CN110079509A - 一种Ⅰ群11d型禽腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Ⅰ群11d型禽腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法。所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株，命名为禽腺病毒RC18，该病毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17404。实验证明，本发明分离得到的I群11d型禽腺病毒RC18株毒价高，增殖能力强，免疫原性好，与流行株匹配，将其制备成灭活疫苗免疫实验鸡后能抵御临床流行的I群禽腺病毒(血清11d型)对鸡群的感染，免疫应答产生迅速，攻毒保护率高，并且未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，安全性高，稳定性好。本发明的提出为鸡包涵体肝炎的防治提供了一种有效技术手段。

Description

一种Ⅰ群11d型禽腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种病毒毒株及灭活疫苗，具体涉及一种Ⅰ群11d型禽腺病毒株、灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

鸡包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis，IBH)是因I群禽腺病毒(FAdV)引起的传染病，是目前流行的、急性、高度接触性的一种鸡传染病，在我国部分地区流行。其病原为禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)血清8b型，在病毒分类上为腺病毒科，禽腺病毒属中的Ⅰ亚群禽腺病毒。

FAdV属于禽腺病毒科(Family Adenoviridae)禽腺病毒属的无囊膜双股DNA病毒，可分为12个血清型，这些血清型之间表现出非常不同的病原性。在世界范围内，禽腺病毒2、3、8a、8b、9和11血清型可引起包涵体肝炎，在血清4型存在情况下，会引起心包积液肝炎综合征。目前在我国已知危害国内养鸡业的主要血清型是4型、8型、11型。该病原可导致7d～20W鸡发病，主要感染1-3周龄的肉鸡、817杂交肉鸡、麻鸡、黄鸡，3～7w多发。病鸡生长受阻、羽毛蓬乱、蹲伏。

目前在我国山东、河南、河北等多个地区发生此病，该病既可以垂直传播，能够进行蛋传(egg transmission)，种鸡群受到感染后一直无症状，但蛋传给后代雏鸡而引发严重病症，从而能够对肉鸡产业造成损害，同时也可水平传播。鸡感染后可成为终身携带者，并可间歇性排毒。鸡群发病后会突现3～7天的死亡高峰。可能至10％，个别可达30％。有时病程也可持续2-3w。，单独感染也能够导致高发病率和死亡率。

在诊断方面，目前主要通过实验室的临床症状、组织病理变化、PCR扩增和病毒分离等方法进行确诊。

在疫病防控方面，应用鸡胚和禽源细胞培养禽腺病毒可以为禽腺病毒疫苗的研究提供一定的材料，但因不同血清型禽腺病毒之间无交叉保护性，已有的毒株血清型对市场流行的毒株不能提供良好保护，因此，目前市场亟需开发一种新血清型禽腺病毒疫苗来弥补市场禽腺病毒疫苗防控不全面的情况。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种Ⅰ群11d型禽腺病毒株，以便为研制I群禽腺病毒灭活疫苗奠定基础。

本发明中，提供的Ⅰ群11d型禽腺病毒株，命名为禽腺病毒RC18，分类命名为禽腺病毒D种血清11型(Adenovirus sp.)，该病毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.17404，保藏时间为2019年3月21日。该病毒由发病鸡病料组织接种SPF鸡胚分离所得。所述病毒为禽腺病毒Ⅰ亚群中的D种，血清型为11型，病毒核酸为双股DNA，无囊膜；病毒颗粒直径为70～90nm，呈20面体对称结构。在氯化铯中浮密度为1.32～1.37g/ml；病毒对脂溶剂如乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠、胰蛋白酶、2％酚、50％乙醇等具有抵抗力，同时耐受pH3～9，但在1：1000的甲醛中可被灭活。病毒的增殖也可被DNA抑制剂IuDR和BuDR所抑制；病毒对热具有较强的抵抗力，在60℃30min仍具有活力；病毒不能凝集鸡、鸭、火鸡及大鼠红细胞；该病毒可经7日龄鸡胚绒毛尿囊膜途径培养，也可以在鸡肝癌细胞(LMH细胞)上增殖。

本发明的目的之二是提供一种所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株在制备I群禽腺病毒灭活疫苗中的用途。

本发明的目的之三是提供一种I群禽腺病毒灭活疫苗及其制备方法。

所述的一种I群禽腺病毒灭活疫苗，其含有灭活后的所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株。

一种制备所述的I群禽腺病毒灭活疫苗的方法，包括将所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株接种鸡胚或鸡肝癌细胞(LMH细胞)、收获病毒抗原液、灭活和乳化的步骤。

其中，优选的，具体步骤如下：

1)病毒抗原液的制备

a.病毒接种：

将所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株通过绒毛尿囊膜的途径按10^3.0～10^4.0ELD50/0.1ml接种于7日龄SPF鸡胚，0.2ml/胚，37℃孵化箱培养，定期观察。弃24h内死胚；

b.收获病毒抗原液：

取接种48h～168h内死亡鸡胚的尿囊液和胚体，收集死胚尿囊液和胚体，将胚体无菌环境下研磨后与尿囊液一并装于灭菌容器内，－20℃保存；

c.灭活：

将收获的病毒抗原液浓缩至10^6.5ELD₅₀/0.1ml，向浓缩后的病毒抗原液中加入终浓度为2％v/v的甲醛溶液摇匀，37℃灭活16～20h，得到灭活后的病毒抗原液；

2)疫苗制备

a.水相制备：

在96份灭活后的病毒抗原液中加入灭菌的吐温-80 4份，边加边充分搅拌，直到吐温-80完全溶解；

b.油相制备：

按油相:水相体积比为3:1的比例计算油相用量，取注射用白油94份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃，再加入司本-80 6份，至温度达到130℃时维持30分钟，冷却后备用；

c.乳化:

取3份油相放入乳化罐内，150转/分速率边加边搅拌1份水相，待水相加完后持续保持低速搅拌30分钟混匀水油相，在20～25℃下，以4000r/min剪切速率剪切2次，直至乳化合格为止，制成所述的I群禽腺病毒灭活疫苗。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明分离的到的I群11d型禽腺病毒RC18株毒价高，增殖能力强，免疫原性好，与流行株匹配，将其制备成灭活疫苗能抵御临床流行的I群禽腺病毒(血清11d型)对鸡群的感染。

2、优选鸡胚接种方法和收获时间，提高病毒毒价滴度，满足制备高效价疫苗需求；

3、本发明制备的禽腺病毒灭活疫苗安全性高，稳定性好，免疫应答产生迅速，攻毒保护率高。本发明制备的疫苗免疫实验鸡后未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

附图说明

图1为禽腺病毒Hexon目的基因扩增；

M：DNA Marker；1、2、4：目的产物；3：阴性对照；

图2为禽腺病毒RC18株的遗传进化关系；

图3为禽腺病毒RC18株感染鸡胚后的症状。

具体实施方式

下面结合具体实施方式做进一步的说明，这些实例仅用于说明，而不用于限制本专利的保护范围。

实施例1禽腺病毒RC18株的分离鉴定

1、流行病学调查

2017至今，发明人从山东省河北等地区的部分白羽肉鸡、蛋鸡发现了一种以肝脏肿大出血特点的疾病，经临床调查和实验室检测，初步诊断为Ⅰ群禽腺病毒引起的包涵体肝炎，遂将有典型症状发病鸡的肝、脾、肺等病料组织采集后置于-70℃冰箱保存备用。

2、病毒分离

取病死鸡的肝脏研碎后，用按1:5的比例加入灭菌生理盐水制成悬液；反复冻融3次后，12000r/min离心10min，取上清；加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，经0.22μm的微孔滤器过滤，保存备用。将上述制备的样本研磨液经绒毛尿囊膜途径接种7日龄SPF鸡胚，0.2ml/胚，弃24h内死胚，取接种48h～168h内死亡鸡胚的尿囊液和胚体，用上述方法处理后连续传代，观察每代死胚的肝组织，鸡胚表现为死胚、肝脏肿大和质脆，胚胎充血。收集死胚尿囊液，－20℃保存。

3、病毒的鉴定

3.1血凝性鉴定

分别取上述病毒，进行纯化后浓缩2倍制备成待检病毒液。将待检病毒液用PBS在“V”型板中进行2倍连续倍比稀释，分别采用鸡、鸭、鹅、豚鼠、兔的1％红细胞悬液进行凝集试验。结果表明，4个病毒分离株对鸡、鸭、鹅、豚鼠、兔的1％红细胞悬液均无血凝性。

3.2血清学鉴定

使用Ⅰ群禽腺病毒标准株、EDSV-76京911株标准阳性血清及阴性血清，用琼脂凝胶扩散试验(AGP)对病毒进行鉴定，结果：分离毒仅能与Ⅰ群禽腺病毒11d型阳性血清出现明显沉淀线，与Ⅲ群禽腺病毒EDSV-76京911株标准阳性血清无沉淀线。

3.3病毒含量的鉴定

将分离的病毒连续传代4代，将收获的每一代毒液按照现行《中国兽药典》附录方法进行病毒ELD₅₀的测定。即分别用灭菌生理盐水作10倍连续梯度稀释，选取10^-2～10^-5，每个稀释度接种7日龄易感SPF鸡胚5枚，每胚经绒尿膜接种0.1ml，37℃孵育，每日照蛋3次，观察7日(168小时)，弃去48小时内死亡胚，观察并统计48～168小时各稀释度鸡胚的死亡数和病变情况，按Reed-Muench法计算病毒半数致死量，结果如表1所示。结果显示分离株的毒价浓缩前为10^4.83ELD₅₀/0.1ml。

表1盲传4代病毒液ELD50测定结果

检测项	F1	F2	F3	F4
					10<sup>N</sup>ELD<sub>50</sub>/0.1ml	3.19	3.83	4.83	4.83

3.4分子生物学鉴定

利用柱式动物DNA提取试剂盒提取病毒DNA，使用针对Ⅰ群FAdV Hexon基因的特异性引物进行PCR检测(图1)。将阳性样品进行Hexon基因测序，并进行遗传进化分析。根据Hexon基因序列比对和遗传进化分析，分离毒与Ⅰ群禽腺病毒参考株属于同一分支，与血清11d型同源性最接近(图2)。

3.5理化特性鉴定

参照《动物病毒学》介绍的方法对分离的病毒进行理化特性鉴定，结果表明：病毒对脂溶剂如乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠、胰蛋白酶、2％酚、50％乙醇等具有抵抗力，同时耐受pH3～9，但在2‰的甲醛中可被灭活。病毒的增殖也可被DNA抑制剂IuDR和BuDR所抑制；病毒对热具有较强的抵抗力，在60℃30min仍具有活力；该病毒可经7～9日龄鸡胚尿囊腔、绒毛尿囊膜途径培养，也可以在鸡肝癌细胞(LMH细胞)上增殖。

经上述方法鉴定后，将分离得到的病毒株确认为Ⅰ群11d型禽腺病毒株，命名为禽腺病毒RC18，分类命名为禽腺病毒D种血清11型(Adenovirus sp.)，该病毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.17404，保藏时间为2019年3月21日。

实施例2应用SPF鸡胚制备禽腺病毒灭活疫苗

本发明所述的制备禽腺病毒灭活疫苗的方法，涵盖以下步骤：制苗用抗原的制备，半成品检验，疫苗的制备，安全性检验和效力检验，具体步骤如下：

1、抗原液的制备

1.1种蛋的孵化：

选用SPF鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，摆在42枚蛋盘上，气室必须向上置孵化器内孵化。

1.2病毒接种与收获：

将分离的到的毒种(禽腺病毒RC18)用灭菌生理盐水作适当稀释，按10^3.0～10^4.0ELD50/0.1ml经绒毛尿囊膜途径接种7日龄鸡胚，0.2ml/胚。37℃孵育，选接种后96-168小时之间死亡且病痕明显的鸡胚(图3)，分别收获尿囊液和胚体，将胚体无菌环境下研磨后与尿囊液一并装于灭菌容器内。按照中华人民共和国兽药典(二〇一五年版、三部)中将检验无菌。

1.3灭活：

将收获的病毒抗原液浓缩至10^6.5ELD₅₀/0.1ml，向浓缩后的病毒抗原液中加入甲醛溶液，使终浓度为0.2％，摇匀，37℃灭活16～20h；在灭活期间振荡抗原瓶3～4次。到灭活时间取样品作灭活检验和无菌检验，灭活液放置2～8℃保存备用。

2.半成品检验

2.1病毒含量测定

取灭活前的病毒液进行测定，测定收获毒液病毒含量，收获毒液效价≥10^6.5ELD50/0.1ml

2.2无菌检验

取灭活后的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

2.3灭活检验

取灭活后的病毒原液，10倍稀释后尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚6枚，每胚0.2ml，37℃下继续孵育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察5日，非特异性死亡鸡胚应不超过2个。对所有胚液分别测定血凝价，有1枚鸡胚液血凝价高于1∶16，即认为灭活不完全。如无血凝性，将收获鸡胚液混合，盲传1代，逐枚测定血凝效价，判定灭活是否彻底。

3、疫苗的制备

1)水相制备：

用75％酒精消毒乳化罐顶部进料口，在96份灭活禽腺病毒RC18抗原液中加入灭菌的吐温-80 4份，边加边充分搅拌，直到吐温-80完全溶解。

2)油相制备：

按油相:水相为3:1的比例计算油相用量，取注射用白油94份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃，再加入司本-80 6份，至温度达到130℃时维持30分钟，冷却后备用。

3)乳化:

取3份油相放入乳化罐内，150转/分速率边加边搅拌1份水相，待水相加完后持续保持低速搅拌30分钟混匀水油相，在20～25℃下，以4000r/min剪切速率剪切2次，直至乳化合格为止，制成I群禽腺病毒灭活疫苗，编号为VF11ds01。

4、疫苗的安全试验

用5日龄商品AA白羽肉鸡20只，其中10只每只鸡颈部注射疫苗0.3ml，另外10只每只鸡颈部注射生理盐水0.3ml。隔离器内饲养，连续观察21日。每天观察各组鸡的饮食饮水、全身、局部反应及其它临床症状，并于接种后7日、14日、21日触摸检查各免疫组鸡注射部位，检查是否有红肿等局部注射反应。结果显示在免疫后的7日、14日、21日注射部位无局部注射反应鸡群饮食与对照组正常，疫苗安全。

5、免疫效力试验

取21日龄SPF鸡20只，随机均分为2组，其中10只分别皮下注射I群禽腺病毒疫苗(编号为VF11ds01)0.3ml/只作为疫苗免疫组；另10只皮下接种等量PBS作为对照组，编号、隔离器内饲养。免疫后21天后，免疫组与对照组用禽腺病毒(I群11d型)RC18株湿毒攻毒，颈部皮下注射0.2ml/只(含100ELD₅₀)。

观察14日，结果：对照组鸡连续观察14天内，有4只病鸡羽毛蓬松、精神萎顿、卧地不起、吃食饮水减少，其中2只攻毒后10天内死亡。疫苗免疫组鸡连续观察14天内，没有出现病鸡及死亡的现象。攻毒结果表明，疫苗免疫组对腺病毒(Ⅰ群11d型)免疫保护率均为100％，本发明制备的疫苗免疫实验鸡后未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。非免疫对照组攻毒后14天，40％鸡发病，20％鸡死亡，结果如表2和表3所示。

表2禽腺病毒AGP抗体检测结果

注：“+”表示血清原液琼扩抗体阳性，“—”表示血清原液琼扩抗体阴性。

表3禽腺病毒(I群11d型)免疫攻毒保护结果

Claims (5)

1.Ⅰ群11d型禽腺病毒株，命名为禽腺病毒RC18，该病毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17404，保藏时间为2019年3月21日。

2.权利要求1所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株在制备I群禽腺病毒灭活疫苗中的用途。

3.一种I群禽腺病毒灭活疫苗，其特征在于，含有灭活后的权利要求1所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株。

4.一种制备权利要求3所述的I群禽腺病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株接种鸡胚或鸡肝癌细胞(LMH细胞)、收获病毒抗原液、灭活和乳化的步骤。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)病毒抗原液的制备

a.病毒接种：

将权利要求1所述的Ⅰ群11d型禽腺病毒株通过绒毛尿囊膜的途径按10^3.0～10^4.0ELD50/0.1ml接种于7日龄SPF鸡胚，0.2ml/胚，37℃孵化箱培养，定期观察，弃24h内死胚；

b.收获病毒抗原液：

取接种48h～168h内死亡鸡胚的尿囊液和胚体，收集死胚尿囊液和胚体，将胚体无菌环境下研磨后与尿囊液一并装于灭菌容器内，－20℃保存；

c.灭活：

将收获的病毒抗原液浓缩至10^6.5ELD₅₀/0.1ml，向浓缩后的病毒抗原液中加入终浓度为2％v/v的甲醛溶液摇匀，37℃灭活16～20h，得到灭活后的病毒抗原液；

2)疫苗制备

a.水相制备：

在96份灭活后的病毒抗原液中加入灭菌的吐温-80 4份，边加边充分搅拌，直到吐温-80完全溶解；

b.油相制备：

按油相:水相体积比为3:1的比例计算油相用量，取注射用白油94份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃，再加入司本-80 6份，至温度达到130℃时维持30分钟，冷却后备用；

c.乳化:

取3份油相放入乳化罐内，150转/分速率边加边搅拌1份水相，待水相加完后持续保持低速搅拌30分钟混匀水油相，在20～25℃下，以4000r/min剪切速率剪切2次，直至乳化合格为止，制成所述的I群禽腺病毒灭活疫苗。