CN103007266B

CN103007266B - 鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN103007266B
Application number: CN201210435934.9A
Authority: CN
Inventors: 罗玲; 艾地云; 邵华斌; 温国元; 罗青平; 王红琳; 杨峻; 张蓉蓉
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-11-06
Filing date: 2012-11-06
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2032-11-06
Also published as: CN103007266A

Abstract

本发明涉及鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗、制备方法及其应用。它包含鸭大肠杆菌菌株ECHB-3、鸭大肠杆菌菌株ECHB-9、鸭大肠杆菌菌株ECHB-40的灭活菌液，所述灭活菌液中的活菌总数为30~60亿cfu/mL；所述鸭大肠杆菌菌株ECHB-3已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2011438；所述鸭大肠杆菌菌株ECHB-9已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2011439；所述鸭大肠杆菌菌株ECHB-40已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2011440。该疫苗保护力强，保护率达80%以上；安全性高；针对性强。

Description

鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗、制备方法及其应用，属于生物制品领域。

背景技术

鸭大肠杆菌是一种潜在的人畜共患病病原，在我国不同类型的养鸭场中普遍存在，流行广泛，血清型众多，不同地区差异较大，发病率和死亡率较高。该病在临床剖检上主要表现为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎。各种年龄的鸭均可感染，雏鸭最易感，2－6周龄多发，发病率和死亡率较高，在商品肉鸭中死亡率可高达50％左右，而且常常与鸭传染性浆膜炎混合感染，成年鸭和种鸭主要表现为零星死亡。天气变化、高温高湿发病率较高，雏鸭温度过低也可增加本病的发生。随着养鸭业的日益发展和集约化程度的提高，鸭大肠杆菌病的发生日趋严重，给养鸭业造成了严重的经济损失。目前国内无有效的疫苗上市，只是通过抗菌药物控制本病。虽然抗菌药物能迅速控制本病，但停药后极易复发，且易产生耐药性。食源性动物耐药菌可通过多种途径将耐药基因传递给人类致病菌，危害人类健康，还可引起禽产品中药物残留、食品安全问题。由于鸭大肠杆菌的血清型众多，即使同一地区甚至是同一鸭场就存在多种血清型，且无交叉保护性，说明了使用疫苗进行免疫接种预防本病的困难性，所以筛选出致病性大肠杆菌的优势血清型菌株生产灭活疫苗防治该地的鸭大肠杆菌病效果好，可大大减少药物应用，对避免细菌耐药菌株的产生、减少药物残留、保证畜产品安全、促进人类的健康具有重要的现实意义。目前，有关鸭大肠杆菌病灭活疫苗国内外较少报道。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗、制备方法及其应用。本发明通过以分离鉴定筛选得到大肠杆菌优势血清型菌株鸭大肠杆菌菌株ECHB-3 (Escherichia coli ECHB-3)、鸭大肠杆菌菌株ECHB-9(Escherichia coli ECHB-9)、鸭大肠杆菌菌株ECHB-40 (Escherichia coli ECHB-40)，然后制备而得的鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗安全性强，免疫效果好，可克服由于血清型众多且无交叉保护带来的预防本病的困难性，减少鸭大肠杆菌病的发生率。

本发明为解决上述技术问题而采取的技术方案为：

鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗，其特征在于：它含有鸭大肠杆菌菌株ECHB-3 (Escherichia coli ECHB-3)、鸭大肠杆菌菌株ECHB-9(Escherichia coli ECHB-9)、鸭大肠杆菌菌株ECHB-40 (Escherichia coli ECHB-40)的灭活菌液，所述灭活菌液中的活菌总数为30~60亿cfu/mL；其中：所述的鸭大肠杆菌菌株ECHB-3(Escherichia coli ECHB-3)已于2011年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2011438，分类命名为大肠杆菌ECHB-3(Escherichia coli ECHB-3)；所述的鸭大肠杆菌菌株ECHB-9(Escherichia coli ECHB-9)已于2011年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2011439，分类命名为大肠杆菌ECHB-9(Escherichia coli ECHB-9)；所述的鸭大肠杆菌菌株ECHB-40(Escherichia coli ECHB-40)已于2011年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2011440，分类命名为大肠杆菌ECHB-40(Escherichia coli ECHB-40)。

按上述方案，所述灭活菌液中鸭大肠杆菌ECHB-3的个数为10~20亿cfu/mL，鸭大肠杆菌ECHB-9的个数为10~20亿cfu/mL，鸭大肠杆菌ECHB-40的个数为10~20亿cfu/mL。

按上述方案，所述的鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗还包括佐剂和防腐剂。

按上述方案，所述的佐剂为氢氧化铝胶生理盐水，按体积比计，所述的佐剂量以每5份制苗用混合菌液加入1份进行计量；所述的防腐剂为硫柳汞，所述的防腐剂以加入佐剂后的体系总量的0.005wt%进行计量。

所述的鸭大肠杆菌菌株ECHB-3、鸭大肠杆菌菌株ECHB-9和鸭大肠杆菌菌株ECHB-40系对湖北省鸭大肠杆菌病进行流行病学调查以获得鸭大肠杆菌病的优势血清型，然后对湖北省不同地区分离的154株鸭大肠杆菌，经培养特性、形态特征、生化特性、血清型鉴定、动物致病性试验和免疫原性试验，筛选而获得的三株致病性强、免疫原性好的优势血清型菌株。

所述各鸭大肠杆菌菌种的分离方法如下：无菌操作取病、死亡鸭肝脏、心脏和气囊直接划线于麦康凯琼脂上，37℃培养24h，观察结果。从其中挑取红色、圆形隆起、光滑的菌落，进行革兰氏染色镜检，并划线于伊红美蓝琼脂上，观察菌体形态及染色特征。革兰氏染色镜检可见到阴性、两端钝圆的短杆菌，在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落。细菌的纯培养：从麦康凯琼脂上挑取红色、圆形隆起、光滑的菌落在新的麦康凯琼脂上划线，37℃培养24h，再次染色、镜检。若菌体形态和染色特性符合大肠杆菌的形态和染色特性时，挑取剩余的半个菌落接种于麦康凯斜面培养基，37℃培养24h，即为分离纯化细菌。

所述的鸭大肠杆菌菌株ECHB-3、鸭大肠杆菌菌株ECHB-9和鸭大肠杆菌菌株ECHB-40菌株的特性如下：

形态和生化特性均为革兰氏阴性杆菌，生化特性符合细菌分类学中本菌的特性。

培养特性分别接种于麦康凯培养基平板上，36~37℃培养24小时，肉眼观察均呈粉红色或砖红色，菌落隆起，表面光滑。低倍显微镜下45°折光观察，边缘整齐，呈鲜艳的金光。

血清学特性鸭大肠杆菌菌株ECHB-3 (Escherichia ECHB-3) 为O78、鸭大肠杆菌菌株ECHB-9(Escherichia ECHB-9)为O45、鸭大肠杆菌菌株ECHB-40 (Escherichia ECHB-40)菌株为O8。

毒力将鸭大肠杆菌菌株ECHB-3、鸭大肠杆菌菌株ECHB-9和鸭大肠杆菌菌株ECHB-40菌株分别于马丁肉汤单独培养20~24小时得到各菌株的菌液0.5ml（含活菌2~5亿cfu），然后将各菌液于肌肉或腹腔分别注射2周龄健康易感蛋鸭10只，观察可得：皆出现明显临床症状，14日内死亡或活鸭内脏有明显病变。

免疫原性用2周龄健康易感鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗0.5ml，21日后连同条件相同的对照鸭10只，各肌肉或腹腔注射鸭大肠杆菌菌株ECHB-3、ECHB-9、ECHB-40的混合菌液0.5ml（含活菌2~5亿cfu），所述的混合菌液是将鸭大肠杆菌菌株ECHB-3、鸭大肠杆菌菌株ECHB-9和鸭大肠杆菌菌株ECHB-40菌株分别于马丁肉汤单独培养20~24小时得到的菌液混合得到的。观察14日，对照鸭全部发病或死亡，剖检后全部具有典型病变（反应在++以上）；免疫鸭至少保护8只，对在观察期内出现“+”以上明显临床反应的存活鸭，在观察结束时进行剖检，内脏无纤维素渗出性炎症。

鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

（1）疫苗种子液的制备

一级种子繁殖：各菌株冻干菌种分别接种于马丁肉汤中，36~37℃培养24小时，然后划线接种于麦康凯琼脂平板上培养，选取符合标准的典型菌落10个，混合于少量马丁肉汤中，接种马丁琼脂斜面若干支，置36~37℃培养20~24小时，作为一级种子；

二级种子繁殖：取一级种子接种于马丁肉汤中，36~37℃培养20~24小时，进行纯粹检验，纯粹，获得二级种子液；

（2）制苗用混合菌液的制备

将大肠杆菌菌株ECHB-3、大肠杆菌菌株ECHB-9、大肠杆菌菌株ECHB-40分别培养得到的二级种子液以体积比为1：1：1混合，按培养基量的2%~4%(v/v) 接种于马丁肉汤中，36~37℃培养20~24小时，得到混合菌液；

（3）灭活菌液制备

灭活，得灭活菌液，所述灭活菌液中的活菌总数为30~60亿cfu/mL，后经灭活检验合格后即得。

按上述方案，所述的鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗的制备方法还包括以下后处理步骤：按体积计，以每5份制苗用混合菌液加入1份氢氧化铝胶生理盐水佐剂，然后按加入佐剂后体系总量的0.005wt%加防腐剂硫柳汞，充分振荡，于2~8℃静置2~3日，抽弃上清浓缩成全量的60%(v/v)；然后经无菌检验合格后进行混合分装，分装时随时搅拌使其混合均匀。

按上述方案，所述步骤（1）中的一级种子液置于2~8℃保存，使用期不超过21日；所述的二级种子液置于2~8℃保存，使用期不超过3日。

按上述方案，所述步骤（2）得到混合菌液中鸭大肠杆菌ECHB-3的个数为10~20亿cfu/mL，鸭大肠杆菌ECHB-9的个数为10~20亿cfu/mL，鸭大肠杆菌ECHB-40的个数为10~20亿cfu/mL。

按上述方案，所述步骤（3）的灭活为按体积比为0.4%加入甲醛溶液，经38℃灭活48~72小时，期间每隔4~6小时振摇一次。

上述鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗在鸭大肠杆菌病防治中的应用。

该疫苗的物理性状为：静置后，上层为浅黄色澄明液体，下层为灰白色沉淀物，振摇后为均匀混悬液。

根据《中华人民共和国兽药典（2010年版）》附录42标准，对该疫苗取样经无菌检验合格，应无菌生长。另，分别按《中华人民共和国兽药典（2010年版）》附录20、附录10进行甲醛、硫柳汞含量测定，得：甲醛残留量不超过0.2wt%，硫柳汞残留量不超过0.01wt%。

本发明通过调查湖北省规模化养鸭场，对湖北省鸭大肠杆菌病进行流行病学调查，并对不同地区不同养鸭场采集样品分离了154株鸭大肠杆菌，经培养特性、形态特征、生化特性、血清型鉴定、动物致病性试验和免疫原性试验，筛选出了三株致病性强、免疫原性好的优势血清型菌株鸭大肠杆菌菌株ECHB-3、ECHB-9、ECHB-40用于制备疫苗，制得的鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗经物理性质检验、无菌检验、甲醛、汞类防腐剂残留量测定，检验结果合格。并经安全性、免疫效力试验，证明此疫苗效果较好，疫苗保护力达80％以上，可覆盖湖北大部分地区，预防本地的大肠杆菌病，克服由于血清型众多且无交叉保护带来的预防本病的困难性，以减少本地该病的发生率，减少抗生素的使用量、减少药物残留、保证禽产品安全、促进人类的健康。

本发明具有以下优点：

1、该疫苗经效力试验证明该疫苗保护力强，保护率达80%以上；

2、该疫苗经安全性试验证明：该疫苗安全性高，为该疫苗的临床应用提供了基本保障，并容易吸收，成本低廉，较易被用户接受，易于推广；

3、该疫苗制备用菌株来源于湖北地区免疫性强的优势血清型菌株，可以覆盖湖北大部分地区，针对性强。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。

实施例1

鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗的制备

1、制苗用菌株对湖北省鸭大肠杆菌病进行流行病学调查，对湖北省不同地区分离得到的154株鸭大肠杆菌中，经培养特性、形态特征、生化特性、血清型鉴定、动物致病性试验和免疫原性试验，筛选得到三株致病性强、免疫原性好的优势血清型菌株鸭大肠杆菌菌株ECHB-3、ECHB-9、ECHB-40用于制备疫苗，作为制备疫苗用菌株。

所述各鸭大肠杆菌菌种的分离方法如下：无菌操作取病、死亡鸭肝脏、心脏和气囊直接划线于麦康凯琼脂上，37℃培养24h，观察结果。从其中挑取红色、圆形隆起、光滑的菌落，进行革兰氏染色，镜检，并划线于伊红美蓝琼脂上，观察菌体形态及染色特征。革兰氏染色，镜检可见到革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌，在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落。细菌的纯培养：从麦康凯琼脂上挑取红色、圆形隆起、光滑的菌落在新的麦康凯琼脂上划线，37℃培养24h，再次染色、镜检。若菌体形态和染色特性符合大肠杆菌的形态和染色特性时，挑取剩余的半个菌落接种于麦康凯斜面培养基，37℃培养24h，即为分离纯化细菌。

2、制苗用培养基马丁肉汤：

1000ml溶液：

牛肉汤 500ml

猪胃消化液 500ml

氯化钠 2.5g

具体配制方法如下：

A 将上列成分混合后，以氢氧化钠溶液调整PH为7.6～7.8，煮沸20～40分钟，补足失去的水分。

B 冷却沉淀，抽取上清液，经滤纸或纱布滤过，滤液应为澄清、浅黄色，经116℃灭菌30分钟。

3、制苗用佐剂氢氧化铝胶生理盐水配制按《中华人民共和国兽药典（2010年版）》附录33进行。

4、制备疫苗

（1）一级种子繁殖将各菌株冻干菌种分别接种于马丁肉汤中，36~37℃培养24小时，然后划线接种麦康凯琼脂平板上培养，选取符合标准的典型菌落10个混合于少量马丁肉汤中，接种马丁琼脂斜面若干支、置36~37℃培养20~24小时，作为一级种子。在2~8℃保存，使用期不超过21日。

二级种子繁殖取一级种子接种于马丁肉汤中，36~37℃培养20~24小时，进行纯粹检验，纯粹。置2~8℃保存，使用期不超过3日。

（2）制苗用菌液制备将大肠杆菌菌株ECHB-3、大肠杆菌菌株ECHB-9、大肠杆菌菌株ECHB-40分别培养得到的二级种子液以体积比为1：1：1混合，按培养基量的2%~4%(v/v) 接种于马丁肉汤中，36~37℃培养20~24小时，得到混合菌液。菌液培养完成后取样作纯粹检验，按《中华人民共和国兽药典（2010年版）》附录42进行，应纯粹。进行活菌计数，按《中华人民共和国兽药典（2010年版）》附录19进行，得；每毫升混合菌液中的活菌个数为30~60亿cfu，其中：鸭大肠杆菌ECHB-3的个数为10~20亿cfu/mL，鸭大肠杆菌ECHB-9的个数为10~20亿cfu/mL，鸭大肠杆菌ECHB-40的个数为10~20 亿cfu/mL。

（3）灭活按体积比为0.4%加入甲醛溶液，经38℃灭活48~72小时，期间每隔4~6小时振摇一次，作灭活检验。

（4）浓缩配苗按体积比每5份制苗用菌液加1份氢氧化铝胶生理盐水作佐剂，同时按加入佐剂后体系总量的0.005wt%加硫柳汞做防腐剂，充分振荡，于2~8℃静置2~3日，抽弃上清浓缩成全量的60%（v/v）。

（5）检验分装根据《中华人民共和国兽药典（2010年版）》附录42，取样进行无菌检验，得：无菌检验合格，应无菌生长，后混合分装，分装时随时搅拌使其混合均匀。

成品检验

（1）物理性状本品静置后，上层为浅黄色澄明液体，下层为灰白色沉淀物，振摇后均匀混悬液。

（2）无菌检验按《中华人民共和国兽药典（2010年版）》附录42进行，应无菌生长。

（3）甲醛或硫柳汞含量测定分别按《中华人民共和国兽药典（2010年版）》附录20、附录10进行，甲醛残留量不超过0.2wt%，硫柳汞残留量不超过0.01wt%。

鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗的安全性及免疫效果试验

1. 安全检验：

一次单剂量接种的安全试验：用单剂量颈部皮下、肌肉两种免疫途径接种7日龄雏鸭10只，0.5ml/只，同时设5只不接种雏鸭作对照，观察14日，无不良反应，精神食欲正常，剖检无任何肉眼可见病变。

单剂量重复接种安全试验：每批疫苗用单剂量0.5ml/只颈部皮下、肌肉两种免疫途径接种7日龄雏鸭10只，第1次接种后14日，以相同方法再接种一次，同时设5只不接种雏鸭作对照，观察14日，无不良反应，精神食欲正常，剖检无任何肉眼可见病变。

一次超剂量接种的安全试验：每批疫苗用2倍使用量即1ml/只，颈部皮下、肌肉两种免疫途径接种7日龄雏鸭10只，同时设5只不接种雏鸭作对照，观察14日，无不良反应，精神食欲正常，剖检无任何肉眼可见病变。

这一结果为该疫苗的临床应用提供基本保障。

2、效力试验用2周龄健康易感鸭10只，每只颈部皮下注射疫苗0.5ml，21日后连同条件相同的对照鸭10只，各肌肉或腹腔注射鸭大肠杆菌菌株ECHB-3、ECHB-9、ECHB-40的混合菌液 0.5ml（含活菌2~5亿cfu），所述的混合菌液是将鸭大肠杆菌菌株ECHB-3、鸭大肠杆菌菌株ECHB-9和鸭大肠杆菌菌株ECHB-40分别于马丁肉汤各培养20~24小时得到的菌液混合得到的。观察14日，对照鸭全部发病或死亡，剖检后全部具有典型病变（反应在++以上）；免疫鸭至少保护8只，并且对在观察期内出现“+”以上明显临床反应的存活鸭，在观察结束时进行剖检，内脏无纤维素渗出性炎症。鸭大肠杆菌病攻毒保护率为80％以上。

判定标准：

± 有轻微临床反应，减食、排白色粪便1~3日，内脏无肉眼可见病变。

+ 临床减食4日以上或停食1日以上，排黄白色粪便4日以上，剖检见心脏或肝脏有轻度纤维素渗出性炎症。

++ 临床同（+），可见明显心包积液及纤维素渗出性炎症。

+++ 临床同（+），有严重心包膜炎，并与肝或胸膜发生粘连。

++++ 试验鸭死亡，其他同（+++）。

Claims

1.鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗，其特征在于：它含有鸭大肠杆菌菌株ECHB-3 (Escherichia coli ECHB-3)、鸭大肠杆菌菌株ECHB-9(Escherichia coli ECHB-9)、鸭大肠杆菌菌株ECHB-40 (Escherichia coli ECHB-40)的灭活菌液，所述灭活菌液中的活菌总数为30~60亿cfu/mL；其中：所述的鸭大肠杆菌菌株ECHB-3(Escherichia coli ECHB-3)已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2011438，分类命名为大肠杆菌ECHB-3(Escherichia coli ECHB-3)；所述的鸭大肠杆菌菌株ECHB-9(Escherichia coli ECHB-9)已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2011439，分类命名为大肠杆菌ECHB-9(Escherichia coli ECHB-9)；所述的鸭大肠杆菌菌株ECHB-40(Escherichia coli ECHB-40)已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2011440，分类命名为大肠杆菌ECHB-40(Escherichia coli ECHB-40)。

2.根据权利要求1所述的鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗，其特征在于：所述灭活菌液中鸭大肠杆菌ECHB-3的个数为10~20亿cfu/mL，鸭大肠杆菌ECHB-9的个数为10~20亿cfu/mL，鸭大肠杆菌ECHB-40的个数为10~20亿cfu/mL。

3.根据权利要求1所述的鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗，其特征在于：所述的鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗还包括佐剂和防腐剂。

4.根据权利要求3所述的鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗，其特征在于：所述的佐剂为氢氧化铝胶生理盐水，按体积比计，所述的佐剂量以每5份制苗用混合菌液加入1份进行计量；所述的防腐剂为硫柳汞，所述的防腐剂以加入佐剂后的体系总量的0.005wt%进行计量。

5.鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

（1）疫苗种子液的制备

一级种子繁殖: 各菌株冻干菌种分别接种于马丁肉汤中，36~37℃培养24小时，然后划线接种于麦康凯琼脂平板上培养，选取符合标准的典型菌落10个，混合于少量马丁肉汤中，接种马丁琼脂斜面若干支，置36~37℃培养20~24小时，作为一级种子；

（2）制苗用混合菌液的制备

（3）灭活菌液制备

6.根据权利要求5所述的鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗的制备方法，其特征在于：它还包括后续步骤：按体积计，以每5份制苗用混合菌液加入1份氢氧化铝胶生理盐水佐剂，然后按加入佐剂后体系总量的0.005wt%加防腐剂硫柳汞，充分振荡，于2~8℃静置2~3日，抽弃上清浓缩成全量的60%(v/v)；然后经无菌检验合格后进行混合分装，分装时随时搅拌使其混合均匀。

7.根据权利要求5所述的鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的一级种子液置于2~8℃保存，使用期不超过21日；所述的二级种子液置于2~8℃保存，使用期不超过3日。

8.根据权利要求5所述的鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）的灭活为按体积比为0.4%加入甲醛溶液，经38℃灭活48~72小时，期间每隔4~6小时振摇一次。

9.根据权利要求5所述的鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗的制备方法，其特征在于：所述灭活菌液中鸭大肠杆菌ECHB-3的个数为10~20亿cfu/mL，鸭大肠杆菌ECHB-9的个数为10~20亿cfu/mL，鸭大肠杆菌ECHB-40的个数为10~20亿cfu/mL。

10.根据权利要求1-4所述的鸭大肠杆菌病区域优势血清型疫苗在制备鸭大肠杆菌病防治试剂中的应用。