CN103977414B - 一种冻干抗原活力稳定剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种冻干抗原活力稳定剂及其制备方法。本发明的冻干抗原活力稳定剂与或疫苗配伍后冻干，能够防止冻干过程对于疫苗的损伤，良好地保留活疫苗的抗原活性；同时在疫苗运输过程和到达用户终端的保存、使用过程中在温度发生变化的情况下，能够良好地保留活疫苗的抗原活性。并且，所述的抗原活力稳定剂的配方简单、制备方便、适用范围广。

Description

一种冻干抗原活力稳定剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种冻干抗原活力稳定剂及其制备方法。

背景技术

冷冻干燥技术是生物学的一个重要应用技术，现在已广泛应用于化学、制药工业、食品工业和科学研究等方面，特别是应用于含有生物活性物质的生物药品方面最为普遍。在兽医方面主要用于各种兽用微生物的贮存，各种兽用生物药品的制造，以保持菌、毒种的生物学特性，延长成品的有效期。

在兽用疫苗中，冻干活疫苗占有相当大的比例，由于微生物对温度的变化很敏感，多要求在低温条件下保存，为了延长产品的保存时间、稳定抗原的活性，所以开发出对抗原保护效果好的保护剂或稳定剂在生物制品行业显得尤为重要。国内冻干苗产品目前大多为常规保护剂活疫苗，其保护剂的主要成分为蔗糖、脱脂牛奶和明胶，保护剂的组方简单、配制简便，保护功能差，一般需要在-15℃条件下保存，如果在2～8℃条件下，保存期只有3-6个月，这就要求必须尽快使用，为兽医生物制品的保存、运输、使用等带来诸多困难和不便，而且还造成大量的能源浪费和质量风险。目前国内也有很多关于耐热保护剂的专利发明，这些耐热保护剂产品在2～8℃下可以保存24个月，但是还存在一些问题，有些保护剂的配方成分很复杂、干物质浓度高，不利于冻干，成本高昂，所以很难大范围的推广使用，如中国专利CN1895675A“动物用冻干活疫苗耐热保护免疫增强剂及其制备方法”，成分达十种，种类多、干物质含量高，所需要的冻程长，不利于冷冻干燥,而且部分成分需要过滤除菌(Vc、乳糖、牛血清白蛋白等)，而且需要低温保存，长时间保存会发生化学反应，另一部分又需要高压灭菌(PVP、牛肉蛋白胨等)，不利于规模化；有些配方只针对特定的疫苗CN1168503C(“鸡新城疫弱毒冻干疫苗耐热冻干保护剂及制备工艺”)，只针对单一的新城疫弱毒，对其他病毒的保护效果则大大降低，这也一定程度上限制了其应用推广。

所以，开发出一种配方简单、制备方便、可以用于多重动物疫苗的保护剂或抗原活力稳定剂对生物制品行业来说显得尤为重要，我们的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种冻干抗原活力稳定剂及其制备方法，以解决现有技术的不足。

在本发明的第一方面，提供一种冻干抗原活力稳定剂，按照质量百分比，包括：

在一个优选例中，所述的冻干抗原活力稳定剂包括：由明胶、蔗糖、蛋白胨、海藻糖、谷氨酸钠、山梨醇和聚乙烯吡咯烷酮构成的活性组分，以及余量的水。

在另一优选例中，所述的冻干抗原活力稳定剂中，按照质量百分比，包括：

在另一优选例中，所述的冻干抗原活力稳定剂中，按照质量百分比，包括：

或者，包括：

或者，包括：

或者，包括：

在另一优选例中，所述的冻干抗原活力稳定剂还可以是浓缩形式的或稀释形式的。

在本发明的另一方面，提供所述的冻干抗原活力稳定剂的制备方法，包括：

将明胶、蔗糖、蛋白胨、海藻糖、谷氨酸钠、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮混合均匀，溶于水中。

在一个优选例中，所述方法还包括灭菌的步骤。

在另一优选例中，所述的水是蒸馏水。

在本发明的另一方面，提供所述的冻干抗原活力稳定剂的用途，用于制备冻干的疫苗。

在本发明的另一方面，提供一种制备冻干的疫苗的方法，将所述的冻干抗原活力稳定剂与疫苗混合，冷冻干燥。

在一个优选例中，所述的冻干抗原活力稳定剂与疫苗以冻干抗原活力稳定剂:疫苗＝1:5～5:1的体积比混合。

在另一优选例中，所述的冻干抗原活力稳定剂与疫苗以冻干抗原活力稳定剂:疫苗＝1:3～3:1的体积比混合；更佳地，以1:2～2:1的体积比混合。

在另一优选例中，所述的疫苗是动物疫苗。

在另一优选例中，所述的疫苗选自(但不限于)：鸡新城疫系列活疫苗、传染性法氏囊病活疫苗、猪伪狂犬病活疫苗、猪瘟细胞源活疫苗。

在本发明的另一方面，提供一种疫苗组合物，所述的疫苗组合物包括：所述的冻干抗原活力稳定剂，以及疫苗；所述的疫苗组合物通过将所述的冻干抗原活力稳定剂与疫苗混合、冻干制备获得。

在另一优选例中，所述的冻干抗原活力稳定剂和疫苗以冻干抗原活力稳定剂:疫苗＝1:5～5:1的体积比混合；较佳地，以1:3～3:1的体积比混合；更佳地，以1:2～2:1的体积比混合。

在本发明的另一方面，提供一种用于制备冻干抗原活力稳定剂的混合物，包括：

在另一优选例中，所述的用于制备冻干抗原活力稳定剂的混合物包括：

在另一优选例中，所述的用于制备冻干抗原活力稳定剂的混合物在与水混合后，制备获得所述的用于制备冻干抗原活力稳定剂。

在本发明的另一方面，提供一种用于动物免疫的药盒，所述的药盒包括：

所述的疫苗组合物，以及

说明动物免疫方法的使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，开发了一种新的抗原活力稳定剂，其与或疫苗配伍后冻干，能够防止冻干过程对于疫苗的损伤，良好地保留活疫苗的抗原活性。并且，所述的抗原活力稳定剂的配方简单、制备方便、适用范围广。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，“重量份”或“重量份数”可互换使用，所述的重量份可以是任何一个固定的以毫克、克数或千克数表示重量(如1mg、1g、2g、5g、或1kg等)。例如，一个由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物，可以是1克组分a+9克组分b，也可以是10克组分a+90克组分b等构成的组合物。在所述组合物，某一组分的百分比含量＝(该组分的重量份数/所有组分的重量份数之和)×100％。因此，由1重量份组分a和9重量份组分b构成的组合物中，组分a的含量为10％，组分b为90％。

如本文所用，术语“有效量”是指可对动物产生功能或活性的且可被动物所接受的量。

抗原活力稳定剂

本发明人通过大量的实验，首先确定了原料的选取，再经过大量的实验确定各原料组分的含量和配比，从而获得了改进的抗原活力稳定剂。作为本发明的优选方式，用于配制本发明的抗原活力稳定剂的各组分的用量如表1所示。

表1

本发明提供的抗原活力稳定剂配方中，明胶能防止冻干过程中有效物质随水蒸气一起升华飞散，主要起骨架支撑作用；蔗糖、PVP(K30)主要在冻干的过程中起到对产品的有效保护，保证产品冻干过程中活力的稳定，其它物质则可以把活的病毒调整到其活性最稳定的区域；在产品的长期储存和对高温的耐受上给抗原活力提供更为可靠的保护。

所述的冻干抗原活力稳定剂中，除了由明胶、蔗糖、蛋白胨、海藻糖、谷氨酸钠、山梨醇和聚乙烯吡咯烷酮构成的活性组分以外，还可包括其它的次要成分，例如一些常规的辅助成分或赋形剂，更具体地例如pH调节剂、防腐剂等等。应理解，这些都是在生物制品领域所常规应用的。

上述配方的组分被溶于水中，从而制备成本发明的具有抗原活力保护作用的抗原活力稳定剂。较佳地，将上述各组分溶于蒸馏水中混合均匀，灭菌即得。灭菌可以采用本领域技术人员熟知的方法，例如高压蒸汽灭菌。

本发明制备的抗原活力稳定剂配方简单、制备方便、保护效果优良，而且适用于多种动物疫苗，无毒无副作用，在使用过程中对环境无污染，是优良的抗原活力稳定剂。该稳定剂保护下的活疫苗在37℃条件下放置10天，仍保持冻干后的外形，病毒含量测定仍高于《中华人民共和国兽医生物制品质量标准》的标准，下降不超过1个滴度，其对抗原的保护作用远远优于传统的牛奶蔗糖保护剂，对37℃的高温挑战实验也达到了耐热保护剂的要求(一般产品37℃条件下放置10天，下降不超过1个滴度)，而且适用于多种动物疫苗，所以说具有重要的经济价值。

本发明是一种配制简单方便、高效广谱的生物制品，适用于多种动物疫苗，为兽医生物制品的使用解决了长久以来储存运输的高能耗成本问题以及储存不当造成的产品质量等下降问题，具有重大的经济价值。

以往的疫苗保护剂往往成分复杂，干物质含量高，所需要的冻程长，不利于冷冻干燥，而且制备时操作复杂；而本发明的疫苗保护剂，成分只有7种，便于配制、只需要高压灭菌即可使用，而且可以在常温长时间保存，冻干时间短、冻型美观大方。

混合物

本发明也包括主要由明胶、蔗糖、蛋白胨、海藻糖、谷氨酸钠、山梨醇和聚乙烯吡咯烷酮按照表1所述的配比构成的混合物。为了便于储存，将各个组分按照配比混合后，形成固体混合物，易于储存和运输，在需要的时候，再将混合物与水混合、溶于水中，制成所述的抗原活力稳定剂。

本发明也包括将所述的混合物溶于少量的水中，制成的抗原活力稳定剂的浓缩制剂，以易于储存和运输。在需要的时候，将该浓缩制剂进行稀释。

疫苗组合物

本发明的抗原活力稳定剂可通过与疫苗进行混合、冻干，制成疫苗组合物，所述的疫苗组合物能够保留较好的抗原活力。因此，本发明也包括一种疫苗组合物，包括：所述的冻干抗原活力稳定剂；以及疫苗。

本发明的抗原活力稳定剂发挥的作用是在冻干过程中防止疫苗活性受到损害，为疫苗提供支架和保护，因此，其可适用于多种种类的疫苗的冻干制备。作为本发明的优选方式，本发明的抗原活力稳定剂适用于制备冻干的鸡新城疫系列活疫苗、鸡痘活疫苗、鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)、猪瘟细胞源活疫苗、伪狂犬活疫苗。

本发明抗原活力稳定剂的使用方法是将本发明的抗原活力稳定剂与疫苗(较佳地为动物疫苗)进行混合，配苗。较佳地，所述的冻干抗原活力稳定剂和疫苗以冻干抗原活力稳定剂:疫苗＝1:5～5:1的体积比混合；更佳地，以1:3～3:1的体积比混合；更佳地，以1:2～2:1的体积比混合。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1、鸡新城疫病毒抗原活力保护

一、实验材料鸡新城疫病毒抗原(Mukteswar株，I系)购自中国兽医药品监察所；SPF鸡胚，由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

二、抗原活力稳定剂的制备

按照下述质量百分比的各组分：明胶：1.5％、蔗糖：3.5％、蛋白胨：1.0％、海藻糖：0.5％、山梨醇：1.5％、谷氨酸钠：1.5％、PVP(K30)：4.0％，剩余成分为蒸馏水。配制方法为将上述比例的干物质溶于蒸馏水中，经高压蒸汽灭菌即得到抗原活力稳定剂。

三、保护剂的毒性试验

用7日龄健康雏鸡10只，分别进行滴鼻、点眼、饮水及皮下注射10倍使用剂量(10μl)，观察20天，雏鸡全部健活，且无任何不良反应。

四、疫苗的制备

1、新城疫抗原活力稳定剂疫苗的制备

将新城疫抗原在SPF鸡胚上繁殖，收获病毒液后，按照1:1的体积比与抗原活力稳定剂混合均匀，分装后进行冷冻干燥。同时设5％(w/v)的蔗糖脱脂乳保护剂作为对照。疫苗置-15℃条件下保存，同时部分疫苗置37℃保存10天。

五、疫苗检验

按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)(以下简称《规程》)第437-452页中记载，对上述新城疫抗原活力稳定剂活疫苗进行检验，包括：

1、产品的物理性状

液体苗为淡黄色的澄明液体，冻干苗为白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

2、无菌检验

按照《规程》进行，应无细菌生长；如有细菌生长，应作杂菌计数，并作病原性鉴定和禽沙门氏菌检验，应符合规定。每羽份的非病原菌应不超过1个。

3、支原体检验

按照《规程》进行检验，应无支原体生长。

4、外源病毒检验

按照《规程》进行检验，应无外源病毒污染。

5、鉴别检验

将疫苗用生理盐水作适当稀释(至10³ELD₅₀/0.1ml)，与等量抗鸡新城疫病毒特异性血清混合，室温中和1小时后，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10枚，观察120小时，在24～120小时内不引起特异死亡及鸡胚病变，且至少存活8枚，对鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性。

6、安全检验

用2～8月龄健康易感鸡4只，每只肌肉注射10个使用剂量(10μl)的疫苗，观察10～14日，允许有轻反应，但须在14日内恢复，疫苗判为合格。如有1只鸡出现腿麻痹，不能恢复时，允许用8只鸡重检1次，重检结果如有1只鸡出现上述同样反应，疫苗应判为不合格。

7、半成品病毒含量测定及成品效力检验

半成品病毒含量测定：每组分别取样，等量混合，以灭菌生理盐水稀释至10^-6～10^-8，各接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚尿囊腔内接种0.1ml。记录鸡胚在24～72小时死亡、胎儿有明显病痕者，计算ELD₅₀，每0.1ml病毒含量≥10^6.5ELD₅₀。

成品效力检验用鸡胚检验：按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水稀释至1羽份/0.1m1，再作10倍系列稀释，取3个适宜的稀释度如10^-4、10^-5、10^-6各尿囊腔内接种10日龄SPF或无鸡新城疫抗体的鸡胚5个，每胚0.1ml，置37℃继续孵育，观察24～72小时，记录鸡胚死亡情况，死亡胎儿应有明显病痕。同一稀释度的死胚胚液等量混合，测定血凝价，(1:80)～(1:640)[微量法(1:64)～(1:512)]判为感染，计算ELD₅₀，每羽份应≥10⁵ELD₅₀。

8、剩余水分测定按照《规程》进行检验，应符合规定。

9、真空度测定按照《规程》进行，应符合规定。

根据上述标准，对前述制备的新城疫抗原活力稳定剂活疫苗进行检验，检验结果见表2。

表2、新城疫疫苗检验结果

由表2结果可知，本发明制备的抗原活力稳定剂应用于新城疫(I系)中等毒力活疫苗后，将疫苗放置37℃10天，病毒含量下降比较少，病毒含量仍超过《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》的标准，而对照组抗原滴度下降的非常明显，可见本发明抗原活力稳定剂对抗原的活力保护效果明显优于传统的5％(w/v)蔗糖脱脂乳，说明对该病毒有明显的活力稳定作用。

实施例2、鸡传染性法氏囊病病毒中等毒力B87株活力保护

一、实验材料鸡传染性法氏囊病病毒中等毒力B87株购自中国兽医药品监察所；SPF鸡胚，由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

二、抗原活力稳定剂的制备

按照下述质量百分比的各组分：明胶：1.0％、蔗糖：3.0％、蛋白胨：2.0％、山梨醇：0.5％、海藻糖：0.5％、谷氨酸钠：2.0％、PVP(K30)：1.0％，剩余成分为蒸馏水。配制方法为将上述比例的干物质溶于蒸馏水中，经高压蒸汽灭菌即得到抗原活力稳定剂。

三、保护剂的毒性试验

用7日龄健康雏鸡10只，分别进行滴鼻、点眼、饮水及皮下注射10倍使用剂量(10μl)，观察20天，雏鸡全部健活，且无任何不良反应。

四、疫苗的制备

1、传染性法氏囊病抗原活力稳定剂疫苗的制备

将传染性法氏囊病病毒中等毒力B87株在SPF鸡胚上繁殖后，收获鸡胚磨碎，按照1:1的体积比与抗原活力稳定剂混合均匀，分装后进行冷冻干燥。同时设5％(w/v)的蔗糖脱脂乳保护剂作为对照。疫苗置-15℃条件下保存，同时部分疫苗置37℃保存10天。

五、疫苗检验

按照《规程》第437-452页中记载，对上述传染性法氏囊病中等毒力活疫苗(B87株)进行检验，包括：

1、产品的物理性状

冻干苗为微红色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

2、无菌检验

按照《规程》进行，应无细菌生长；如有细菌生长，应作杂菌计数，并作病原性鉴定和禽沙门氏菌检验，应符合规定。每羽份的非病原菌应不超过1个。

3、支原体检验

按照《规程》进行检验，应无支原体生长。

4、外源病毒检验

按照《规程》进行检验，应无外源病毒污染。

5、鉴别检验

将疫苗用灭菌生理盐水稀释至10^3.0ELD₅₀/0.1ml，与等量抗鸡传染性法氏囊病特异性血清混合，经室温或37℃中和60分钟后，以绒毛尿囊膜途径接种10～12日龄SPF鸡胚5个，每胚接种0.2ml；同时设病毒对照5个，每胚接种病毒液0.1ml含10^3.0ELD₅₀/0.1m1，同条件培养观察168小时。中和组鸡胚应全部健活，对照组鸡胚应3/5以上死亡，鸡胚尿液对鸡红细胞凝集试验(HA)阴性。

6、安全检验

用7～14日龄易感雏鸡20只，其中10只，每只点眼或口服10个使用剂量的疫苗，另10只不接种作对照，两组分别饲养。观察14日，均应健活。试验结束后，剖检免疫组和对照组鸡，法氏囊应无明显变化(色泽、弹性及大小等)，如有非特异性死亡，两组总和不应超过3只，且免疫组死亡数应不超过对照组。

7、半成品病毒含量测定或成品效力检验

将疫苗用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，以绒毛尿囊膜途径接种10～12日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，观察168小时，计算ELD₅₀，半成品每0.2m1病毒含量应>10^5.5ELD₅₀，成品每羽份病毒含量应>1000ELD₅₀。

8、剩余水分测定

按照《规程》进行检验，应符合规定。

9、真空度测定

按照《规程》进行，应符合规定。

根据上述标准，对前述制备的传染性法氏囊病活疫苗(B87株)进行检验，检验结果见表3。

表3、传染性法氏囊病活疫苗(B87株)检验结果

由表3结果可知，本发明制备的抗原活力稳定剂应用于鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗后，将疫苗放置37℃10天，病毒含量下降比较少，病毒含量仍超过《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》的标准，而对照组抗原滴度下降明显高于实验组。说明我们的稳定剂对于抗原对高温的耐受较传统的保护剂有明显的优势。

实施例3、猪瘟兔化弱毒株活力保护

一、实验材料

猪瘟兔化弱毒株购自中国兽医药品监察所；犊牛睾丸细胞(从新鲜的牛睾丸分离制备)。

二、抗原活力稳定剂的制备

按照下述质量百分比的各组分：明胶：1.2％、蔗糖：4.0％、山梨醇：1.5％、海藻糖：2.0％、蛋白胨：1.5％、谷氨酸钠：1.0％、PVP(K30)：3.0％，剩余成分为蒸馏水。配制方法为将上述比例的干物质溶于蒸馏水中，经高压蒸汽灭菌即得到抗原活力稳定剂。

三、保护剂的毒性试验

用无猪瘟母源抗体的健康断奶猪2头，每头肌注5ml含50倍使用剂量(0.1ml/头份)的抗原活力稳定剂，观察14日，所有猪应健活，不出现任何不良反应。用兔两只，耳静脉注射1ml含10倍使用剂量(0.1ml/头份)的抗原活力稳定剂，均不应出现任何不良反应。

四、疫苗的制备

1、猪瘟抗原活力稳定剂疫苗的制备

将猪瘟病毒在犊牛睾丸细胞上繁殖，收获病毒液后，按照1:1的体积比与抗原活力稳定剂混合均匀，分装后进行冷冻干燥。同时设5％(w/v)的蔗糖脱脂乳保护剂作为对照。疫苗置-15℃条件下保存，同时部分疫苗置37℃保存10天。

五、疫苗检验

按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)(以下简称《规程》)第437-452页中记载，对上述猪瘟抗原活力稳定剂活疫苗进行检验，包括：

1、产品的物理性状

液体苗为淡黄色的澄明液体；冻干苗为微黄色，海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

2、无菌检验

按照《规程》进行，应无细菌生长。

3、支原体检验

按照《规程》进行检验，应无支原体生长。

4、外源病毒检验

按照《规程》进行检验，应无外源病毒污染。

5、鉴别检验

将疫苗用灭菌生理盐水稀释成为每l ml含有100个兔的最小感染量(≤10^-5/ml)的病毒悬液，与等量的抗猪瘟病毒特异性血清充分混合，置10～15℃中和l小时，其间振摇2～3次。同时设立阳性对照组(病毒对照)和阴性对照组(生理盐水)。中和结束后，分别接种家兔2只，每兔耳静脉注射lml，测温方法及体温反应标准同效力检验项。除阳性对照组应出现热反应外，其余两组在接种后120小时内不引起热反应。

6、安全检验

按瓶签注明的头份用灭菌生理盐水稀释成每lml含5头份疫苗，皮下注射体重18～22g小白鼠5只，各0.2m1；肌肉注射体重350～400g豚鼠2只，各1m1。观察10日，应全部健活。

选用符合国家实验动物标准的饲养场或定点猪场供应，并经中和试验方法(见附注)检测无猪瘟抗体的健康易感断奶猪(注苗前观察5～7日，每日上下午各测体温一次。挑选体温、精神、食欲正常者使用)。每批冻干疫苗样品或同批各亚批样品等量混合，按瓶签注明的头份用灭菌生理盐水稀释成每lml含6头份疫苗，肌肉注射猪4头，每头5m1(含30个使用剂量)。注苗后，每日上下午各测体温观察一次，观察21日。体温、精神、食欲与注苗前相比没有明显变化；或体温升高超过0.5℃，但不超过1℃，稽留不超过2日；或减食不超过1日，疫苗可判为合格。如有1头猪体温超过常温l℃以上，但不超过1.5℃，稽留不超过两个温次，疫苗也可判为合格。如有1头猪的反应超过上述标准；或出现可疑的其他体温反应和其他异常现象时，可用4头猪重检1次。重检的猪仍出现同样反应，疫苗应判为不合格。也可在猪高温期采血复归猪2头，每头肌肉注射可疑猪原血5m1，测温观察16日。如均无反应，疫苗可判合格。如第一次检验结果已经确证疫苗不安全，则不应进行重检。

7、效力检验

用家兔效检按瓶签注明头份用无菌生理盐水将每头份疫苗稀释3000倍和7500倍，接种体重1.5～3.0kg家兔2只，每只兔耳静脉注射1m1。家兔接种后，上下午各测体温一次，48小时后，每隔6小时测体温一次，根据体温反应和攻毒结果进行综合判定。

家兔接种疫苗后，体温反应标准如下；

定型热反应(++)潜伏期48～96小时，体温上升呈明显曲线，至少有3个温次超过常温l℃以上，并稽留18～36小时。如稽留42小时以上，必须攻毒，攻毒后无反应可判为定型热。轻热反应(+)潜伏期48～96小时，体温上升呈明显曲线，至少有2个温次超过常温0.5℃以上，并稽留12～36小时。

可疑反应(±)潜伏期48～96小时，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时；或潜伏期在24小时以上，不足48小时及超过96小时至120小时出现热反应。

体温反应呈二次高峰，有一次高峰符合定型热反应(++)或轻热反应(+)标准者，均须攻毒。攻毒后无反应时，该兔热反应可判为定型热或轻热反应。

无反应(-)体温正常。

结果判定注苗后，当2只家兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)、另1只免呈轻热反应(+)时，疫苗判为合格。

注苗后，当1只家兔呈定型热反应(++)或轻热反应(+)，另1只兔呈可疑反应(±)；2只兔均呈轻热反应(+)时，可在注苗后7～10日攻毒(接种新鲜脾淋毒或冻干毒)。攻毒时，加对照免2只，攻毒剂量为50～100倍乳剂。每兔耳静脉注射lml。

攻毒后的体温反应标准如下：

热反应(+)潜伏期24～72小时，体温上升呈明显曲线，超过常温1℃以上，稽留12～36小时。

可疑反应(±)潜伏期不到24小时或72小时以上，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时或超过36小时而不下降。

无反应(-)体温正常。

攻毒后，当2只对照兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)，另1只免呈轻热反应(+)，而2只注苗免均无反应(-)，疫苗判合格。

注苗后，如有1只免呈定型热(++)或轻热反应(+)，另1只兔呈可疑反应(i)或无热反应(-)，可对可疑反应免或无反应免采用剖杀或采心血分离病毒的方法，判明是否隐性感染；或注苗后，2只免均呈轻热反应，亦可对其中1只兔分离病毒。方法是：接种疫苗后96～120小时之间，将兔剖杀，采取脾脏，用生理盐水制成50倍稀释乳剂(脾乳剂应无菌)，或采取心血(全血)，接种2只家兔，每只兔耳静脉注射lml。凡有1只兔潜伏期24～72小时出现定型热反应(++)，疫苗可判为合格。

注苗后，出现其他反应情况无法判定时，可重检。用家兔做效检，不应超过3次。

8、剩余水分测定按照《规程》进行检验，采用真空烘干法，应不超过4％。

9、真空度测定按照《规程》进行，应符合规定。

根据上述标准，对前述制备的猪瘟活疫苗进行检验，检验结果见表4。

表4、猪瘟活疫苗检验结果

其中，3000倍，7500倍指疫苗的稀释倍数，疫苗用灭菌生理盐水稀释3000倍和7500倍后分别接种2只家兔，每只1ml。

由表4结果可以看出，本发明制备的抗原活力稳定剂应用于猪瘟细胞源活疫苗后，将疫苗放置37℃10天，病毒含量下降也不是很明显，病毒含量仍能超过《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》的标准，可见本发明的抗原活力稳定剂的保护效果要明显优于传统的5％(w/v)蔗糖脱脂乳保护剂的保护效果，对猪瘟抗原的活性具有明显的稳定作用。

实施例4、伪狂犬病病毒Bartha-K61弱毒株活力保护

一、实验材料

伪狂犬病病毒Bartha-K61弱毒株购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；SPF鸡胚，由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

二、抗原活力稳定剂的制备

按照下述质量百分比的各组分：明胶：2.0％、蔗糖：5.0％、蛋白胨：3.0％、山梨醇：1.0％、谷氨酸钠：1.0％、海藻糖：1.0％、PVP(K30)：2.0％，剩余成分为蒸馏水。配制方法为将上述比例的干物质溶于蒸馏水中，经高压蒸汽灭菌即得到抗原活力稳定剂。

三、保护剂的毒性试验

用7日龄健康仔猪2头，分别肌肉注射10倍抗原活力稳定剂使用剂量(0.1ml/头份)，观察20天，应无任何不良反应。用兔1.5kg的家兔2只，耳静脉注射10倍抗原活力稳定剂使用剂量(0.1ml/头份)，观察应无任何不良反应。

四、疫苗的制备

1、伪狂犬病病毒Bartha-K61弱毒株抗原活力稳定剂疫苗的制备

制备鸡胚成纤维细胞后，按一定的比例接入病毒液，培养一定的时间后收获病毒液，配苗时按照1:1的体积比与抗原活力稳定剂混合均匀，分装后进行冷冻干燥。同时设5％(w/v)的蔗糖脱脂乳保护剂作为对照。疫苗置-15℃条件下保存，同时部分疫苗置37℃保存10天。

五、疫苗检验

按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000年版)(以下简称《规程》)第437-452页中记载，对上述伪狂犬病病毒Bartha-K61弱毒株抗原活力稳定剂活疫苗进行检验，包括：

1、产品的物理性状

液体苗为淡黄色的澄明液体，冻干苗为微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

2、无菌检验

按照《规程》进行，应无细菌生长。

3、支原体检验

按照《规程》进行检验，应无支原体生长。

4、外源病毒检验

按照《规程》进行检验，应无外源病毒污染。

5、安全检验

按瓶签注明头份用PBS稀释为每5ml含14头份，肌肉注射6～18月龄无伪狂犬病病毒中和抗体的绵羊2头，每头5ml，观察14日，应无临床反应。

6、病毒含量测定

成品按瓶签注明头份用PBS(半成品按含毒组织量用乳汉液)做10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度各接种鸡胚成纤维细胞4小瓶，每瓶0.1ml，补充维持液0.9ml，使之总量为lml。观察细胞病变(CPE)，计算TCID₅₀，半成品每0.1ml病毒含量应≥10⁵TCID₅₀，成品每头份病毒含量应≥5000TCID₅₀。

7、剩余水分测定按照《规程》进行检验，应符合规定。

8、真空度测定按照《规程》进行，应符合规定。

根据上述标准，对前述制备的伪狂犬病活疫苗进行检验，检验结果见表5。

表5、伪狂犬活疫苗检验结果

由表5结果可以看出，本发明制备的抗原活力稳定剂应用于伪狂犬活疫苗后，将疫苗放置37℃10天，病毒含量下降也不是很明显，病毒含量仍远超过《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》的标准，可见本发明的抗原活力稳定剂对伪狂犬病毒的保护效果无论是从冻干过程还是从对高温的耐受过程都要明显优于传统的5％(w/v)蔗糖脱脂乳保护剂的保护效果，对伪狂犬病毒的活性具有明显的稳定保护作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种冻干抗原活力稳定剂，其特征在于，按照质量百分比，包括：

2.如权利要求1所述的冻干抗原活力稳定剂，其特征在于，按照质量百分比，包括：

3.如权利要求2所述的冻干抗原活力稳定剂，其特征在于，按照质量百分比，包括：

或者，包括：

或者，包括：

或者，包括：

4.权利要求1-3任一所述的冻干抗原活力稳定剂的制备方法，其特征在于，包括：

将明胶、蔗糖、蛋白胨、海藻糖、谷氨酸钠、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮混合均匀，溶于水中。

5.权利要求1-3任一所述的冻干抗原活力稳定剂的用途，其特征在于，用于制备冻干的疫苗。

6.一种制备冻干的疫苗的方法，其特征在于，将权利要求1-3任一所述的冻干抗原活力稳定剂与疫苗混合，冷冻干燥。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的冻干抗原活力稳定剂与疫苗以冻干抗原活力稳定剂:疫苗＝1:5～5:1的体积比混合。

8.一种用于制备冻干抗原活力稳定剂的混合物，其特征在于，包括：

9.如权利要求8所述的用于制备冻干抗原活力稳定剂的混合物，其特征在于，包括：

10.一种用于动物免疫的药盒，其特征在于，所述的药盒包括：

权利要求8所述的用于制备冻干抗原活力稳定剂的混合物，以及说明动物免疫方法的使用说明书。