CN106822888B - 小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗及其制备方法。本发明采用小反刍兽疫病毒PPRV 75/1‑Clone 9株(CGMCC No.13388)和山羊痘病毒温度敏感弱毒株(CVCC No.AV41)作为疫苗生产毒株分别在Vero细胞和山羊肾原代(次代)细胞培养收获的病毒液混合后加入冻干保护剂经真空冷冻干燥制备成有效地预防小反刍兽疫和山羊痘的二联活疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
背景技术
小反刍兽疫和山羊痘是山羊的两种传染性疫病。
小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)也称为小反刍兽伪牛瘟、卡他、肺肠炎以及口肺肠炎综合症,是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants,PPRV)引起的小反刍兽一种急性传染病。联合国粮农组织(FAO)和国际兽医局(OIE)都将此病列为A类烈性传染病,在我国该病也被列为一类动物传染病。
1942年,世界上首次在西非的科特迪瓦报道发生小反刍兽疫。随后的几年里,在尼日利亚、塞尔维亚和加纳等非洲国家都报道发生此病。近几年来,小反刍兽疫又有进一步蔓延发展的趋势,并且流行形势日益严峻。到目前为止,中非、东非、西亚以及南亚的许多国家都报道发生过小反刍兽疫。世界各国对此病都予以高度重视,美国、韩国、印度等国家都在积极进行相关方面的研究工作。我国在2007年7月首次在西藏阿里地区报道发生小反刍兽疫,给我国的养羊业造成了重大的损失。
PPRV主要感染山羊和绵羊等小反刍兽,但是不同品种的羊敏感性有显著差别。山羊比绵羊更易感,其中欧洲品系的山羊更为易感。幼龄动物易感性较高,但是哺乳期的动物抵抗力较强。PPR一般多发生在雨季以及干燥寒冷的季节。山羊的发病率可以达到100%,死亡率在20%-90%不等,严重爆发时死亡率也能够达到100%。耐过动物经过一段时间可以恢复健康。
研究表明,山羊在感染PPRV后的四年时仍能够检测到抗体。防制PPR的主要措施就是进行疫苗免疫接种。由于PPRV和牛瘟病毒(Rinderpest virus,RPV)之间的抗原相关性很强,可用RPV组织培养的牛瘟活疫苗对绵羊、山羊进行免疫,并获得了很好的免疫保护效果,但是这种疫苗不利于在全球牛瘟消灭计划的实施,主要在非洲一些少数国家和地区有所使用。目前OIE在发生小反刍兽疫的国家和地区推荐使用的疫苗是PPRV 75/1株的生产的弱毒活疫苗。有研究人员还利用基因反向遗传技术研究成功PPRV/RPV的嵌合体疫苗,即利用PPRV的糖蛋白基因取代RPV表面的相应糖蛋白基因。利用这种方法构建的疫苗,对PPRV能够产生良好的免疫原性。此外,G.Berhe等将小反刍兽疫的F基因克隆到山羊痘病毒中构建了基因重组疫苗,能够抵抗小反刍兽疫强毒的感染,但是还没有应用到临床生产实践中。
小反刍兽疫活疫苗是由1975年从尼日利亚分离到的PPRV 75/1株病毒接种Vero细胞并连续传代达70代以后致弱获得的疫苗毒株。目前OIE参考实验室已经传代至120代,病毒仍然保持一定的免疫保护力。毒株在细胞上繁殖以后以冻干的形式-20℃条件下保存。
山羊痘(Goat pox)是由山羊痘病毒(Goat pox virus)引起的山羊的一种高度接触性传染病。临床特征与绵羊痘相似。主要表现为皮肤和粘膜上出现疱疹,进而形成痘肿,并渐进发展为化脓,结痂和引起全身痘及全身性反应。但临床上也有痘肿不经化脓过程的,即所谓“石痘”。重症患羊多出现内脏器官病变和死亡。本病在地中海地区,非洲、和亚洲的一些国家,以及中、近东一带均有发生。也偶见欧洲部分地区和澳大利亚。呈散发或地方性流行。其病状和死亡率,因毒株及宿主不同而有差异。有报告称土耳其的死亡率为3%~40%(Chefik);摩洛哥的死亡率为5%~70%(Grimpret)等。
本病在我国五十年代,仅见三北地区(西北、华北、东北)流行。但最近几年,南方数省、区亦有发生。山羊痘在我国的发病率可高达37.59%(陕西榆林地区,1985)。死亡率多在3%(青海省,1953年)~15.13%(陕西榆林地区,1985)之间。山羊痘严重影响了我国养羊业和制革工业的发展。
山羊痘病毒为双股DNA病毒,属豆病毒科,山羊痘病毒属成员。该病毒嗜上皮性,没有血清型的区别。病毒容易在羔羊及犊牛的睾丸细胞和肾细胞上生长、繁殖,并致明显的细胞病变(CPE)。病毒也可在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上繁殖,但继代时要与羊体交替进行。否则,继代的代数有限。
中国兽医药品监察所王绍华、江焕贤等用青海株山羊痘弱毒免疫绵羊,免后8天即可抵抗10000个感染量的绵羊痘强毒攻击,与AL-Bana等多数学者的试验结果相同。
山羊痘疫苗有灭活疫苗和弱毒活疫苗两类。前者,是国外至今广为使用的疫苗。后者,是我国1984年以来使用的疫苗。
目前市场上已有小反刍兽疫活疫苗和山羊痘活疫苗,需要多次分别注射,使用不方便,而多联疫苗虽然使用比较方便,但疫苗各免疫抗原成分之间往往会产生干扰作用。因此在制备小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗时,应保证两者不产生免疫干扰现象,即不降低各自的免疫效果。
发明内容
本发明目的在于制备出小反刍兽疫、羊痘抗原二者之间无相互干扰,相容性好的小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗。
本发明技术方案
1.一种小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗,其特征在于所述活疫苗含有小反刍兽疫病毒弱毒株活病毒(Peste des petits ruminants,PPRV)和山羊痘病毒(Goat pox virus)弱毒株活病毒,可同时预防小反刍兽疫和山羊痘。
2.本发明所述小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗,其特征在于:所述小反刍兽疫病毒弱毒株活病毒为小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants)PPRV 75/1-Clone 9株,该株病毒已于2016年12月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No.13388。
3.本发明所述的如权利要求1所述小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗,其特征在于所述山羊痘病毒弱毒株活病毒为山羊痘病毒(Goat pox virus)温度敏感弱毒株,保藏编号为:CVCC No.AV41。
4.本发明所述小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗的制备方法,其特征在于用所述小反刍兽疫病毒75/1Clone9株(CGMCC No.13388)和山羊痘病毒温度敏感弱毒株(AV41)病毒作为疫苗生产毒株,分别接种Vero细胞和山羊肾细胞单层,当细胞出现细胞病变达70%以上时,将细胞瓶移至-20℃反复冻融3次,分别收获病毒液;再将其混合后加冻干保护剂经真空干燥制成小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗。
5.本发明所述小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗的制备方法,其特征在于其中的冻干保护剂配方及制备方法是(W/V):蔗糖0.75,右旋糖苷0.40,山梨醇0.40,鱼明胶0.25,Na2HPO4 0.051,NaH2PO4 0.125,加少量双蒸水溶解,1mol KOH调pH至7.2,双蒸水补至100%,115℃高压灭菌30min。
具体实施方式
1.小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗的制备
(1)生产用毒种小反刍兽疫病毒75/1-Clone 9株(CGMCC No.13388)生产用基础种毒和山羊痘病毒温度敏感弱毒株(CVCC AV41)生产用基础种毒,均由中国兽医药品监察所制备并提供。
(2)生产用细胞Vero细胞:中国兽医药品监察所保存(CVCC CL 28);山羊肾原代(次代)细胞:用新鲜山羊肾脏制备,中国兽医药品监察所制备并提供。
(3)小反刍兽疫病毒液的制备将PPRV 75/1-Clone 9株毒种用无血清MEM水化后,按0.1%、0.5%、1%、2%同步接种不同细胞浓度的Vero细胞悬液,细胞悬液浓度分别调整为20~30万/ml、50~60万/ml。混匀后分别分装细胞瓶,置37℃培养箱培养,每天观察细胞病变,记录出现70%以上病变的时间,病变达到70%以上时,将细胞瓶移至-20℃反复冻融3次,收获病毒液。
(4)山羊痘病毒液制备将山羊痘毒种用无血清MEM培养液水化后,按细胞维持液总量0.1%、0.5%、1%、2%的比例接种山羊肾细胞单层,接种时间分别为山羊肾细胞单层铺满程度为80%、100%,接种后置37℃培养箱培养,每天观察细胞病变,记录出现70%以上病变的时间,病变达到70%以上时,将细胞瓶移至-20℃冻融3次,收获病毒液,取样测定病毒含量,按Reed-Muench法计算每0.1ml的TCID50。
(5)病毒液检验分别提取两种进行病毒液样品进行无菌检验、支原体检验和病毒含量测定。
1)无菌检验及支原体检验按现行《中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典》二〇一五年版(三部)中国农业出版社,2016,本发明以下称《中国兽药典》)进行检验。
2)病毒含量测定将收获的病毒液样品用无血清MEM作10倍系列稀释,取10-1~10- 88个稀释度病毒液,接种96孔细胞培养板,每个稀释度接种5孔,每孔0.1ml,接种后每孔加入0.1ml山羊肾细胞悬液。置37℃5%CO2培养箱培养5~7天,根据细胞病变孔数按Reed-Muench法计算TCID50。
(6)配苗与冻干将检验合格的PPR病毒液、山羊痘病毒液与保护剂按(V/V)1:1:2混合后充分混匀、分装后,装箱后按本发明设计的冻干曲线冻干经真空冷冻干燥而成。
2.疫苗成品检验
(1)性状淡黄色海绵状疏松团块,易与瓶壁脱离,加稀释液后迅速溶解。
(2)无菌检验按《中国兽药典》规定方法进行检验,应无菌生长。
(3)支原体检验按《中国兽药典》规定方法进行检验,应无支原体生长。
(4)外源病毒检验按《中国兽药典》规定方法进行检验,应无外源病毒污染。
(5)病毒含量测定PPRV病毒含量规定为不低于103TCID50/头份;羊痘病毒含量应不低于103.5TCID50/头份。
(6)安全检验
1)非特异性安全试验
将小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗用无血清MEM细胞营养液稀释成每毫升含10头份,接种体重为200~250g豚鼠,其中肌肉注射2只,每只0.5ml;腹腔注射2只,每只0.5ml;2只不接种作为对照。观察14日,所有动物均健活。接种体重为18~22g小鼠,经腹腔注射6只,每只0.1ml;另设4只不接种对照。观察14日,所有动物均健活。表明该疫苗安全性良好。
2)特异性安全试验
用4头份小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗经胸腹部皮内接种1~12月龄左右健康易感山羊和绵羊,除个别动物体温出现一过性升高外,未见其他异常临床症状。所有接种羊和对照羊精神食欲均正常,经胸腹部皮内接种的痘种反应在1.2~3.8cm的范围内,痘肿均为无色或粉红色,无紫红色、水肿、化脓、结痂等反应。
(7)效力检验
本发明采用中和抗体测定和免疫攻毒方法分别进行小反刍兽疫病毒和山羊痘病毒部分的效力检验,将二联苗的接种剂量0.1头份,接种5只山羊;同时设立对照羊2只,接种途径采用皮内接种;小反刍兽疫免疫检验的观察期为21日,山羊痘免疫检验的观察日期为15日。小反刍兽疫部分判定标准与小反刍兽疫活疫苗标准一致。山羊痘效力判定标准与现有山羊痘单苗标准一致。
1)小反刍兽疫中和抗体效价判定标准为:将100%细胞孔不出现细胞病变的血清最高稀释度作为中和抗体效价,效价标准为不低于1:10。
2)羊痘攻毒方法检验标准为:本发明以0.1头份免疫山羊5只,在接种后5-7日,至少有4只山羊出现直径为0.5-3cm微红色痘肿反应,持续4-7日,逐渐消退,发痘羊精神、食欲均正常。
羊痘攻毒方法如下:攻毒剂量为1000ID50/只,攻毒方式为山羊后腿内侧皮内接种,攻毒后第10日经剖检进行结果判定,免疫组山羊应至少有4只不发痘或仅在注射点出现原发痘。对照组山羊应至少4/5发病。发病判定标准为:同时符合下列情况之二者,判为发病。(1)体温升高持续2-3日,食欲减少,精神沉郁。(2)除注射点形成痘肿外,在身体其他部位出现痘肿;或注射点痘肿直径大于4cm,出现紫红色、严重水肿、化脓、结痂等。
3)小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗中羊痘病毒含量与羊痘免疫攻毒保护呈正相关,以102.5TCID50及以上剂量免疫山羊,对羊痘强毒攻击产生100%的保护,确定羊痘部分最小免疫剂量为102.5TCID50。在进行效力检验时,可以通过测定羊痘病毒含量的方法进行效力检验。《中国兽药典》规定羊痘活疫苗病毒含量应不低于103.5TCID50/头份,根据联苗质量标准不应低于单苗的规定,本发明确定小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗中羊痘病毒含量应不低于103.5TCID50/头份。
(7)剩余水分测定按《兽药典》附录进行测定,应符合规定。
(8)真空度测定按《中国兽药典》附录进行测定,应符合规定。
附图说明
图1冻干疫苗外观图图中B为本发明所述的方法制备的小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗成品图;A、C、D为不同保护剂和冻干曲线组合对照冻干产品图。
本发明涉及生物材料资源信息
小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants,PPRV)PPRV 75/1-Clone 9株,该株病毒已于2016年12月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.13388。山羊痘病毒(Goatpox virus)温度敏感弱毒株(CVCC AV41);山羊痘病毒强毒青海株(CVCC AV40);Vero细胞(CVCC CL28):F168代,中国兽医药品监察所制备并提供,(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著,中国兽医菌种目录(第二版),中国农业科学技术出版社,2002年,p150,150,348)。
本发明的积极意义
本发明涉及一种小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗及其制备方法。本发明采用小反刍兽疫病毒PPRV 75/1-Clone 9株和山羊痘病毒温度敏感弱毒株(CVCC No.AV41)作为疫苗生产毒株分别在Vero细胞和山羊肾原代(次代)细胞培养收获的病毒液混合后加入冻干保护剂经真空冷冻干燥制备成有效地预防小反刍兽疫和山羊痘的二联活疫苗。
实施例
本实施例所用试验材料为:
1.病毒
本实验室制备的小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗3批,批号分别为01、02、03。
2.实验动物
小白鼠和豚鼠,新疆天康生物科技有限公司健康动物室自繁自养;
5-12月龄左右山羊、绵羊,2-3月龄怀孕山羊、绵羊,1月龄山羊、绵羊,购于新疆乌鲁木齐市南山地区。免疫前采血测定中和抗体效价,选羊痘病毒、小反刍兽疫病毒中和抗体效价均低于1:4的羊用于试验;试验用羊包括山羊和绵羊,山羊包括绒山羊、奶山羊、波尔山羊;绵羊品种包括德国美利奴、萨福克、小尾寒羊。
实施例1
——小反刍兽疫和山羊痘的二联活疫苗的制备
1.生产用毒种 小反刍兽疫病毒75/1-Clone 9株(CGMCC No.)生产用基础种毒和GPV温度敏感弱毒株(CVCC No.AV41)生产用基础种毒,均由中国兽医药品监察所制备并提供。
2.生产用细胞 Vero细胞:中国兽医药品监察所保存;山羊肾原代(次代)细胞:用新鲜山羊肾脏制备,中国兽医药品监察所制备并提供。
3.小反刍兽疫病毒液的制备 将PPRV75/1-Clone 9株毒种用无血清MEM水化后,按0.1%、0.5%、1%、2%同步接种不同细胞浓度的Vero细胞悬液,细胞悬液浓度分别调整为20~30万/ml、50~60万/ml。混匀后分别分装细胞瓶,置37℃培养箱培养,每天观察细胞病变,记录出现70%以上病变的时间,病变达到70%以上时,将细胞瓶移至-20℃反复冻融3次,收获病毒液。
4.山羊痘病毒液制备 将山羊痘毒种用无血清MEM培养液水化后,按细胞维持液总量0.1%、0.5%、1%、2%的比例接种山羊肾细胞单层,接种时间分别为山羊肾细胞单层铺满程度为80%、100%,接种后置37℃培养箱培养,每天观察细胞病变,记录出现70%以上病变的时间,病变达到70%以上时,将细胞瓶移至-20℃冻融3次,收获病毒液,取样测定病毒含量,按Reed-Muench法计算每0.1ml的TCID50。
5.病毒液检验 分别提取两种进行病毒液样品进行无菌检验、支原体检验和病毒含量测定。
(1)无菌检验及支原体检验 按现行《中国兽药典》进行检验。
(2)病毒含量测定 将收获的病毒液样品用无血清MEM作10倍系列稀释,取10-1~10-88个稀释度病毒液,接种96孔细胞培养板,每个稀释度接种5孔,每孔0.1ml,接种后每孔加入0.1ml山羊肾细胞悬液。置37℃5%CO2培养箱培养5~7天,根据细胞病变孔数按Reed-Muench法计算TCID50。
6.配苗与冻干 将检验合格的PPR病毒液、山羊痘病毒液与保护剂按(V/V)1:1:2混合后充分混匀、分装后,装箱后按本发明设计的冻干曲线冻干经真空冷冻干燥而成。
冻干保护剂配方:
蔗糖 75g,右旋糖苷 40g,山梨醇 40g,鱼明胶 25g,Na2HPO4 0.51g,NaH2PO41.25g,加少量双蒸水溶解,1mol KOH调pH至7.2,双蒸水补至1000ml,115℃高压灭菌30min。
确定疫苗冻干曲线如下:预冻:-22~-27℃0.5小时,-40~-50℃2.0小时;一期升华:-8.0℃20小时,26℃6小时,二期升华:24℃3.5小时。
采用以上方法制备的小反刍兽疫和山羊痘的二联活疫苗3批,批号分别为01、02、03。
实施例2
——疫苗成品检验
1.性状 淡黄色海绵状疏松团块,易与瓶壁脱离,加稀释液后均迅速溶解。
2.无菌检验 按《中国兽药典》规定方法进行检验,均无菌生长。
3.支原体检验 按《中国兽药典》规定方法进行检验,均无支原体生长。
4.外源病毒检验 按《中国兽药典》规定方法进行检验,均无外源病毒污染。
5.病毒含量测定病毒含量测定 将收获的病毒液样品用无血清MEM作10倍系列稀释,取10-1~10-88个稀释度病毒液,接种96孔细胞培养板,每个稀释度接种5孔,每孔0.1ml,接种后每孔加入0.1ml山羊肾细胞悬液。置37℃5%CO2培养箱培养5~7天,根据细胞病变孔数按Reed-Muench法计算TCID50。三批二联苗的病毒含量测定结果见表1。
表1 三批小反刍兽疫和山羊痘的二联活疫苗的病毒含量测定结果
5.安全检验
(1)非特异性安全试验
将小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗用无血清MEM细胞营养液稀释成每毫升含10头份,接种体重为200~250g豚鼠,其中肌肉注射2只,每只0.5ml;腹腔注射2只,每只0.5ml;2只不接种作为对照。观察14日,所有动物均健活。接种体重为18~22g小鼠,经腹腔注射6只,每只0.1ml;另设4只不接种对照。观察14日,所有动物均健活。表明该疫苗安全性良好。
(2)特异性安全试验
小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗以4头份经胸腹部皮内接种1-12月龄左右健康易感山羊和绵羊,除个别动物体温出现一过性升高外,未见其他异常临床症状。所有接种羊和对照羊精神食欲均正常,经胸腹部皮内接种的痘种反应在1.2~3.8cm的范围内,痘肿均为无色或粉红色,无紫红色、水肿、化脓、结痂等反应。见表2
表2 小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗安全试验(羊)检验结果
6.效力检验
本发明采用中和抗体测定和免疫攻毒方法进行效力检验,将二联苗的接种剂量确定为0.1头份,接种羊数采用小反刍兽疫活疫苗效力检验的羊数,即5只山羊;同时设立对照羊2只,接种途径采用皮内接种;小反刍兽疫免疫检验的观察期为21日,山羊痘免疫检验的观察日期为15日。
(1)小反刍兽疫部分的检验:中和抗体效价判定:将100%细胞孔不出现细胞病变的血清最高稀释度作为中和抗体效价,效价均不低于1:10。
(2)羊痘部分的检验:
1)羊痘病毒含量的方法进行效力检验各批次二联苗的羊痘部分检验结果,病毒含量均不低于103.5TCID50/头份。
2)羊痘攻毒方法检验:本发明以0.1头份免疫山羊5只,在接种后5~7日,免疫组山羊应至少有4只不发痘或仅在注射点出现原发痘(山羊出现直径为0.5~3cm微红色痘肿反应,持续4~7日,逐渐消退)发痘羊精神、食欲均正常。对照组山羊应至少4/5发病,结果见表3。
(7)剩余水分测定按《中国兽药典》附录进行测定,均符合规定。
(8)真空度测定按《中国兽药典》附录进行测定,均符合规定。
表3 五批疫苗效力检验(免疫羊后PPRV中和抗体和山羊痘攻毒保护试验)结果
实施例3
——制苗用小反刍兽疫病毒、羊痘病毒抗原相容性
将繁殖的小反刍兽疫病毒液和羊痘病毒液分别进行如下试验(见表4),测定处理后样品的病毒含量,每个样品做3个重复处理,按Reed-Muench法计算TCID50。
表4结果显示:小反刍兽疫、羊痘抗原相容性研究结果表明,二者之间无相互干扰,相容性较好。小反刍兽疫、山羊痘抗原相容性研究试验结果见表5。
表4 抗原相容性试验方案
表5 抗原相容性试验——不同处理后病毒含量测定结果
实施例4
——疫苗冻干保护剂的选择
用不同的冻干保护剂与病毒液配制疫苗,采用不同的冻干曲线冻干疫苗,冻干后测定病毒含量及剩余水分含量。结果见表6。
影响疫苗冻干效果的主要因素是冻干保护剂配方和冻干曲线,本发明设计了两种保护剂配方,采用两种冻干曲线分别进行冻干,结果配方1按照第2冻干曲线进行冻干,效果较好,确定该疫苗冻干保护剂配方如下:
冻干保护剂配方:
蔗糖 75g,右旋糖苷 40g,山梨醇 40g,鱼明胶 25g,Na2HPO4 0.51g,NaH2PO41.25g,加少量双蒸水溶解,1mol KOH调pH至7.2,双蒸水补至 1000ml 115℃高压灭菌30min。
确定疫苗冻干曲线如下:预冻:-22~-27℃0.5小时,-40~-50℃2.0小时;一期升华:-8.0℃20小时,26℃6小时,二期升华:24℃3.5小时。
表6 两种冻干保护剂的冻干效果
实施例5
——小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗(Clone9株+AV41株)安全性
为评价小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗的安全性,采用实验室制备的3批小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗,分别以不同接种剂量、不同接种途径、不同接种部位接种山羊,检测该疫苗的安全性。现将试验结果报告如下。
2.靶动物一次单剂量接种的安全性试验
选取健康、易感山羊、绵羊各9只,各随机分为3组,3只/组;取小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗3瓶,复溶后混匀,稀释至1头份/ml,每批疫苗免疫山羊和绵羊各3只,每只羊胸腹部皮内接种疫苗1头份,分2点注射,每点0.5ml,免疫前测定体温,设立同条件对照山羊和绵羊各3只,免疫后观察14天,每日测量体温,观察临床症状,并进行详细记录。山羊和绵羊经胸腹部皮内注射接种小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗后,连续观察14天,接种羊和对照羊均体温正常,采食、精神状态良好,未见不良反应。
胸腹部皮内注射接种羊出现痘肿反应见表7。
表7 单剂量胸腹部皮内接种羊痘肿反应
备注:痘肿均为无色或粉红色,无紫色、水肿、结痂等反应。
3.单剂量不同途径重复接种安全性试验
选取健康、易感山羊、绵羊各9只,各随机分为3组,3只/组;取小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗3瓶,复溶后混匀,稀释至1头份/ml,每批疫苗免疫山羊和绵羊各3只,每只羊胸腹部皮内接种疫苗1头份,分2点注射,每点0.5ml,免疫前测定体温,设立同条件对照山羊和绵羊各3只,免疫14日后,以相同剂量、经胸腹部皮内再免疫接种1次。接种后再观察14天,每日测量体温,观察临床症状,并进行详细记录。山羊和绵羊经颈部胸腹部皮内注射接种小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗后,观察至第14天,再次以相同接种方式接种该疫苗,二次接种后再次临床观察14天,免疫羊和对照羊均体温正常,采食、精神状态良好,未见不良反应。
胸腹部皮内注射接种羊出现痘肿反应见表8。
表8 单剂量重复胸腹部皮内接种羊痘肿反应
备注:痘肿均为无色或粉红色,无紫色、水肿、结痂等反应。
4.靶动物一次超剂量接种安全性试验
选取健康、易感山羊、绵羊各15只,各随机分为3组,5只/组,取小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗3瓶,复溶后混匀,稀释至10头份/ml,每批疫苗免疫山羊和绵羊各5只,每只羊颈部皮下注射小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗10头份,设立同条件对照山羊和绵羊各3只,免疫前测定体温,免疫后观察14天,每日测量体温,观察临床症状,并进行详细记录。
选取健康、易感山羊、绵羊各9只,各随机分为3组,3只/组,取小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗3瓶,复溶后混匀,稀释至4头份/ml,每只羊胸腹部皮内接种疫苗1ml,每只2点,分2点注射,每点0.5ml,设立同条件对照山羊和绵羊各3只,免疫前测定体温,免疫后观察14天,每日测量体温,观察临床症状,并进行详细记录。胸腹部皮内接种羊痘肿反应见表9。
山羊和绵羊经颈部皮下注射和胸腹部皮内注射超剂量接种小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗后,连续观察14天,免疫羊体温正常,采食、精神状态良好,未见其他不良反应。
表9 4头份胸腹部皮内接种羊痘肿反应
备注:痘肿均为无色或粉红色,无紫色、水肿、结痂等反应。
5.怀孕靶动物一次超剂量接种安全性试验
选取怀孕2-3个月健康易感山羊和绵羊各9只,各随机分为3组,3只/组,取小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗3瓶,复溶后混匀,稀释至4头份/ml,每只羊胸腹部皮内接种疫苗1ml,分2点注射,每点0.5ml,每只羊胸腹部皮内接种疫苗1ml,分2点注射,每点0.5ml,设立同条件对照山羊和绵羊各3只,免疫后观察14天,观察临床症状,并进行详细记录。观察接种后有无不良反应或流产、死胎现象。
怀孕2-3个月健康易感山羊和绵羊经胸腹部皮内注射接种小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗1头份,接种后观察14天,未见异常临床症状,免疫后无流产或死胎现象发生,跟踪观察至怀孕母羊分娩,接种母羊所产羊羔数和对照母羊所产羊羔数无明显差异,接种母羊所产羊羔均正常。接种羊均有痘肿反应。为避免因测温引起机械性流产,故未测体温。
怀孕羊胸腹部皮内接种二联苗后的痘肿反应见表10,怀孕羊胸腹部皮内接种二联活疫苗后产羔数见表11。
表10 怀孕羊胸腹部皮内接种二联苗后的痘肿反应
备注:痘肿均为无色或粉红色,无紫色、水肿、结痂等反应。
表11 怀孕羊胸腹部皮内接种二联活疫苗后产羔数
6.羔羊一次单剂量接种的安全性试验
选取健康、易感1月龄山羊羔、绵羊羔各9只,各随机分为3组,3只/组,取小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗3瓶,复溶后混匀,稀释至1头份/ml,每只羊胸腹部皮内接种疫苗1ml,分2点注射,每点0.5ml,每只羊接种疫苗1头份,设立同条件对照山羊和绵羊各3只,免疫当天测定体温,免疫后观察14天,每日测量体温,观察临床症状,并进行详细记录。1月龄山羊羔、绵羊羔经胸腹部皮内接种小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗,1头份/只,接种后观察至第14天,所有免疫羔羊体温正常,未见异常临床症状,与对照相比,日增重无明显差异。胸腹部皮内接种羊痘肿反应见表12。
表12 羔羊胸腹部皮内接种二联活疫苗后的痘肿反应
备注:痘肿均为无色或粉红色,无紫色、水肿、结痂等反应。
7.结论
(1)小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗单剂量经胸腹部皮内接种12月龄左右健康易感山羊和绵羊,所有动物精神食欲均正常,未见异常临床症状。所有接种动物和对照动物均健活,经胸腹部皮内接种山羊的痘肿直径为1.2~3.2cm。痘肿为无色或粉红色痘肿,无紫色、结痂、水肿等反应。
(2)小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗单剂量重复经胸腹部皮内接种12月龄左右健康易感山羊和绵羊,所有动物精神食欲均正常,未见异常临床症状。经胸腹部皮内接种羊的痘肿直径为2.1~3.4cm,痘肿为无色或粉红色痘肿,无紫色、结痂、水肿等反应。所有接种动物和对照动物健活。
(3)将小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗以4头份经皮内接种1~8月龄健康易感山羊和绵羊,除个别动物体温出现一过性升高外,未见其他异常临床症状。经胸腹部皮内接种山羊的痘肿直径为1.6~3.8cm,痘肿为无色或粉红色痘肿,无紫色、结痂、水肿等反应。所有接种动物和对照动物健活。
经颈部皮下接种小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗10头份,接种羊未见其他异常临床症状。
(4)小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗按1倍使用剂量经胸腹部皮内接种怀孕山羊和绵羊,接种后怀孕母羊未发生流产、死胎等异常临床反应;观察至母羊分娩,所产羔羊数量与对照无明显差异,所产羔羊均健活,增重与对照无差异。经胸腹部皮内接种母羊的痘肿直径为1.6-3.3cm。痘肿为无色或粉红色痘肿,无紫色、结痂、水肿等反应。
(5)小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗按1倍使用剂量经胸腹部皮内接种羔羊,除个别动物体温出现一过性升高外,未见其他异常临床症状。经胸腹部皮内接种羊的痘肿直径为1.2-2.9cm,痘肿为无色或粉红色痘肿,无紫色、结痂、水肿等反应。
本发明进行的以上小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗接种靶动物及非靶动物的安全性试验,试验数据表明,疫苗对不同品种及不同日龄的羊安全性均良好;可以用于临床预防羊的小反刍兽疫和羊痘。
实施例7
——疫苗的效力检验
1.小反刍兽疫部分效力检验
本发明采用中和抗体测定方法进行效力检验,将二联苗的接种剂量确定为0.1头份,接种羊数采用小反刍兽疫活疫苗效力检验的羊数,即5只山羊;同时设立对照羊2只,接种途径采用皮内接种;山羊痘观察日期为15日,小反刍兽疫免疫期为21日。山羊痘效力判定标准与现有山羊痘单苗标准一致。小反刍兽疫部分判定标准与已批准的小反刍兽疫活疫苗标准一致。小反刍兽疫中和抗体效价判定标准为将100%细胞孔不出现细胞病变的血清最高稀释度作为中和抗体效价,效价标准为不低于1:10。该标准高于OIE规定的PPR活疫苗标准。
为了验证效力检验标准的可靠性,开展了疫苗PPRV部分的免疫攻毒试验。将采用Clone9毒株生产的3批小反刍兽疫活疫苗和3批小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗分别按101、102、103、104TCID50PPR病毒剂量免疫山羊,免疫后采血测定PPRV中和抗体,并用强毒进行攻击,结果表明:
免疫剂量与攻毒保护的关系为:10TCID50免疫组攻毒保护率为76.7%;102TCID50免疫组攻毒保护率为96.7%;103TCID50以上免疫组攻毒保护率为100%。
中和抗体效价与攻毒保护的关系为:
抗体效价<1:4,攻毒保护率为0%;
抗体效价为1:5,攻毒保护结果为1/9保护,攻毒保护率为11%;
抗体效价为1:10,攻毒保护结果为8/8保护,攻毒保护率为100%;
抗体效价1:20以上,攻毒保护结果为103/103保护,攻毒保护率为100%。
免疫剂量与中和抗体及攻毒保护率关系为:
10TCID50免疫组23/30免疫羊中和抗体效价>1:10,抗体阳性率为76.7%;攻毒保护率为76.7%。
102TCID50剂量免疫组28/30免疫羊中和抗体效价>1:10,抗体阳性率为93.3%;攻毒保护率为96.7%。
103TCID50以上剂量免疫组60/60免疫羊中和抗体效价>1:10,抗体阳性率为100%,攻毒保护率为100%。
攻毒保护试验结果证实将疫苗中PPRV病毒含量规定为不低于103TCID50/头份;免疫山羊血清中和抗体效价不低于1:10的效力标准是可靠的。
2.羊痘部分效力检验
小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗羊痘部分免疫攻毒保护试验:
将3批疫苗分别按104.5TCID50/只、103.5TCID50/只、102.5TCID50/只、101.5TCID50/只4个剂量(按羊痘病毒含量)免疫山羊,免疫后21天采血测定羊痘中和抗体,并进行羊痘病毒强毒攻击试验。
羊痘攻毒试验结果表明,小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗免疫山羊后,其中和抗体水平和免疫攻毒保护虽然有一定的相关性,但不呈正相关,无法根据疫苗免疫山羊后的羊痘病毒中和抗体水平进行效力评价。
小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗中羊痘病毒含量与羊痘免疫攻毒保护呈正相关,以102.5TCID50及以上剂量免疫山羊,对羊痘强毒攻击产生100%的保护,确定羊痘部分最小免疫剂量为102.5TCID50。在进行效力检验时,可以通过测定羊痘病毒含量的方法进行效力检验。《中国兽药典》规定羊痘活疫苗病毒含量应不低于103.5TCID50/头份,根据联苗质量标准不应低于单苗的规定,本发明确定小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗中羊痘病毒含量应不低于103.5TCID50/头份。
羊痘攻毒方法如下:攻毒剂量为1000ID50/只,攻毒方式为山羊后腿内侧皮内接种,攻毒后第10日经剖检进行结果判定,免疫组山羊应至少有4只不发痘或仅在注射点出现原发痘。对照组山羊应至少4/5发病。发病判定标准为:同时符合下列情况之二者,判为发病。(1)体温升高持续2-3日,食欲减少,精神沉郁。(2)除注射点形成痘肿外,在身体其他部位出现痘肿;或注射点痘肿直径大于4cm,出现紫红色、严重水肿、化脓、结痂等。
羊痘活疫苗采用观察免疫羊痘肿情况判断疫苗效力。本发明以0.1头份免疫山羊5只,在接种后5-7日,至少有4只山羊出现直径为0.5-3cm微红色痘肿反应,持续4-7日,逐渐消退,发痘羊精神、食欲均正常。确定该方法为本动物效力检验方法。
小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗羊痘部分免疫攻毒保护试验
将3批疫苗分别按 4个剂量免疫山羊,免疫后21天采血测定羊痘中和抗体,并进行羊痘病毒强毒攻击试验。
结果表明,羊痘部分104.5TCID50免疫山羊,对羊痘强毒攻击产生100%的保护;以103.5TCID50免疫山羊,对羊痘强毒攻击产生100%的保护;以102.5TCID50免疫山羊,对羊痘强毒攻击产生100%的保护;以101.5TCID50免疫山羊,对羊痘强毒攻击产生67%的保护。
实施例8
——小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗最小免疫剂量
将3批疫苗分别按104TCID50/只、103TCID50/只、102TCID50/只、10TCID50/只免疫山羊,免疫后21天采血测定PPRV中和抗体,并进行小反刍兽疫病毒强毒攻击试验。PPRV中和抗体测定结果和PPRV攻毒保护结果表明,小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗小反刍兽疫部分以104TCID50免疫山羊,免疫羊中和抗体均在1:160以上,对PPRV强毒的攻击产生100%的保护;以103TCID50免疫山羊,免疫羊中和抗体均在1:160以上,对PPRV强毒的攻击产生100%的保护;以102TCID50免疫山羊,免疫羊93%中和抗体均在1:10以上,对PPRV强毒的攻击产生93%的保护;以10TCID50免疫山羊,免疫羊73%中和抗体在1:10以上,对PPRV强毒的攻击产生73%的保护。确定PPRV最小免疫剂量为103TCID50。
Claims (2)
1.一种小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗,其特征在于所述活疫苗含有小反刍兽疫弱毒株活病毒和山羊痘病毒弱毒株活病毒,可同时预防小反刍兽疫和山羊痘;
所述小反刍兽疫弱毒株活病毒为小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants)75/1Clone9株,该株病毒已于2016年12月15日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.13388;
所述山羊痘病毒(Goatpox virus)弱毒株活病毒为山羊痘病毒温度敏感弱毒株,保藏编号为CVCC No.AV41。
2.如权利要求1所述小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗,其特征在于该疫苗用所述小反刍兽疫病毒75/1Clone9株弱毒和山羊痘病毒温度敏感弱毒株作为疫苗生产毒株,分别接种Vero细胞和山羊肾细胞单层,当细胞出现细胞病变达70%以上时,将细胞瓶移至-20℃反复冻融3次,分别收获病毒液;再将其混合后加冻干保护剂经真空干燥制成小反刍兽疫、山羊痘二联活疫苗;
所述冻干保护剂配方及制备方法是(W/V):蔗糖0.75,右旋糖苷0.40,山梨醇0.40,鱼明胶0.25,Na2HPO40.051,NaH2PO40.125,加少量双蒸水溶解,1mol KOH调pH至7.2,双蒸水补至100%,115℃高压灭菌30min;
所述真空干燥采用的冻干曲线如下:预冻:-22~-27℃0.5小时,-40~-50℃2.0小时;一期升华:-8.0℃20小时,26℃6小时,二期升华:24℃3.5小时。
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