CN103074274A - 一种鸭大肠杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株致病力强、免疫原性好的鸭大肠杆菌，该菌株的保藏编号为CGMCC No.6831。本发明还提供一种二联灭活疫苗，包括有疫苗佐剂和抗原，所述的抗原为保藏编号为CGMCC No.6831的鸭大肠杆菌和保藏编号为CGMCC No.6832的鸭疫里默氏杆菌。本发明制备的鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌二联灭活疫苗，能够预防以引起鸭只大肠杆菌性败血症的特征病变如心脏或肝脏有纤维素渗出性炎症、心包膜炎或胸膜发生粘连为特征的鸭大肠杆菌病，并可以预防以神经症状、纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征的鸭传染性浆膜炎的发生，具有良好的市场推广前景。

Description

一种鸭大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，更具体是涉一种鸭大肠杆菌及其应用，即一株可引起鸭大肠杆菌性败血症的特征病变如心脏或肝脏有纤维素渗出性炎症、心包膜炎或胸膜发生粘连的细菌及其应用。

背景技术

鸭大肠杆菌病是由致病性鸭大肠杆菌引起，其症状常与鸭疫里默氏杆菌感染的症状和病变相似，国内教学科研单位常分离鉴定出的血清型有O1、O2、O3、O78等。近几年，国内特别是山东、河南、广东、福建、广西等省份随着肉鸭饲养的快速发展，大肠杆菌病的发生十分频繁，严重危害养鸭业的进一步发展。

当前，鸭疫里默氏杆菌对养殖业的危害除直接引起动物发病、死亡外，感染耐过鸭疫里默氏杆菌的鸭因饲料转化率降低、生长发育迟缓而带来的间接经济损失也十分严重，鸭疫里默氏杆菌对部分抗菌药物敏感，但难于清除，尤其是该菌侵入气囊后，药物难以到达，由于不合理的用药方案，鸭疫里默氏杆菌耐药现象普遍存在，耐药率高且广泛，同时造成一定的药物残留等问题。因此，研制针对鸭大肠杆菌病及由鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎两种病的二联疫苗具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供了一株鸭大肠杆菌及其应用，即一种可有效防治以引起鸭大肠杆菌性败血症的特征病变如心脏或肝脏有纤维素渗出性炎症、心包膜炎或胸膜发生粘连为特征的鸭大肠杆菌病，同时将筛选出的鸭大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌制成二联灭活疫苗，为鸭大肠杆菌病及鸭传染性浆膜炎的预防和治疗提供了有效的免疫产品。

本发明一个方面提供一株致病力强、免疫原性好的鸭大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）EC BYT01，该菌株已于2012年11月15日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6831。

本发明的鸭大肠杆菌用于制备灭活疫苗。

本发明提供一种二联灭活疫苗，包括有疫苗佐剂和抗原，所述的抗原为保藏编号为CGMCC No.6831的鸭大肠杆菌和保藏编号为CGMCC No.6832的鸭疫里默氏杆菌。

本发明制备的鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌二联灭活疫苗，能够预防以引起鸭只大肠杆菌性败血症的特征病变如心脏或肝脏有纤维素渗出性炎症、心包膜炎或胸膜发生粘连为特征的鸭大肠杆菌病，并可以预防以神经症状、纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征的鸭传染性浆膜炎的发生，具有良好的市场推广前景。

具体实施方式

本发明对山东、广东、福建、广西等地的疑似鸭大肠杆菌病死鸭进行病原分离、鉴定，获得56株病原为鸭大肠杆菌，对其进行血清型鉴定表明，其中有12株为血清O78型；动物回归及毒力试验表明EC BYT06株毒力最强，可致鸭只10/10发病且其中7只死亡；免疫原性试验结果表明，当免疫剂量为0.25mL（抗原含量达到1.0×10⁸CFU/mL）时即可使攻毒保护达到9/10。以上结果表明，筛选得到一株血清O78型鸭大肠杆菌，其致病力最强、免疫原性好、制备的油苗攻毒保护效果好，确定为生产用菌株，该菌株已于2012年11月15日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6831。

在本发明中，大肠埃希氏菌等同于大肠杆菌，两者可以互换使用。

对疑似鸭疫里默氏杆菌病死鸭进行病原分离、鉴定，获得38株病原为鸭疫里默氏杆菌，对其进行血清型鉴定表明，其中有7株为血清2型；动物回归及毒力试验表明RA BYT06株毒力最强，可致鸭只10/10发病且其中5只死亡；免疫原性试验结果表明，当免疫剂量为0.25mL（抗原含量达到1.0×10⁸CFU/mL）时即可使攻毒保护达到9/10。以上结果表明，筛选得到一株血清2型鸭疫里默氏杆菌，其致病力最强、免疫原性好、制备的油苗攻毒保护效果好，确定为生产用菌株，于2012年11月15日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6832。

下面对本发明进行详细的描述。

一、鸭大肠杆菌的分离及鉴定：

⑴将从山东、广东、福建、广西等地收集的病死鸭进行无菌操作，取病死鸭心血、肝或脑组织划线接种于麦康凯琼脂平板、鲜血琼脂平板上，置于37℃培养箱中培养12h，观察细菌生长特性。结果如下：分离到56株疑似为大肠杆菌。这些菌株在普通营养琼脂培养基上菌落约1.5毫米左右，有闪光，呈奶油状；在麦康凯琼脂上菌落约2毫米左右，圆形，突起，光滑，边缘整齐，粉红色。56株分离菌分别命名为RA BYT01、RA BYT02至RA BYT56。

⑵取纯培养的细菌的单个菌落涂于干净的载玻片上，然后用革兰氏染色，镜检，观察其形态特征。革兰氏染色，为革兰氏阴性细小杆菌，呈单个或成对分布，偶尔呈链状排列，不运动，无芽胞。

⑶取纯培养物分别进行葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、阿拉伯糖、甘露醇、卫矛醇、三糖铁试验、M.R.试验、吲哚试验、过氧化氢酶试验、接触酶试验、枸椽酸盐利用试验、尿素酶试验、V-P试验。37℃培养，连续观察3天。结果表明所得菌株生化反应相似，发酵绝大多数的碳水化合物，不产生硫化氢，三糖铁试验、M.R.试验、吲哚试验、过氧化氢酶试验、接触酶试验阳性，枸椽酸盐利用试验、尿素酶试验、V-P试验阴性符合鸭大肠杆菌的生化反应特征。

⑷取被检细菌纯培养物用灭菌生理盐水离心洗涤两次，稀释成1.0×10⁸CFU/毫升的菌液，作为被检抗原，121℃高压2h破坏其荚膜抗原，用标准“O”抗原单因子血清作玻片凝集反应鉴定细菌O抗原种类，以确定其血清型。结果显示其中12株为血清型O78，12株为血清型O2，9株为血清型O1，5株为血清型O88，4株为血清型O8，血清型O5、O27各3株，血清型O65、O135各2株，血清型O45、O10、O7、O39各1株，血清型O78为优势血清型。

⑸12株血清O78型鸭大肠杆菌毒力测定试验

分别取纯培养的12株血清O78型鸭大肠杆菌单个菌落划线接种于麦康凯琼脂平板上，37℃培养12h，刮取平板上所有菌落混于灭菌生理盐水中制成细菌悬液，将其浓度稀释到1.0×10⁶CFU/mL，以0.5mL/只剂量肌肉注射19日龄健康易感鸭10只，同时设立灭菌生理盐水注射对照组10只。攻毒后连续观察10天，每日记录鸭子的精神、食欲、饮水、粪便、运动及死亡情况，并对死亡鸭进行病理剖检、细菌分离及鉴定。结果表明，结果表明各菌株的致病性有差别，12株O78型菌株中，EC BYT01株毒力最强，EC BYT01株接种鸭，40h后部分鸭开始出现精神萎靡，行动迟缓或俯卧不起，10天内10/10发病且其中7只死亡，其余株发病在50h以后，详见表1；剖检可见典型的心包炎、肝周炎、气囊炎；取心血涂片和肝组织印片经染色后镜检，可见短小的小杆菌，单个或成对存在，并能从心血和肝组织在麦康凯平板培养基上分离出接种菌，其生化及培养特征与EC BYT01株鉴定结果一致，因此本研究选用EC BYT01株作为疫苗用强毒菌株。并送中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.6831。

表1 12株血清O78型鸭大肠杆菌的毒力测定试验结果

注：″-"表示未发病

鸭大肠杆菌强毒分离株EC BYT01株的免疫原性测定：

将确定的强毒分离株接种营养肉汤培养基培养后，以平板培养计数法确定活菌数量，收集菌体，将其浓度稀释到3.0×10⁶、3.0×10⁷、3.0×10⁸、3.0×10⁹、3.0×10¹⁰CFU/mL五组，分别按照油水比为2:1的比例做成油佐剂灭活疫苗，使配苗后每毫升抗原液菌数分别为1.0×10⁶、1.0×10⁷、1.0×10⁸、1.0×10⁹、1.0×10¹⁰CFU/mL，取5日龄健康易感雏鸭60只，10只/组，分别用含有不同浓度抗原的灭活疫苗进行颈部皮下注射，0.25mL/只，10只作为非免疫对照，接种后14日，每只鸭各肌肉注射0.5mL(1.0×10⁶CFU/mL)EC BYT01株菌液，观测10日，测定疫苗的免疫保护率。结果表明，当抗原含量达到1.0×10⁸CFU/mL时，攻毒保护达到9/10，对照组10/10发病，其中6只死亡，表明该分离株抗原含量达到1.0×10⁸CFU/mL时，攻毒后保护即可达到9/10，免疫原性好。详见表2。

表2 EC BYT01分离株的免疫原性试验结果

二、鸭疫里默氏杆菌的分离及鉴定：

⑴将从山东、广东、福建、广西等地收集的病死鸭进行无菌操作，取病死鸭心、血、肝或脑组织划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂（使用前加5%犊牛血清）平板、鲜血营养琼脂培养基、普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基平板上，置于含5%CO₂的37℃恒温培养箱中培养24h。其中38株的结果如下：在胰蛋白胨大豆琼脂平板上，置含5%CO₂恒温培养箱培养，菌落呈圆形奶白色，突起，光滑，边缘整齐，斜光观察时菌落发绿光，有的培养基亦被衬成绿色，不同菌株绿光深浅程度不同，在鲜血琼脂上呈圆形，不溶血，有闪光，呈奶油状菌落，麦康凯琼脂和普通营养琼脂上均不生长，38株分离菌分别命名为RA BYT01、RA BYT02至RA BYT38。

⑵取纯培养的细菌的单个菌落涂于干净的载玻片上，然后分别用瑞氏染色法染色和革兰氏染色，镜检，观察其形态特征。革兰氏染色，为革兰氏阴性细小杆菌，呈单个或成对分布，偶尔呈链状排列，不运动，无芽胞；瑞氏染色大部分菌体两极浓染。

⑶取纯培养物分别进行吲哚（靛基质）试验，甲基红（M.R.）试验，V-P试验，过氧化氢酶试验，接触酶试验，尿素酶试验，葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、卫矛醇、鼠李糖、果糖发酵试验。37℃培养，连续观察7天。结果表明其中9株菌部分发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖外，其余菌株均不发酵糖类，不产生硫化氢，过氧化氢酶试验、接触酶试验、尿素酶试验均为阳性，V-P试验、甲基红（M.R.）试验、吲哚（靛基质）试验均为阴性，符合鸭疫里默氏杆菌的生化反应特征。

⑷取初步分离保存的各株鸭疫里默氏杆菌纯培养物，分别用鸭疫里默氏杆菌定型血清作平板凝集试验，以确定其血清型。结果显示，38株细菌分离株中7株为血清型2型，4株为血清型1型，3株为血清型3型，3株为血清型4型，1株为血清型5型，2株为血清型6型，3株为血清型7型，3株为血清型9型，3株为血清型10型，1株为血清型11型，其中2型为优势血清型。

⑸7株血清2型鸭疫里默氏杆菌毒力测定试验

分别将分离菌纯培养的单个菌落划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂（使用前加5%犊牛血清）平板上，37℃培养24h，刮取平板上所有菌落混于灭菌生理盐水中制成细菌悬液，以0.5mL/只剂量肌肉注射19日龄健康易感鸭10只，同时设立灭菌生理盐水注射对照组10只。攻毒后连续观察10天，每日记录鸭子的精神、食欲、饮水、运动及死亡情况，并对死亡鸭进行病理剖检、细菌分离及鉴定。结果表明，RA BYT06株所攻毒鸭在攻毒40h后，鸭开始出现精神萎靡，行动迟缓或俯卧不起，眼、鼻流分泌物，共济失调等症状，其余株部分在90h后出现症状，部分未临床出现症状；RA BYT06株攻毒后全部发病，10天内多数发病鸭死亡，死亡达到5/10，剖检可见典型的心包炎、肝周炎、气囊炎，RABYT17、RA BYT21、RA BYT24株发病3/10~7/10，死亡0/10~2/10，因此可确定RA BYT06株毒力最强，详见表1。取心血涂片和肝组织印片进行瑞氏染色后显微镜下观察检查，RA BYT06株可见两极浓染的小杆菌，单个或成对存在，并能从心血和肝组织在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上分离出接种菌，其生化及培养特征与RA BYT06株株鉴定结果一致，因此本研究选用鸭疫里默氏杆菌(Riemeralla anatipestifer)RA BYT06株作为疫苗用强毒菌株。并于2012年11月15日送中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.6832。

表1：7株血清型2型鸭疫里默氏杆菌的毒力测定试验结果

注："-"表示未发病

⑹鸭疫里默氏杆菌强毒分离株RA BYT06株的免疫原性测定

将确定的强毒分离株RA BYT06接种胰蛋白胨大豆肉汤（使用前加5%犊牛血清）培养基培养后，以平板培养计数法进行活菌计数，收集菌体，将其浓度稀释到3.0×10⁶、3.0×10⁷、3.0×10⁸、3.0×10⁹、3.0×10¹⁰CFU/mL五组，分别按照油水比为2:1的比例做成油佐剂灭活疫苗，使配苗后每毫升抗原液菌数分别为1.0×10⁶、1.0×10⁷、1.0×10⁸、1.0×10⁹、1.0×10¹⁰CFU，取5日龄健康易感雏鸭60只，10只/组，分别用含有不同浓度抗原的灭活疫苗进行颈部皮下注射，0.25mL/只，10只作为非免疫对照，接种后14日，每只鸭各肌肉注射0.5mL(1.0×10⁶CFU/mL)RA BYT06株菌液，观测10日，测定疫苗的免疫保护效果。结果如表3所示，当抗原含量达到1.0×10⁷CFU/mL以上，免疫剂量为0.25mL时，保护8/10，当抗原含量达到1.0×10⁸CFU/mL以上，免疫剂量为0.25mL时，保护达到9/10，对照组10/10发病且其中5只死亡，结果表明当抗原含量达到1.0×10⁸CFU/mL时，攻毒保护达到9/10，免疫原性好；具体结果见表2。

表2：RA BYT06分离株的免疫原性试验结果

鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗的制备

⑴将鸭疫里默氏杆菌RA BYT06冻干菌种接种于胰蛋白胨大豆肉汤（使用前加5%犊牛血清）中，37℃培养20h后，取培养物于胰蛋白胨大豆琼脂（使用前加5%犊牛血清）平板上划线培养，挑选10个左右典型菌落，分别接种胰蛋白胨大豆琼脂（使用前加5%犊牛血清）斜面若干支，置37℃培养24h，经纯粹检验合格作为一级种子。在2～8℃保存，使用期不超过14日。

⑵将一级种子接种于胰蛋白胨大豆肉汤（使用前加5%犊牛血清）中，置37℃培养20h，取样进行纯粹检验合格者作为二级种子。置2～8℃保存，使用期不超过3日。

⑶用发酵罐进行鸭疫里默氏杆菌RA BYT06株通气培养，按容积装入60％胰蛋白胨大豆肉汤培养基及消泡剂。灭菌后按培养基量的2%接种二级种子液，37℃培养10h～12h。按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹。每毫升菌液中活菌数应不少于2×10⁹CFU。

⑷根据活菌计数结果，计算细菌的总含量，再将菌液经连续离心机浓缩后，取菌泥用灭菌生理盐水稀释，调整至每毫升菌液中含鸭疫里默氏杆菌6.0×10¹⁰CFU。加入终浓度为0.5%的甲醛溶液，经37℃灭活48h，作灭活检验。按现行《中国兽药典》附录做灭活检验，应无菌生长。

⑸将检验合格的灭活菌液，用灭菌生理盐水调整至生产用体积，使每毫升菌液中至少含鸭疫里默氏杆菌6.0×10⁹CFU。按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验检验，应无菌生长。

⑹取注射用白油94份、司本-806份混合后，加入2%硬脂酸铝，加热熔化至透明，混合均匀，制成油相，取鸭疫里默氏杆菌RA BYT06菌液96份，加入高压灭菌的吐温-804份，充分溶解混匀。从油相罐内将2份油相打到乳化罐内，开动电机预乳化，同时徐徐加入制备好的鸭疫里默氏杆菌液1份，加完后再以3500r/min乳化40分钟即可（乳化温度应控制在25~28℃之间）在乳化终止前加入1%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%。定量分装，加盖密封。

鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗的检验

⑴性状：外观应为乳白色乳剂；剂型应为油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，均应呈油滴状不扩散；稳定性，吸取疫苗10mL，装于离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不高于0.5mL；黏度，按现行《中国兽药典》附录检验，黏度应不超过200cP，按现行《中国兽药典》附录进行装量检查，应符合规定；按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。

⑵安全检验：取5日龄健康易感雏鸭10只，各颈部皮下注射疫苗0.5mL。观察14日，应全部健活，且不出现因注射疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

⑶效力检验

血清学方法：用5日龄健康易感雏鸭20只，10只各颈部皮下注射疫苗0.25mL，另10只不接种作为对照，接种后14日，连同对照鸭10只，采血测定抗体凝集效价，免疫鸭血清抗体效价几何平均值均应不低于1:16，对照鸭血清抗体效价几何平均值均应不高于1:2。

免疫攻毒法：用5日龄健康易感雏鸭20只，10只各颈部皮下注射疫苗0.25mL，另10只不接种作为对照，接种后14日，每只鸭各肌肉注射鸭疫里默氏杆菌RA BYT06株菌液0.5mL（1.0×10⁶CFU/mL）。观察10日，免疫组应至少保护9只，对照组至少9只发病且至少5只死亡。

按上述方法制备5批鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗，每批抽取1瓶，分别用5日龄健康易感鸭20只，10只各颈部皮下注射疫苗0.25mL，另10只作对照。14日后，连同对照10只，采血分离血清，检测血清抗体效价，再连同对照鸭，每只鸭肌肉注射RA BYT06F8代菌株液0.5mL(1×10⁶CFU/mL)，观察10日。结果显示，试验组各批疫苗血清抗体效价几何平均值达到1:18.38~1:25.99，攻毒保护均达到9/10~10/10，对照鸭均发病且其中5只死亡（详见表3）。

表3：5批鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗效力检验结果

上述的实验结果表明，本发明筛选得到的鸭疫里默氏杆菌具有高致病性，用其制备的灭活疫苗，能够预防以神经症状、纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎

为特征的鸭传染性浆膜炎的发生。

三、鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌二联灭活疫苗的制备

⑴将鸭大肠杆菌EC BYT01株冻干菌种接种于营养肉汤中，37℃培养8h后，取培养物于营养琼脂平板上划线培养，挑选10个左右典型菌落，分别接种营养琼脂斜面若干支，置37℃培养12h，经纯粹检验合格作为一级种子。鸭疫里默氏杆菌RA BYT06冻干菌种接种于胰蛋白胨大豆肉汤（使用前加5%犊牛血清）中，37℃培养20h后，取培养物于胰蛋白胨大豆琼脂（使用前加5%犊牛血清）平板上划线培养，挑选10个左右典型菌落，分别接种胰蛋白胨大豆琼脂（使用前加5%犊牛血清）斜面若干支，置37℃培养24h，经纯粹检验合格作为一级种子。在2～8℃保存，使用期不超过14日。

⑵将鸭大肠杆菌一级种子接种于营养肉汤中，37℃培养8h，纯粹检验合格者作为二级种子。将鸭疫里默是杆菌一级种子接种于胰蛋白胨大豆肉汤（使用前加5%犊牛血清）中，置37℃培养20h，取样进行纯粹检验合格者作为二级种子。置2～8℃保存，使用期不超过3日。

⑶用发酵罐进行鸭大肠杆菌EC BYT01株通气培养，按容积装入60％营养肉汤培养基及消泡剂。灭菌后按培养基的2%接种二级种子液，37℃培养6h～8h。用发酵罐进行鸭疫里默氏杆菌RA BYT06株通气培养，按容积装入60％胰蛋白胨大豆肉汤培养基及消泡剂。灭菌后按培养基量的2%接种二级种子液，37℃培养10h～12h。按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹。每毫升菌液中活菌数应不少于2×10⁹CFU。

⑷根据活菌计数结果，分别计算两种细菌的总含量，再将两种菌液分别经连续离心机浓缩后，取菌泥用灭菌生理盐水稀释，调整至每毫升菌液中含鸭大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌数均不少于6.0×10¹⁰CFU。分别加入终浓度为0.5%的甲醛溶液，经37℃灭活48h，作灭活检验。按现行《中国兽药典》附录做灭活检验，应无菌生长。

⑸分别将两种检验合格的灭活菌液，用灭菌生理盐水调整至生产用体积，使每毫升菌液中至少含鸭大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌6.0×10⁹CFU。按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验检验，应无菌生长。

⑹取注射用白油94份、司本-80 6份混合后，加入2%硬脂酸铝，加热熔化至透明，混合均匀，制成油相；将检验合格的鸭疫里默氏杆菌RA BYT06株菌液、鸭大肠杆菌EC BYT01株菌液按1:1混合，搅拌均匀，取混匀的菌液96份，加入高压灭菌的吐温-80 4份，充分溶解混匀，制成水相。将2份油相打到乳化罐内，开动电机预乳化，同时徐徐加入制备好的水相1份，加完后再以3500r/min乳化40分钟即可（乳化温度应控制在25～28℃之间）在乳化终止前加入1%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%。定量分装，加盖密封。

鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌二联灭活疫苗的检验

⑴性状：外观应为乳白色乳剂；剂型应为油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第1滴外，均应呈油滴状不扩散；稳定性，吸取疫苗10mL，装于离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不高于0.5mL；黏度，按现行《中国兽药典》附录检验，黏度应不超过200cP，按现行《中国兽药典》附录进行装量检查，应符合规定；按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，应无菌生长。

⑵安全检验：取5日龄健康易感雏鸭10只，各颈部皮下注射疫苗0.5mL。观察14日，应全部健活，且不出现因注射疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

⑶效力检验

血清学方法：用5日龄健康易感雏鸭20只，10只各颈部皮下注射疫苗0.25mL，另10只不接种作为对照，接种后14日，连同对照鸭10只，采血测定抗体凝集效价，免疫鸭大肠杆菌抗体效价几何平均值均应不低于1:32，免疫鸭疫里默氏杆菌抗体效价几何平均值均应不低于1:16，对照鸭血清抗体效价几何平均值均应不高于1:2。

免疫攻毒法：用5日龄健康易感雏鸭40只，20只各颈部皮下注射疫苗0.25mL，另20只不接种作为对照，接种后14日，10只接种疫苗的鸭只及10只对照组鸭只各肌肉注射鸭大肠杆菌EC BYT01株菌液0.5mL（1.0×10⁶CFU/mL），观察10日，免疫组应至少保护9只，对照组至少9只发病且至少6只死亡。10只接种疫苗的鸭只及10只对照组鸭只各肌肉注射鸭疫里默氏杆菌RA BYT06株菌液0.5mL（1.0×10⁶CFU/mL）。观察10日，免疫组应至少保护9只，对照组至少9只发病且至少6只死亡。

按上述方法制备5批鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌二联灭活疫苗，每批抽取1瓶，分别用5日龄健康易感鸭20只，10只各颈部皮下注射二联苗0.25mL，另10只作对照。14日后，连同对照10只，采血分离血清，检测鸭大肠杆菌抗体效价，再连同对照鸭，每只鸭肌肉注射EC BYT01株菌液0.5mL(1×10⁶CFU/mL)，观察10日。结果显示，试验组各批疫苗鸭大肠杆菌血清抗体效价几何平均值达到1:34.30~1:48.50，攻毒保护均达到9/10~10/10，对照鸭均发病且其中7只死亡（详见表3）。

另取5日龄健康易感鸭20只，10只各颈部皮下注射二联苗0.25mL，另10只作对照。14日后，连同对照10只，采血分离血清，检测鸭疫里默氏杆菌抗体效价，再连同对照鸭，每只鸭肌肉注射RA BYT06F8代菌株液0.5mL(1×10⁶CFU/mL)，观察10日。结果显示，试验组各批疫苗鸭疫里默氏杆菌血清抗体效价几何平均值达到1:19.70~1:25.99，攻毒保护均达到9/10~10/10，对照鸭均发病且其中5只死亡（详见表4）。

表3：5批二联灭活疫苗鸭大肠杆菌病部分效力检验结果

表4：5批二联灭活疫苗鸭传染性浆膜炎部分效力检验结果

上述的实验结果表明，本发明制备的鸭大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌二联灭活疫苗，能够预防以引起鸭大肠杆菌性败血症的特征病变如心脏或肝脏有纤维素渗出性炎症、心包膜炎或胸膜发生粘连为特征的鸭大肠杆菌病，并可以预防以神经症状、纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征的鸭传染性浆膜炎的发生，具有良好的市场推广前景。

Claims (4)

1.一株鸭大肠杆菌，其保藏编号为CGMCC No.6831。

2.权利要求1所述的鸭大肠杆菌在制备疫苗中的应用。

3.一种二联灭活疫苗，包括有疫苗佐剂和抗原，所述的抗原为权利要求1所述的鸭大肠杆菌和保藏编号为CGMCC No.6832的鸭疫里默氏杆菌。

4.权利要求3所述的二联灭活疫苗，用于预防鸭大肠杆菌病和鸭传染性浆膜炎。