、YJ821-2：107CFU，YJ821-18：106CFU)。不同梯度的鸭疫里默氏菌1型(YJ821-1)、2型(YJ821-2)、18型(YJ821-18)对10、15、21、28、35、45日龄试验鸭的毒力试验结果见表5。
3.3.1颈部皮下注射不同日龄试验鸭的YJ821-1攻毒试验结果
攻毒鸭出现精神沉郁，减食或不食，“划水状”神经痉挛或死亡。观察及剖解结果显示，用4.56×107CFU的YJ821-1菌液皮下注射10、15、21、28、35、45日龄试验鸭均10/10发病，死亡比分别为10/10、8/10、7/10、8/10、8/10。即4.56×107CFU的F3代YJ821-1菌液对10～45日龄各组的试验鸭致病率达到100％，致死率≥70％。攻毒试验结果见表5。
3.3.2颈部皮下注射不同日龄试验鸭的YJ821-2攻毒试验结果
攻毒鸭出现不食或减食，两腿伸直翻弓或死亡。观察及剖解结果显示，用5.48×107CFU的YJ821-2菌液皮下注射10、15、21、28、35、45日龄试验鸭均10/10发病，死亡比分别为10/10、9/10、8/10、10/10、8/10、7/10。即5.48×107CFU的F3代YJ821-2菌液对10～45日龄各组的试验鸭致病率达到100％，致死率≥70％。攻毒试验结果见表5。
3.3.3颈部皮下注射不同日龄试验鸭的YJ821-18攻毒试验结果
攻毒鸭出现不食或减食，不动、精神沉郁、腿伸直呈“划水状”或死亡。观察及剖解结果显示，用的YJ821-18菌液皮下注射10、15、21、28、35、45日龄试验鸭均10/10发病，死亡比分别为10/10、10/10、9/10、10/10、8/10、8/10。即4.33×106CFU的F3代YJ821-18菌液对10～45日龄各组的试验鸭致病率达到100％，致死率≥80％。攻毒试验结果见表5。
表5经颈部皮下注射RA菌液对不同日龄鸭的毒力试验结果
Figure BDA0002907845120000121
Figure BDA0002907845120000131
3.4不同注射途径对毒力的影响
10日后，10只健康对照组雏鸭全部键活，试验组经颈部皮下注射或腿部肌肉注射预实验选择的攻毒梯度(YJ821-1、YJ821-2：107CFU，YJ821-18：106CFU)。不同注射途径的3型菌对17日龄试验鸭的毒力试验结果见表6。
表6 RA不同注射途径对17日龄雏鸭的毒力
Figure BDA0002907845120000132
试验结果表明，颈部皮下注射和腿部肌肉注射两种注射途径下鸭疫里默氏菌菌液对17日龄雏鸭的毒力无显著差异。
综上所述，制备的F3代鸭疫里默氏菌1型(YJ821-1)菌20支，活菌计数为4.56×109CFU/ml；2型(YJ821-2)菌35支，活菌计数为5.48×109CFU/ml；18型(YJ821-18)菌18支，活菌计数为4.33×108CFU/ml。1.0ml/支。-80℃或液氮冻存。
鸭疫里默氏菌1型(YJ821-1)菌对14日龄雏鸭的LD50＝3.69×106CFU。采用1～8×107CFU作为攻毒量。4.56×107CFU的1型(YJ821-1)菌对10～45日龄雏鸭致病率达到100％，致死率≥70％。
鸭疫里默氏菌2型(YJ821-2)菌对14日龄雏鸭的LD50＝1.12×106CFU。采用1～8×107CFU作为攻毒量。5.48×107CFU的2型菌株(YJ821-2)菌液对10～45日龄雏鸭致病率达到100％，致死率≥70％。
鸭疫里默氏菌18型(YJ821-18)菌对14日龄雏鸭的LD50＝1.28×108CFU。采用1～8×106CFU作为攻毒菌数。4.33×106CFU的18型菌株(YJ821-18)菌液对10～45日龄雏鸭致病率达到100％，致死率≥80％。
颈部皮下注射和腿部肌肉注射两种注射途径下RA菌液对17日龄雏鸭的毒力无显著差异。
实施例3血清18型鸭疫里默氏杆菌的毒力研究
用于动物回归试验的1型3株、2型2株、18型2株均有良好的毒力，并能从攻毒致死鸭中分离到与攻毒菌相同的RA。现对这几株RA的免疫原性进行探究。
1、材料
1.1菌株
鸭疫里默式菌1型3株，暂命名为RA1-1、RA1-2、RA1-3；2型2株，暂命名为RA2-1、RA2-2；18型2株，暂命名为RA18-1、RA18-2。
1.2培养基
含5％小牛血清的胰酶大豆琼脂(TSA)
1.3试验动物
血清抗体检测为阴性的健康雏鸭。
2、方法
2.1菌种培养
挑取菌种接种于TSA上，37℃温箱培养24～48小时菌落长成，用30％甘油生理盐水洗下菌苔，比浊法调整菌液浓度。
2.2菌液检验
2.2.1纯粹检验
按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验。
2.2.2活菌计数
按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行活菌计数。
2.3灭活
按菌液总量的0.2％～0.3％加入甲醛溶液，充分混合后，置37℃振摇灭活48小时。
2.4灭活检验
取灭活菌液接种TG三角瓶，3天后移植于血斜面、TG小管、GA小管和GP小管，分别于37℃、25℃培养24小时。
2.5配苗
2.5.1油相制备
取注射用白油94份，加入6份司本-80，充分混匀，高压灭菌备用。
2.5.2水相制备
将检验合格的抗原96份加入4份灭菌后的吐温-80，充分振摇后使吐温-80完全溶解为止。
2.5.3乳化
水相和油相1:3的比例(V/V)，将油相注入预混罐中，2500r/分钟低温搅拌，缓慢加入水相，再注入乳化罐乳化。
2.5.4分装
无菌定量分装，密封瓶口，置2～8℃保存。
2.6免疫原检测
2.6.1性状
外观：乳白色乳剂。
剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中。
稳定性：吸取免疫原10ml加入离心管中，以3000rpm离心15分钟。
黏度：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验。
2.6.2无菌检验
按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验。
2.6.3安全检验
取120～150日龄SPF鸡10只，每只皮下或肌肉多点注射免疫原2.0ml，观察14日。
2.6.4免疫原性测定
2.6.4.1取120～150日龄产蛋鸡40只，35只为免疫组，5只对照组。免疫组又分为5只/组，按组接种不同菌株免疫原。皮下接种0.5ml/羽，15日后，再以1.0ml/羽剂量加强免疫。2周后收集鸡蛋，按蛋黄与生理盐水1:3(V/V)稀释，加入与蛋黄等体积的三氯甲烷，充分振摇，萃取，离心分离上清液，即为待测样品。
2.6.4.2采用琼脂扩散试验方法进行蛋黄抗体效价检测。
2.6.4.3采用抗体保护试验进行蛋黄抗体效价检测
将70只14日龄健康易感非免雏鸭，随机均分为7组，分别为RA1-1、RA1-2、RA1-3、RA2-1、RA2-2、RA18-1、RA18-2组，每组又分为试验组和对照组各5只，试验组鸭注射对应菌株蛋黄抗体，对照组鸭注射生理盐水。24小时后各组分别由颈部皮下注射攻毒量(1～8×107CFU)的对应菌株菌液。观察记录发病、死亡情况，10日后剖杀剩余雏鸭。
3、结果
3.1菌液检验
菌液纯粹，活菌数应≥1×109CFU/ml。
3.2灭活检验
灭活菌液在各检验培养基中培养检查均无细菌生长。
3.3免疫原检验
外观为乳白色乳剂；剂型为油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均应油滴状不扩散；稳定性符合规定，吸取免疫原10ml加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml；黏度按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，符合规定。无菌生长。加倍注射SPF鸡后全部健活且生产性能无影响。
3.4免疫原性
3.4.1琼扩检测结果
免疫组蛋黄抗体均有效价，对照组蛋黄抗体效价应为阴性。其中RA1-1、RA2-1、RA18-2免疫组蛋黄抗体琼扩效价为1:8，其他菌株免疫组均为1:4。
表7各免疫组蛋黄抗体琼扩结果
Figure BDA0002907845120000171
3.4.2攻毒试验结果
各菌株对照组鸭只均全部发病，死亡比例也大于或等于4/5，对照成立。各菌株试验组鸭发病死亡比例有所区别，其中RA1-1、RA2-1、RA18-2免疫组蛋黄抗体保护效果最好，发病死亡比例为0/5。
表8各免疫组蛋黄抗体对14日龄雏鸭保护效果
Figure BDA0002907845120000181
3.4.3琼扩和抗体保护试验结果表明，RA1-1、RA2-1、RA18-2免疫组蛋黄抗体琼扩效价较高，为1:8；对14日龄雏鸭受相对应菌株感染的保护效果较好，发病死亡比例为0/5，保护率达到了100％。RA1-1、RA2-1、RA18-2三个菌株免疫原性较好，分别命名为YJ821-1、YJ821-2、YJ821-18，并选定为最终用于检测和生产的菌株，进行后续研究和生产。

Claims (6)

1.一种血清18型鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)，命名为鸭疫里默氏杆菌YJ821-18，保藏编号为CCTCC NO：M2020528，于2020年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心。
2.权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌YJ821-18在制备治疗鸭疫里默氏杆菌病药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为疫苗。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述疫苗为油包水型疫苗、水包油型疫苗或水包油包水型疫苗。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，鸭疫里默氏杆菌YJ821-18与药学上可接受的载体或辅料组合构成药物。
6.根据权利要求2-5任一项所述的应用，其特征在于，鸭疫里默氏杆菌YJ821-18在药物中含菌量为1×109CFU/ml以上。
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