CN103484411A

CN103484411A - 禽源大肠杆菌疫苗株（nn株）及其应用

Info

Publication number: CN103484411A
Application number: CN201310468079.6A
Authority: CN
Inventors: 王伟; 许秀梅; 汪爱芬
Original assignee: NANJING TIANBANG BIO-INDUSTRY Co Ltd
Current assignee: Zhaofenghua Biotechnology (Nanjing) Co., Ltd
Priority date: 2013-10-10
Filing date: 2013-10-10
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-10-10
Also published as: CN103484411B

Abstract

本发明属于兽医生物医药领域，涉及一株禽源大肠杆菌天然融合株（O1/O2）NN株及该融合株作为疫苗株在防制鸭大肠杆菌病中的应用和应用效果。本发明疫苗株的微生物保藏号是：7670。本发明公开的疫苗株安全性良好、效力稳定，对由血清型O1和O2引起的鸭大肠杆菌病均具有良好的保护效力。该疫苗株可用于制备防治鸭大肠杆菌病的灭活单苗或联苗。

Description

禽源大肠杆菌疫苗株(NN株)及其应用

技术领域

本发明属于兽医生物新医药技术领域，涉及一株禽源大肠杆菌疫苗株NN株及其应用。

背景技术

鸭大肠杆菌病是一种急性败血性传染病，主要侵害2-6周龄的雏鸭。不管是原发性或继发性，其主要特征为发生心包炎、肝周炎、气囊炎、输卵管炎的病变。眼炎型的多见于1心周龄的雏鸭；关节炎型的多于7-10日龄的雏鸭；脑炎型的多见于1周龄雏鸭；浆膜型的多见于2~6周龄雏鸭。随着养鸭业的日益发展和集约化程度的提高及鸭大肠杆菌病的发生日趋严重，鸭大肠杆菌病给养鸭业造成了严重的经济损失，尤其是近年来，在我国种鸭的细菌病中大肠杆菌病显著增多。据调查显示，鸭大肠杆菌病在我国不同类型的养鸭场中普遍存在，流行广泛。

关于鸡源致病性大肠杆菌的血清型报道较多，而鸭源致病性大肠杆菌血清型的报道较少，由于大肠杆菌的血清型较为复杂，给防治工作带来一定的困难。据有关报道，对鸭有致病性的以O1、O2、O35、O36、O73、O78为主，而且不同地区血清学差别很大。因此，在大肠杆菌的防控上，大家都致力于制备融合株，制备多价疫苗，以此期望用一种疫苗同时对多个血清型的大肠杆菌病能产生保护。关于天然融合株，由刘吉山等首次分离报道，当时就提出这为疫苗制备时涵盖更多细菌血清型提供了方便条件。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对禽源大肠杆菌血清型众多，不同地区甚至不同养殖场的流行菌株都不尽相同，为了满足一种疫苗多种保护的需求，从临床发病鸭群中分离筛选出一株天然融合株，该菌株制备疫苗对大肠杆菌血清型O1和O2引起的大肠杆菌病均能产生良好的保护。

本发明所要解决的技术问题是通过如下途径实现的：

本发明提供一种禽源大肠杆菌疫苗株NN株，微生物保藏号是： CGMCC No. 7670，分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；保藏时间2013-5-31；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明提供的E.coli NN疫苗株的来源于：

2009年10月分离于安徽省某大型鸭场，具有典型肝周炎、心包炎、输卵管炎、气囊炎及卵黄性腹膜炎等病变,通过革兰氏染色、菌落形态观察、培养特性试验和生化试验鉴定，确定为大肠杆菌。应用大肠埃希菌O抗原定型血清鉴定为O1/O2。

E.coli NN株具有如下特性：

（1）培养特性麦康凯培养基上的圆形、湿润、光滑的红色单个菌落；伊红美蓝培养基上生成暗紫红色或紫黑色具有金属光泽的菌落；革兰氏阴性小杆菌。

（2）生化特性可发酵碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖等；枸橼酸盐利用、V-P试验均为阴性；M-R试验、硝酸盐还原、靛基质氧化酶为阳性

（3）血清型通过玻片凝集试验分离株与单因子血清O1和O2都发生凝集，鉴定此株细菌为天然融合株O1/O2株。

（4）毒力攻毒剂量为1×10⁹CFU/只时，可致10只21日龄雏鸭全部死亡。

本发明提供的禽源大肠杆菌NN株有益效果如下：

分离自自然发病鸭，具有流行血清型，与单因子血清O1和O2都发生凝集，一株天然融合株，以NN株为疫苗株制成的灭活疫苗对两种血清型菌株引起的大肠杆菌病均有不同程度的保护。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明提供的毒株应用领域和形式构成任何限制。

实施例1　禽源大肠杆菌NN株分离鉴定

一、细菌的分离培养

1、病料分离采用无菌操作，取病鸭的心脏、肝脏，用灭菌的接种环将病料接种于营养琼脂平板上，37℃，培养18～24h，观察结果。

2、纯化培养 E.coli分离株接种TSA培养基上，37℃培养箱中培养24 h后长出圆形、光滑、隆起、湿润半透明的近无色的菌落；麦康凯培养基上的圆形、湿润、光滑的红色单个菌落；接种于伊红美蓝培养基上，37℃，培养 18～24h生成暗紫红色或紫黑色具有金属光泽的菌落；革兰氏染色观察；将革兰氏染色形态为：两端钝圆、散在或成对、无芽孢的红色小杆菌。

二、细菌鉴定

1、生化鉴定

E.coli分离株可发酵碳水化合物，如葡萄糖、乳糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖等；枸橼酸盐利用为阴性；尿素利用、H2S、VP等均为阴性。M.R.试验、吲哚试验为阳性。

2、血清型鉴定

2.1、玻片凝集抗原的制备

用灭菌PBS洗下E.coli分离株的纯培养物，置小圆底试管中，制成浓稠菌悬液，然后与普通肉汤小瓶培养物一起于121℃高压2小时，破坏其“K”抗原，制成高压抗原。

2.2、玻片凝集试验方法

将5ul已制备好的 E.coli分离株玻片凝集抗原和5ul阳性血清分别在玻片上混匀，同时以E.coli标准株玻片凝集抗原设为抗原阳性反应对照，以鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和生理盐水设为抗原阴性反应对照，结果判定：抗原与血清混合后3 min内与单因子血清O1和O2均出现颗粒状凝集。

3、毒力测定

3.1、NN株动物回归试验

NN株的纯培养物接种14日龄雏鸭后，结果显示，攻毒剂量为1×10⁸CFU/只时，死亡率达到80％。试验鸭病程变化：攻毒后18h开始发病，发病鸭精神沉郁、缩颈、扎堆、不能站立、停止采食和饮水、眼鼻有分泌物、眼眶周围湿润、灰绿色水样腹泻等症状。病程2～4d，死前抽搐，有的鸭子会有神经症状：狂奔。剖检病死鸭，24h内死亡鸭大多心包、肝脏、气囊表面的纤维素性渗出不明显，但败血症严重；72h后死亡鸭心包、肝脏表面、气囊有大量灰白色纤维素性渗出物，部分鸭心包膜与胸内壁粘连，果冻样渗出物，脾肿大。

3.2、NN株的半数致死量测定

将NN株的18～24 h纯培养物(8.0×10⁹～1.0×10¹⁰CFU/mL)用无菌生理盐水作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍稀释后，分别取0.5 mL腿肌接种14日龄樱桃谷鸭。其中试验组雏鸭分4组，每组5只，另5只作为对照，对照鸭以同样方式注射等量灭菌生理盐水。接种后连续观察l周。根据各组死亡情况计算出NN株的半数致死量(LD₅₀)。

根据试验结果，得到NN株对雏鸭的半数致死量为1.7×10⁷CFU/羽。攻毒结果见表1。

表1 半数致死量的测定结果

3.3、NN株对不同日龄试验鸭的毒力测定

将NN株的18～24 h纯培养物(8.0×10⁹～1.0×10¹⁰ CFU/mL)用无菌生理盐水作10倍稀释后，活菌计数，根据需要调整菌液浓度。将试验鸭分为4批进行攻毒，即分别对21、35、49和60日龄的健康鸭进行颈部皮下注射攻毒；每批按不同攻毒剂量分为3组，每组10只，空白对照组10只，以同样方式注射等量灭菌生理盐水。接种后连续观察l0天。根据各组死亡情况计算出NN株的攻毒菌量。

根据攻毒结果统计，不同日龄最佳攻毒剂量，即能使试验鸭只100％发病的攻毒剂量分别为：21日龄1×10⁹CFU/只，35日龄1×10¹⁰CFU/羽，49日龄5×10¹⁰CFU/羽。而60日龄的鸭只对5×10¹⁰CFU/羽的攻毒剂量表现为不发病无感染，对于1×10¹¹CFU/只的发病率仅为50％，表明60日龄的鸭只对于鸭大肠杆菌的感染性明显降低。结果见表2。

表2 NN株对不同日龄试验鸭的毒力测定

注：*发病数/攻毒数

3.2 NN对不同品种鸭的毒力试验

将E.coli SH株稀释成约1.0×l0⁹CFU/0.2ml，颈部皮下注射21日龄健康易感半番鸭、麻鸭、樱桃谷鸭、番鸭，每种鸭注射10羽，每羽0.2ml，观察10日。结果见表3。

由表3结果可见，NN株使用同一剂量攻毒时，不同品种鸭发病率无差异，发病率率均为10/10，说明不同品种鸭对NN株攻击敏感程度无显著差异。

表3 E.coli SH对不同品种鸭的毒力试验

4、免疫原性试验

将NN株培养、浓缩、灭活、加入油佐剂制成单价灭活苗，确保疫苗各菌株的最终含菌量为5×l0⁹CFU/ml以上作为疫苗。将制备的疫苗分别免疫3日龄健康易感雏鸭，每种疫苗免疫10羽，每羽0.3ml，同样条件饲养。免疫后14日，连同对照鸭10羽进行攻毒试验，疫苗免疫组及其对照组，每羽分别颈部皮下注射NN株活菌1×l0⁹CFU/羽，观察10日。攻毒结果见表4。

表5 效力试验检验结果

实施例2　禽源大肠杆菌NN株灭活疫苗制备

1、抗原制备

1.1、生产用种子制备

1.1.1、一级菌种繁殖及鉴定将冻干菌种接种于改良马丁肉汤培养基中，置36~37℃培养24小时，然后划线接种于含胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板，置37℃培养24小时，挑选典型菌落，再移植于改良马丁肉汤，置36~37℃培养24小时。

1.1.2、二级种子繁殖将一级种子接种于适量改良马丁肉汤中，置36~37℃振荡培养24小时。

1.2、制苗用菌液制备

1.2.1、菌液培养用发酵罐通气培养，按培养器容积装入适量培养基（70%左右）及消泡剂，灭菌后按培养基量接种10%二级种子液，36.5℃通气培养24小时。培养结束后的发酵液划线接种于TSA培养基作纯粹检验。

1.2.2、抗原细菌的浓缩和计数纯检合格的菌液分别经超滤浓缩仪浓缩后，用pH7.2的PBS制成悬浮液，采用活菌计数法，在普通TSA平板上进行计数，将培养后的发酵液用改良马丁肉汤作为稀释液，10倍梯度稀释，取10^-6、10^-7、10^-8三个稀释度各0.1ml滴在5%兔血TSA平板平板上，并将其均匀分布于平板上，于37℃培养箱中培养18~22h，计数菌落，计算发酵液的活菌数量，菌体生长以活菌数表示，浓缩菌液含菌量均应≧2.0×10¹⁰CFU/ml。

1.2.3、灭活

将浓缩菌液置无菌灭活罐内，计量加入10％甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，甲醛溶液最终浓度为0.5％。加完甲醛溶液后用无菌压缩空气将其压入另一无菌灭活罐内，置37℃灭活24h（以罐内温度达到37℃开始计时）。灭活结束后，取灭活菌液接种于TSA平板，37℃培养24小时，应无菌生长。

2、灭活疫苗制备

2.1、水相制备将灭活检验合格的NN株抗原96份与Tween-80 4份，在水相罐中混匀备用。

2.2、油相的制备取注射用白油96份、司本—80 4份，加入油相罐中，加热搅拌混匀，经121℃灭菌30分钟，冷却至室温备用。

2.3、乳化及分装将3份油相放入乳化罐内，启动乳化罐搅拌机搅拌，同时徐徐加入水相一份，加完后继续搅拌10～15min，打开均质机进出口开关，启动均质机，使乳化液经均质机进入另一罐，如此反复乳化数次（一般6～8次），乳化后取10ml，以3000r/min离心15min，若有分层现象，应重复搅拌一次。将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封。

3、疫苗的检验

3.1、物理性状

外观乳白色均匀乳剂。

剂型油包水型，取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第一滴呈云雾状扩散外，以后各滴均扩散。

稳定性取疫苗10ml装于离心管内，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相为0.2ml。

黏度黏度仪测定油苗的黏度（上海方瑞仪器厂 DV-1），黏度为28cP。

3.2无菌检验无菌生长。

3.3 安全检验用3日龄健康易感雏鸭10羽，各颈部背侧皮下注射疫苗0.6ml (2羽份)，观察14日，

在观察期内均健活，未见行为异常，精神状态良好，眼睛和鼻腔等无异常分泌物，进食和排便无异常。自疫苗注射部位剖检试验鸭，发现注射局部疫苗吸收良好，无红肿硬结出现。即疫苗注射后均未出现与疫苗相关的局部或全身不良反应。

3.4效力检验

用3日龄健康易感雏鸭80羽，随机分为4组。每组20羽，其中3组为免疫组，分别免疫3批实验室制品，各颈部背侧皮下注射疫苗0.3ml，另一组作为阴性对照，同条件饲养。免疫后14日，取免疫鸭10羽和对照鸭10羽，每羽注射WJ株(血清型O1)0.2ml（内含活菌5×l0⁸CFU）；另取免疫鸭10羽和对照鸭10羽，每羽腿部肌肉注射D48株（血清型O2）0.2ml(内含活菌5×l0⁸CFU)，观察10日。效力试验结果见表5。

表5 效力试验检验结果

免疫效力试验结果显示，以NN株为疫苗株制成的灭活疫苗对WJ株(血清型O1)的保护率为70％，对D48株（血清型O2）的保护率为80％，对两种血清型菌株引起的大肠杆菌病均有不同程度的保护。

Claims

1.一种禽源大肠杆菌（O1/O2）疫苗株NN株，微生物保藏号CGMCC No是7670。

2.一种疫苗组合物，其特征在于包含灭活的如权利要求1所述的禽源大肠杆菌（O1/O2）疫苗株NN株和药学上可接受的佐剂。

3.权利要求1所述的疫苗株E.coli NN在制备防制由血清型O1和O2引起的鸭大肠杆菌病药物中应用。