CN112618706B

CN112618706B - 沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联疫苗

Info

Publication number: CN112618706B
Application number: CN202011315483.6A
Authority: CN
Inventors: 郭莉莉; 赵永达; 马丽华
Original assignee: Qingdao Bolin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Bolin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-21
Filing date: 2020-11-21
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2040-11-21
Also published as: US20220193214A1; CN112618706A; US11883477B2

Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联疫苗。抗原为灭活的鼠伤寒沙门氏菌S01株、鸭疫里默氏杆菌R01株和大肠埃希氏杆菌E01株。本发明的疫苗所使用的三种菌株毒力强高、免疫原性好并具有较好的交叉保护性。本发明制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；效力试验结果证明，三联灭活疫苗能产生良好抗体，并能产生较好的攻毒保护力。

Description

沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联疫苗

技术领域：

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联疫苗。

背景技术：

鼠伤寒沙门氏菌是一类重要的人兽共患病原菌，其宿主范围广泛，可引起人和动物多种急性或慢性传染病，其中动物源沙门菌对畜养殖和人类健康构成严重的威胁，具有重要公共卫生意义。抗菌药物的使用本是治疗沙门菌感染的重要措施，但由于人类滥用、乱用抗菌药物导致了细菌的严重耐药，以往的数据表明，全球每年有90％的抗生素被用于食品性动物，这使得动物成为耐药菌的重要贮存宿主，且耐药菌及耐药基因原件正从动物或环境向人类跨物种传播。因此疫苗成为防控沙门氏菌病的十分重要的手段。

鸭疫里默氏杆菌可感染鸭、鹅、火鸡等多种禽类，是目前规模化水禽养殖多发的细菌性疾病，常造成严重的经济损失。鸭疫里默氏杆菌主要侵害2-7周龄的雏鸭和仔鹅，特征性病变为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、关节炎、输卵管炎和脑膜炎等，给养鸭场造成了严重的经济损失。

大肠埃希氏杆菌引起的大肠埃希氏杆菌病，是养殖场生产中一种常见的细菌性疾病，各种年龄的鸭均可感染，食欲不振、腹泻、消瘦以及生产性能低下等为其临床表现特征。该病可发生于各种年龄的鸡，发病率和死亡率不一。一旦发生该病，可在整个鸡群内迅速传播。该病没有明显的季节性，四季均可发生，雏鸡的发病率和死亡率均高于成年鸡。另外，饲料营养不均、养殖场饲养环境差、舍内温湿度差异大、突然更换饲料以及其他应激因素等均可诱发该病。

目前，中国鸭现在的养殖量逐年上升，已经成为重要的养殖禽类，而这三种疫病对养鸭场的危害日益严重，因此迫切需要对中国养殖场的沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌和大肠埃希氏杆菌的流行情况进行系统研究，并迫切需要研制出一种沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联灭活疫苗，来防治这三种疫病对养殖业造成的危害。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是迫切需要研制出一种沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联灭活疫苗，来防治这三种疫病对养殖业造成的危害。

为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：一种鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)S01株，于2020年9月18日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC M2020515。

一种大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)E01株，于2020年9月18日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC M 2020514。

本发明要解决的第二个技术问题是提供上述三种菌株的用途。

为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：一种沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联灭活疫苗，抗原为灭活的鼠伤寒沙门氏菌S01株、鸭疫里默氏杆菌R01 株和大肠埃希氏杆菌E01株。

进一步的，抗原的灭活采用甲醛灭活，且灭活前活菌计数均均为9×10⁹CFU/ml。

进一步的，本发明的二联灭活疫苗的制备方法如下：

1)抗原制备：将纯粹检验合格的S01株、R01株和E01株抗原，将菌泥分别重悬于适量灭菌的生理盐水中，均稀释至9.0×10⁹CFU/ml灭活后，检验合格后，将三种抗原按1:1:1体积混合，备用；

2)佐剂准备：Montanide GEL 02佐剂，121℃高压15min，备用；

3)Montanide GEL 02与三种混合抗原按5:95混合后，搅拌机低速搅拌均匀；

4)分装：定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。

进一步的，将三联灭活疫苗的性状、无菌检验、安全性及效力进行检验。

本发明的有益效果在于：

本发明的疫苗所使用的沙门氏菌S01株、鸭疫里默氏杆菌R01株和大肠埃希氏杆菌E01 株的毒力强高、免疫原性好并具有较好的交叉保护性。本发明制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；效力试验结果证明，三联灭活疫苗能产生良好抗体，并能产生较好的攻毒保护力。

具体实施方式：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

申请人筛选获得了一株沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌和大肠埃希氏杆菌，联合使用制成了三联灭活疫苗，从而促成了本发明。下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：鼠伤寒沙门氏菌S01株的信息

1.流行病学调查自2017年以来，发明人对沙门氏菌的流行病学进行调查，并对部分鸭场进行跟踪调查。调查结果发现，沙门氏菌目前已在我国鸭场广泛存在。

2.细菌分离采集疑似病死鸭的肺脏、心脏、肝脏、肠道及粪拭子等病料，样品采集和分离方法主要根据国家标准(GB 4789.4-2016)。用75％酒精消毒病料表面，无菌操作采集脏器并剪碎，置于装有BPW的无菌均质袋中，37℃、150r/min振荡培养8h进行预增菌，再取 1mL增菌液于10mLTTB中42℃静置培养20～24h进行选择性增菌，然后用接种环蘸取10 μL选择性增菌液三区划线于XLT4琼脂平板上，37℃静置培养24h，挑取XLT4平板上圆形无色透明、边缘整齐的针尖大小单个菌落或以黑色为中心边缘透明的典型菌落，转种于沙门菌显色平板37℃培养24h后，疑似沙门菌的分离株在沙门显色平板上显紫色，其后作进一步的鉴定。

3.细菌鉴定

3.1形态观察取疑似菌落，涂片后革兰氏染色镜检，观察其细菌形态。

3.2生化特性鉴定根据生化试剂说明书取分离株的纯培养物或菌悬液按要求接种至各种生化鉴定管，于37℃生化培养箱中静置培养，并将符合沙门菌生化特征的分离株转种至 XLT4琼脂平板进行纯化培养。

3.3PCR鉴定将上述初步鉴定的细菌进一步用PCR方法确定。用接种环取少许被检菌落于100μL无菌PBS,混匀,取1μL菌悬液作PCR模板。根据沙门菌invA基因引物序列,P1:5′-TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC-3′,P2:5′-GCATTATCGATCAGTACCAGCC GTCT-3′,扩增片段大小为331bp,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

3.4血清型分型用沙门氏菌血清试剂盒对分离鉴定的沙门氏菌进行血清型鉴定。结果表明，鼠伤寒沙门氏菌最多。

4.毒力试验将分离鉴定20株鼠伤寒沙门氏菌分别肌肉注射21日龄樱桃谷鸭各10只， 0.5ml/只，另取10只不攻毒作为对照。观察并记录鸭的死亡情况。试验结果表明，S01株毒力最强，10只鸭均在14日内死亡。该鼠伤寒沙门氏菌于2019年10月9日分离于山东潍坊种鸭场的蛋鸭肝脏中。

5.免疫原性根据毒力试验结果，将筛选的毒力较强的S01株菌株菌液分别调整至1.0×10⁹CFU/ml，甲醛灭活后，按抗原与gel02佐剂按体积比95:5混合乳化，制备单价灭活疫苗，每种疫苗分别肌肉注射7日龄SPF鸭，0.5ml/只，每组10只。免疫后21日采血并分离血清，使用微量凝集试验方法测定血清的抗体效价；并用本菌株进行腿部肌肉注射攻毒(活菌量均约为1.0×10⁸CFU)。观察试验鸭的发病及死亡情况。抗体检测结果表明，免疫组5/5均大于等于1:32,对照组5/5均小于等于1:4；攻毒保护结果表明，免疫组5/5保护,对照组5/5发病。

6.交叉攻毒保护根据毒力试验结果，将S01株分离菌株菌液调整至1.0×10⁹CFU/ml，甲醛灭活后，按抗原与gel02佐剂按体积比95:5混合乳化，制备单价灭活疫苗，每种疫苗分别肌肉注射7日龄SPF鸭，0.5ml/只，每组10只。免疫后21日用本菌株进行腿部肌肉注射攻毒(活菌量均约为1.0×10⁸CFU)。观察试验鸭的发病及死亡情况。试验结果表明，免疫组鸭均未发病或死亡，均5/5保护；而对照组鸭，均5/5发病。表明用S01株所制备的灭活疫苗能抵御各地方分离株的攻击而起到保护作用。

实施例2：鸭疫里默氏杆菌R01株的信息

1.流行病学调查自2017年以来，发明人对鸭疫里默氏杆菌的流行病学进行调查，并对部分鸭场进行跟踪调查。调查结果发现，该病目前已在我国鸭场广泛存在。

2.分离鉴定取疑似病料接种TSA培养基(含0.01％NAD和5％小牛血清)，置于37℃培养24～48小时，挑取疑似菌落用16S rRNA的PCR进行鉴定(F： ACTTCAGGTACCCCCAGCTT；R:GTGCCGTGAGGTGTTAGGTT；364bp)，共分离到43株鸭疫里默氏杆菌。

3.形态及生化特性鸭疫里默氏杆菌在TSA上可形成圆形、略微突起、表面光滑的奶油状小菌落(对着光线观察菌落呈现淡蓝色)。革兰氏染色镜检可见散在或少数成对出现的革兰阴性短杆(球杆)菌。菌落的乳糖发酵试验、半乳糖发酵试验、甲基红试验、VP试验、硫化氢产生试验、硝酸盐还原试

验和枸橼酸盐试验均为阴性，不产生硫化氢，氧化酶试验、触酶试验均为阳性，基本符合RA的生化特性。

4.培养特性鸭疫里默氏杆菌在含0.01％辅酶(NAD)和5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤液体培养基中呈均匀一致的混浊生长；在含0.01％NAD和5％新生牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂固体培养基上，37℃培养24～48小时，形成直径0.3～2.0mm、圆形、光滑、湿润、无色透明的露珠样菌落。

5.血清型鉴定应用平板凝集试验进行血清型鉴定，其中2型鸭疫里默氏杆菌居多，其次是1型和4型。

6.菌株毒力将分离鉴定14株2型鸭疫里默氏杆菌分别肌肉注射21日龄樱桃谷鸭各10 只，0.5ml/只，另取10只不攻毒作为对照。观察并记录鸭的死亡情况。试验结果表明，R01株毒力最强，10只鸭均在14日内死亡。该鸭疫里默氏杆菌于2019年3月15日分离于河南开封樱桃谷鸭的肝脏中。

7.免疫原性将R01株菌株菌液分别调整至1.0×10⁹CFU/ml，甲醛灭活后，按抗原与gel02 佐剂按体积比95:5混合乳化，制备单价灭活疫苗，每种疫苗分别肌肉注射7日龄SPF鸭，0.5ml/ 只，每组10只。免疫后21日采血并分离血清，使用微量凝集试验方法测定血清的抗体效价；并用本菌株进行腿部肌肉注射攻毒(活菌量均约为1.0×10⁷CFU)。观察试验鸭的发病及死亡情况。抗体检测结果表明，免疫组5/5均大于等于1:32,对照组5/5均小于等于1:4；攻毒保护结果表明，免疫组5/5保护,对照组5/5发病。

实施例3：大肠埃希氏杆菌E01株的信息

1.流行病学调查自2017年以来，发明人对鸭场大肠埃希氏杆菌的流行病学进行调查，并对部分鸭场进行跟踪调查。调查结果发现，该病目前已在我国鸭场广泛存在。

2.分离鉴定将疑似脏器或鸭的肛门拭子加入LB培养基进行37℃培养16～20小时，再用接种环蘸取菌液划线接种于麦康凯琼脂上，37℃培养16～20小时，再挑取菌落接种于伊红美蓝平板上37℃培养16～20小时；

3.形态及生化特性在麦康凯琼脂上呈现鲜桃红色或深桃红色、圆形，边缘整齐表面光滑同时在伊红美蓝琼脂上呈现深紫黑色、光滑、带有金属光泽的圆形菌落，确定为大肠埃希氏杆菌。

4.血清型鉴定血清型鉴定为O78。

5.菌株毒力将分离鉴定10株O78型大肠埃希氏杆菌分别肌肉注射21日龄樱桃谷鸭各 10只，0.5ml/只，另取10只不攻毒作为对照。观察并记录鸭的死亡情况。试验结果表明，E01 株毒力最强，10只鸭均在5日内死亡。该鸭疫里默氏杆菌于2019年3月15日分离于河南开封樱桃谷鸭的肝脏中。该大肠埃希氏杆菌于2019年7月4日分离于广州佛山鸭场的肠道中。

6.免疫原性将E01株菌株菌液分别调整至1.0×10⁹CFU/ml，甲醛灭活后，按抗原与gel02 佐剂按体积比95:5混合乳化，制备单价灭活疫苗，每种疫苗分别肌肉注射7日龄SPF鸭，0.5ml/ 只，每组10只。免疫后21日采血并分离血清，使用微量凝集试验方法测定血清的抗体效价；并用本菌株进行腿部肌肉注射攻毒(活菌量均约为1.0×10⁵CFU)。观察试验鸭的发病及死亡情况。抗体检测结果表明，免疫组5/5均大于等于1:32,对照组5/5均小于等于1:4；攻毒保护结果表明，免疫组5/5保护,对照组5/5发病。

实施例4：鼠伤寒沙门氏菌S01株、鸭疫里默氏杆菌R01株和大肠埃希氏杆菌E01株的抗原的制备

1.菌液培养

1.1鼠伤寒沙门氏菌S01株的培养采用发酵罐对S01株进行培养：按发酵罐容积的60％～80％加入LB培养基，同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待其温度降至37～38℃时，加入1％二级种子液进行发酵培养。培养温度36～37℃、搅拌转速100r/min、pH值7.2～7.4，整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60％～80％，菌液培养4小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验。分别将发酵完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，置于2～8℃保存，不超过24小时。

1.2鸭疫里默氏杆菌R01株的培养采用发酵罐对R01株进行培养：按发酵罐容积的60％～80％加入TSB培养基，同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待其温度降至37～38℃时，加入1％二级种子液进行发酵培养。培养温度36～37℃、搅拌转速100r/min、pH值7.2～7.4，整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60％～80％，菌液培养6小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验。分别将发酵完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，置于2～8℃保存，不超过48小时。

1.3大肠埃希氏杆菌E01株的培养采用发酵罐对E01株进行培养：按发酵罐容积的60％～80％加入LB培养基，同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待其温度降至37～38℃时，加入1％二级种子液进行发酵培养。培养温度36～37℃、搅拌转速100r/min、pH值7.2～7.4，整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60％～80％，菌液培养4小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验。分别将发酵完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，置于2～8℃保存，不超过48小时。

2.灭活

根据活菌计数结果，将两株菌株的菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，均稀释至3.0×10⁹CFU/ml，分别计量加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃搅拌灭活

16小时，进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存，不超过14日。

3.半成品检验

3.1纯粹检验按现行《中国兽药典》附录进行检验。

3.2活菌计数按现行《中国兽药典》附录进行计数。

实施例5：疫苗的制备

1.抗原配制检验合格的E01株、R01株和S01株抗原按1：1：1混匀，作为水相。

2.佐剂配制MONTANIDETM gel02佐剂，121℃高压15min，备用。

3.疫苗制备抗原和佐剂按照体积比95:5的比例进行混合。

4.成品检验

4.1性状乳白色均匀乳剂。

4.2装量检查按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。

4.3无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

4.4安全检验用7日龄SPF鸭10只，每只颈部肌肉注射疫苗1.0ml，观察14日，应不出现因疫苗引起的局部或全身不良反应。

4.5效力检验

4.5.1血清学方法取7日龄樱桃谷鸭(沙门氏菌ELISA检测阴性，鸭疫里默氏杆菌和大肠埃希氏杆菌抗体阴性)20只，其中10只皮下注射疫苗0.5ml/只，其余10只作非免疫对照。免疫后21日对所有鸭采血并分离血清，分别检测沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌和大肠埃希氏杆菌抗体效价。沙门氏菌的微量凝集抗体：免疫组10只鸭的抗体效价均≥1:32，对照组10只鸭的抗体效价均≤1:4；鸭疫里默氏杆菌的微量凝集抗体：免疫组10只鸭的抗体效价均≥1:32，对照组10只鸭的抗体效价均≤1:4。大肠埃希氏杆菌的微量凝集抗体：免疫组10只鸭的抗体效价均≥1:32，对照组10只鸭的抗体效价均≤1:4。

4.5.2免疫攻毒法取7日龄樱桃谷鸭(沙门氏菌ELISA检测阴性，鸭疫里默氏杆菌和大肠埃希氏杆菌抗体阴性)60只，分为A、B、C、D、E、F 6组，其中A、B、C 3组皮下注射疫苗0.5ml/只，其余D、E、F三组作非免疫对照。免疫后21日对所有鸭采血并分离血清；并进行攻毒试验，其中，A、D组试验鸭腿部肌肉注射S01株1.0ml(活菌量约为1×10⁸CFU/ 只)；B、E组试验鸭腿部肌肉注射R01株株菌液1.0ml(活菌量约为1×10⁷CFU/只)，C、F组试验鸭腿部肌肉注射E01株株菌液1.0ml(活菌量约为1×10⁵CFU/只)。观察14日，观察试验鸭的发病和死亡情况。鼠伤寒沙门氏菌：免疫组鸭均至少9只保护，对照组鸭至少9只发病；鸭疫里默氏杆菌：免疫组鸭均至少9只保护，对照组鸭均至少9只发病；大肠埃希氏杆菌：免疫组鸭均至少9只保护，对照组鸭均至少9只发病。

5疫苗对比试验

用市场上出售的沙门氏菌病活疫苗和鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗，及本发明的沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联灭活疫苗，分别免10只、10只和30只SPF鸭，并设置30只SPF鸭为未免疫对照鸭。根据各自疫苗的免疫程序进行免疫，免疫后进行攻毒。攻毒保护试验结果表明，市场上出售的鸭沙门氏菌病灭活疫苗和鸭疫里默氏灭活疫苗，均比本发明的沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联灭活疫苗的效果较差。试验结果见表1。

表1：三种灭活疫苗攻毒保护率结果

Claims

1.一种鼠伤寒沙门氏菌S01株，其特征在于：于2020年9月18日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC M 2020515。

2.一种如权利要求1中的鼠伤寒沙门氏菌S01株作为灭活疫苗抗原的用途。

3.一种沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于：抗原为灭活的鼠伤寒沙门氏菌S01株、鸭疫里默氏杆菌R01株和大肠埃希氏杆菌E01株；所述鼠伤寒沙门氏菌S01株于2020年9月18日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC M 2020515；

所述鸭疫里默氏杆菌R01株于2020年9月18日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC M 2020516；

所述大肠埃希氏杆菌E01株于2020年9月18日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC M 2020514。

4.如权利要求3所述的沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于：抗原的灭活采用甲醛灭活。

5.如权利要求3所述的沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于：制备方法如下：

1)抗原制备：将纯粹检验合格的S01株、R01株和E01株抗原，将菌泥分别重悬于适量灭菌的生理盐水中，稀释、灭活后，检验合格后，将三种抗原按1:1:1体积混合，备用；

2)佐剂准备：Montanide GEL 02佐剂，121℃高压15min，备用；

3)抗原和佐剂混合后，搅拌机低速搅拌均匀；

4)分装：定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。