CN107523556A - 一种禽腺病毒毒株、疫苗组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了血清4型禽腺病毒FAV‑HN株，该株具有良好的免疫原性。其抗原所制备的疫苗组合物能在免疫后快速产生抗体，低含量的疫苗组合物即可对鸡产生完全保护。且该抗原能与多种其他抗原共同作用，各抗原相互间不影响免疫效果。

Description

一种禽腺病毒毒株、疫苗组合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种禽腺病毒毒株，以及由该毒株制备的疫苗组合物及其应用，属于生物医药领域。
背景技术
心包积液综合征(hydropericardium syndrome,HPS)是由血清4型禽腺病毒(FAV-4)引起的禽的高度传染性疾病。3～5周龄肉鸡发病尤为危害，严重时死亡率突然上升至80％以上。该病的病原——血清4型禽腺病毒(FAV-4)，为腺病毒科，禽腺病毒属，禽腺病毒C种的成员。FAV-4为无囊膜二十面体对称结构，直径70～90nm，基因组为线状双股DNA，长度约43Kb。感染鸡常见肝脏表面坏死灶和肝细胞核内的嗜碱性包涵体。
疫苗免疫可有效预防该病，然而在现有技术中，由于禽腺病毒不易培养，难以获得高滴度的病毒，尤其是不同分离株差异较大，导致制备的疫苗往往难以提供理想的免疫效果。
因此，临床上急需要开发出抗原含量高、免疫效果好的疫苗组合物，以有效防止该病的流行。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种禽腺病毒毒株，血清4型禽腺病毒FAV-HN株，保藏号为：CCTCC NO.V201609。禽腺病毒，FAV-HN株(Fowl aviadenovirus,strainFAV-HN)，所述FAV-HN株生物保藏号为：CCTCC NO.V201609，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2016年2月29日。
本发明的禽腺病毒FAV-HN株的抗原能在免疫后快速产生抗体，低含量的疫苗组合物即可对鸡产生完全保护。且本发明的毒株具有良好的病毒增殖滴度，培养容易，易于获得大量的抗原。
本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的抗原和药学上可接受的载体。
本发明的疫苗组合物具有良好的免疫原性，能对禽腺病毒的感染进行完全的保护，且其中的抗原成分能与多种其他抗原共同作用，各抗原相互间不影响免疫效果。
本发明涉及所述疫苗组合物的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤(1)，培养增殖禽腺病毒毒株或其培养物，步骤(2)，灭活所述步骤(1)中所述增殖的禽腺病毒毒株或其培养物，步骤(3)，在所灭活的禽腺病毒毒株或其培养物中加入药学上可接受的载体。
本发明涉及所述疫苗组合物在制备预防及治疗禽腺病毒感染相关疾病的药物中的应用。
本发明涉及所述疫苗组合物在制备预防及治疗由血清4型禽腺病毒(FAV-4)引起的心包积液综合征的药物中的应用。
本发明提供的疫苗株培养滴度高，免疫原性好，制备的疫苗组合物在临床上可有效控制鸡群中禽腺病毒的感染，尤其是血清4型禽腺病毒(FAV-4)引起的心包积液综合征。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明涉及血清4型禽腺病毒FAV-HN株，保藏号为：CCTCC NO.V201609。
本发明提供的血清4型禽腺病毒FAV-HN株，免疫效果良好，有利地预防禽腺病毒的感染。
本发明涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的所述的禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的抗原和药学上可接受的载体；其中，所述的禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的抗原包括灭活抗原、活的减毒的全病毒抗原、亚单位抗原或合成肽抗原。
“培养物”是病毒的不同代次传代培养物，本领域技术人员知晓不同代次之间其基因序列仅可能会发生微小的变异。
本发明所用术语“疫苗组合物”指含有禽腺病毒免疫原性的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡只针对禽腺病毒的免疫反应。所述疫苗组合物包括免疫量的禽腺病毒毒株的减毒全病毒抗原、灭活抗原、亚单位抗原或合成肽抗原。
本发明所用的术语“灭活抗原”，也称作失活抗原，指的是用作抗原以产生免疫力的灭活病毒的混悬液。灭活抗原使用已知方法可以很容易地产生。例如，通过用甲醛溶液处理病毒可获得全病毒灭活抗原。例如用本发明的禽腺病毒FAV-HN株可以通过灭活的方法制备成灭活抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述禽腺病毒毒株或其培养物的抗原为灭活全病毒抗原、亚单位抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述疫苗组合物包括鸡胚源的所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原，所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前≥105.0EID50/0.1ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述鸡胚源的所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前105.0～108.0EID50/0.1ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述鸡胚源的所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前106.5EID50/0.1ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述疫苗组合物包括细胞源的所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原，所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前≥105.0TCID50/0.1ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述细胞源的所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前105.0～108.0TCID50/0.1ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述细胞源的所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前106.5TCID50/0.1ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；
优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；
优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121))；
优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；
优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；
优选地，佐剂为白油佐剂；
佐剂的浓度范围是从10％到70％V/V，优选从30％到60％V/V，更优选60％V/V。
术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：(1)氢氧化铝、皂苷(Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA，(2)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的聚合物，或(3)疫苗可以以水包油、油包水或水包油包水乳剂形式制成。
尤其是，乳剂可以基于轻液体石蜡油、类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油，带直链烷基的酸或醇形成的酯，更特别是植物油，油酸乙基酯，丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)，丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸酯或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂一起使用形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，特别是聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)，脱水山梨糖醇、甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和可选地乙氧基化的油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是PluronicR，尤其是L121(参照Hunter等，1995，“The Theory and Practical ApplicationofAdjuvants”(Steward-Tull，D.E.S主编)John Wiley andSons，NY，51-94；Todd等，Vaccine，1997，15，564-570)。
特别地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通过糖或多元醇的聚链烯基醚交联。这些化合物被称作卡波姆。
优选地，本发明选用佐剂为白油佐剂，制备油包水乳剂。
在最终疫苗组合物中，佐剂的浓度范围是从10％到70％V/V，优选从30％到60％V/V，更优选60％V/V。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述的疫苗组合物还包括一种或多种以下抗原：鸡新城疫病毒抗原、禽流感病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原、鸡传染性法氏囊病毒抗原、减蛋综合征病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、大肠杆菌抗原、副鸡禽杆菌抗原、滑液囊支原体、鸡毒支原体抗原、多杀性巴氏杆菌抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、或鸡传染性喉气管炎病毒抗原。
本发明的疫苗组合物进一步包含其他病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括血清4型禽腺病毒感染的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。
术语“联合疫苗”用于指从本发明的血清4型禽腺病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指从病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的血清4型禽腺病毒可与鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、减蛋综合症病毒、禽呼肠孤病毒、禽腺病毒I群和/或大肠杆菌、副鸡禽杆菌、滑液囊支原体、鸡毒支原体混合或组合。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述鸡新城疫病毒抗原为鸡新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原，所述禽流感病毒抗原为H9亚型禽流感病毒SZ株灭活全病毒抗原，所述传染性支气管炎病毒抗原为传染性支气管炎病毒M41株灭活全病毒抗原，所述鸡传染性法氏囊病毒抗原为VP2蛋白抗原，所述减蛋综合征病毒抗原为鸡减蛋综合征AV-127株灭活全病毒抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述的疫苗组合物包括鸡胚源的所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原，含量为灭活前105.0～108.0EID50/0.1ml或细胞源的所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原，含量为灭活前105.0～108.0TCID50/0.1ml，所述鸡新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml；所述禽流感病毒灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml；所述传染性支气管炎病毒灭活全病毒抗原含量为灭活前106.0EID50/0.1ml；所述鸡传染性法氏囊病毒抗原为VP2蛋白抗原，抗原含量为AGP效价1:16，所述减蛋综合征病毒灭活全病毒抗原含量为灭活前107.0EID50/0.1ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述的疫苗组合物包括禽流感病毒抗原、禽腺病毒抗原，所述禽流感病毒抗原为H9亚型禽流感病毒SZ株灭活全病毒抗原，所述禽腺病毒抗原为禽腺病毒FAV-HN株灭活全病毒抗原，所述H9亚型禽流感病毒SZ株灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml，所述禽腺病毒FAV-HN株灭活全病毒抗原含量为灭活前105.0～108.0TCID50/0.1ml或灭活前105.0～108.0EID50/0.1ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述的疫苗组合物包括鸡新城疫病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原、禽腺病毒抗原，所述鸡新城疫病毒抗原为鸡新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原，所述鸡传染性支气管炎病毒抗原为鸡传染性支气管炎病毒M41株灭活全病毒抗原，所述禽腺病毒抗原为禽腺病毒FAV-HN株灭活全病毒抗原，所述鸡新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒M41株灭活全病毒抗原含量为灭活前106.0EID50/0.1ml，所述禽腺病毒FAV-HN株灭活全病毒抗原含量为灭活前105.0～108.0TCID50/0.1ml或灭活前105.0～108.0EID50/0.1ml。
本发明疫苗组合物还可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述疫苗组合物中，所述的疫苗组合物还包括药物，免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂。
优选地，免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。
为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
本发明还涉及一种预防和/或治疗血清4型禽腺病毒感染的疫苗组合物的制备方法，其中，所述方法包括：
步骤(1)培养增殖所述血清4型禽腺病毒；
步骤(2)灭活所述增殖的血清4型禽腺病毒；
步骤(3)加入佐剂，乳化。
本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和治疗禽腺病毒感染的药物中的应用。
作为本发明的一种实施方式，所述应用为所述的疫苗组合物在制备预防和治疗心包积液综合征的药物中的应用。
术语“预防”指通过其与血清4型禽腺病毒相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟；术语“治疗”指通过与血清4型禽腺病毒相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1血清4型禽腺病毒FAV-HN株的分离鉴定
对河南某白羽肉鸡场送检的发病鸡病料进行处理：取病鸡的部分肝组织，加入等量的含抗生素的PBS进行研磨，研磨液离心取上清，经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，37℃继续培养。接种后24小时之内死亡的鸡胚弃去，将接种后24～168小时死亡及168小时存活的鸡胚尿囊液收获。
取收获的尿囊液进行鉴定：
(1)血凝性鉴定：用1％鸡红细胞对收获的尿囊液样品进行血凝性检测。结果为阴性，显示样品无血凝活性。
(2)PCR鉴定：用核酸提取试剂盒提取样品核酸，使用禽腺病毒Hexon基因的特异性引物进行PCR扩增鉴定。结果显示，PCR扩增出了预期大小的条带。PCR产物送测序公司进行核苷酸序列测定，测序结果进行遗传进化分析。结果显示，该毒株的Hexon基因序列与血清4型禽腺病毒参考株高度同源，属血清4型。将该株禽腺病毒命名为FAV-HN株。
实施例2禽腺病毒(鸡胚源)灭活疫苗的制备
将禽腺病毒FAV-HN株种毒用灭菌生理盐水稀释10倍，经卵黄囊接种5～7日龄SPF鸡胚，每胚接种0.1ml，置37℃继续孵育。接种后24h内死胚弃去，24h～144h死胚及144小时存活胚的尿囊液及时收获。将所收获病毒液取小样进行无菌检验，并置于低温保存备用。无检合格后，将病毒液混合，并取样检测鸡胚半数感染量(EID50)。
鸡胚半数感染量(EID50)测定方法：将收获的禽腺病毒FAV-HN株病毒液用灭菌生理盐水进行10倍系列稀释：10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10，经绒毛尿囊膜途径接种9日龄SPF鸡胚，每个稀释度接胚5枚，每胚接种0.1ml。接种后置37℃继续培养。接种后24小时之内死亡的鸡胚弃去。接种后24～144小时死亡及144小时存活的鸡胚尿囊液分别收获进行DNA提取，并进行PCR检测。根据PCR检测结果进行感染判定，按照Reed-Muench法计算EID50。
无菌检验合格，混合病毒液的病毒含量达108.5EID50/0.1ml。将测定好效价的禽腺病毒液进行灭活，计量加入10％甲醛溶液(终浓度为0.1％)，充分混合，37℃灭活24小时。
按照表1组分配比，将灭活完全的病毒液徐徐加入到白油佐剂中，同时开动电机，以12000r/min乳化5～10分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。
表1禽腺病毒(鸡胚源)灭活疫苗配比
组分 疫苗1 疫苗2 疫苗3
FAV-HN株抗原(EID50/0.1ml) 105.0 106.5 108.0
油相比例(V/V) 60％ 60％ 60％
实施例3禽腺病毒(细胞源)灭活疫苗的制备
将禽腺病毒FAV-HN株毒种使用细胞维持液进行10倍稀释接种于已长成单层的鸡肝细胞培养瓶中，置37℃ CO2培养箱培养，每天观察细胞病变，72～96小时病变约80％时收获。并取样检测组织培养半数感染量(TCID50)。
组织培养半数感染量(TCID50)测定方法为：取收获的禽腺病毒FAV-HN株病毒液用灭菌PBS溶液进行10倍系列稀释：10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10，按0.1ml/孔接种于已长成单层的原代鸡胚肝细胞(CEL)培养板上。每个稀释度接种5孔，置37℃ CO2培养箱培养，每天观察细胞病变，逐日连续观察120h，根据是否出现特征性细胞病变进行感染判定，按照Reed-Muench法计算TCID50。
经测定，病毒液的病毒含量达108.5TCID50/0.1ml。将测定好效价的禽腺病毒液进行灭活，计量加入10％甲醛溶液(终浓度为0.1％)，充分混合，37℃灭活24小时。
按照表2组分配比，将灭活完全的病毒液徐徐加入到白油佐剂中，同时开动电机，以12000r/min乳化5～10分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。
表2禽腺病毒(细胞源)灭活疫苗配比
组分 疫苗4 疫苗5 疫苗6
FAV-HN株抗原(TCID50/0.1ml) 105.0 106.5 108.0
油相比例(V/V) 60％ 60％ 60％
实施例4 6种禽腺病毒疫苗效力试验
取21日龄的SPF鸡70只，分成7组，每组10只，第1组～第6组分别经颈部皮下注射注射免疫实施例2、实施例3制备的疫苗1～疫苗6，免疫剂量为0.3ml，第7组不免疫作为对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，用FAV-HN株病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表3。
表3 6种禽腺病毒疫苗效力试验结果
结果显示，对照组全部发病死亡，而6种疫苗(疫苗1～疫苗6)对免疫鸡均产生了较好的免疫保护效果(保护率与对照组差异显著)，免疫效果良好。表明以病毒含量不低于105.0TCID50/0.1ml的细胞培养病毒液，或病毒含量不低于105.0EID50/0.1ml的鸡胚培养病毒液，即可对鸡群提供有效的免疫保护。
实施例5鸡新城疫抗原的制备
取鸡新城疫病毒N7a株(新城疫病毒(基因Ⅶ型)N7a株(Newcastle Disease Virus(genotypeⅦ),strain N7a)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201545，保藏日期为2015年10月19日，保藏地址为中国武汉·武汉大学)，用灭菌生理盐水作适当稀释(10-4或10-5)接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置37℃继续孵育。选接种后48～120小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，测定病毒含量，为108.0EID50/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活16h，灭活完全后备用。
实施例6禽流感抗原的制备
取H9亚型禽流感病毒SZ株(公开于中国专利申请CN103789272A)毒种，用无菌生理盐水稀释至10-3(取病毒液0.1ml加入到0.9ml无菌生理盐水中，震荡混匀后依此再稀释2次)，经尿囊腔接种10日龄易感鸡胚(使用购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司的SPF种蛋自行孵化)，每胚0.1ml(含105EID50)。接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。至96小时，取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。将冷却后的鸡胚收获胚液。所收获病毒液取样，按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录7中方法，测定病毒含量，为108.5EID50/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活24h，灭活完全后备用。
实施例7传染性支气管炎抗原的制备
取传染性支气管炎病毒M41株(购自中国兽医药品监察所)，用灭菌生理盐水作适当稀释(10-2或10-3)接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育。选接种后24～48小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，测定病毒含量，为106.0EID50/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活16h，灭活完全后备用。
实施例8法氏囊抗原的制备
1.总RNA的提取
将感染鸡传染性法氏囊病病毒超强毒成都株的SPF鸡法氏囊用研磨器研磨。取200μL病料补加TE(10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0)至500μL，加入5μL蛋白酶K和10％(W/V)十二烷基磺酸钠(SDS)50μL，56℃水浴3小时。加入等体积苯酚/氯仿(1:1，V/V)抽提3次，等体积氯仿抽提一次。移出上清至另一1.5mL离心管，加入1/10体积的NaAc(3M,pH5.2)、等体积异丙醇，-20℃沉淀2小时。4℃、10000转/分离心15分钟，用75％乙醇洗一次。真空干燥，将RNA用无RNA酶去离子水0.5ml重新溶解。
2.VP2cDNA制备
根据VP2基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，每个引物的5’端包含一个方便将基因克隆到载体上的限制酶切位点。这对引物被用来进行RT-PCR扩增生成cDNA。合成寡聚核苷酸引物序列如下：
VP2-EcoR1-f：CCGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAAC
VP2-Sal1-r：ACGCGTCGACTTACCTTAGGGCCCGGATTATGT
3.含酶切位点的VP2片段扩增
对上述制备的VP2cDNA进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒回收，-20℃保存。
4.pColdⅢ质粒EcoRⅠ、SalⅠ双酶切
利用EcoRⅠ、SalⅠ对pColdⅢ质粒进行双酶切，形成具有粘性末端的连接片段，反应体系如下：
37℃水浴2h后，琼脂糖电泳回收1.7kb大小的目的片段。
5.目的基因片段的琼脂糖凝胶回收
从琼脂糖凝胶中切下含有目的条带的凝胶块，放入1.5ml离心管中，称重；每100mg琼脂糖凝胶加入300μl溶胶溶液；55℃温浴10min，至凝胶完全融化；取700μl融化的凝胶溶液转移至纯化柱中，10000g室温离心1min；将纯化柱放回收集管中，加入500μl洗涤缓冲液，10000g室温离心1min；弃去滤过液，纯化柱放回收集管，再次离心1min，再次离心1min，以除去残留的Washing Buffer；将纯化柱转移至1.5ml新的微量离心管中，在柱子中央加入30～50μl洗脱缓冲液，10000g室温离心1min。离心管中洗脱液即为回收的DNA。
6.酶连反应
取约10μl经过酶切和纯化的pColdⅢ载体，加入30μl的待插入片段；加入1μlT4DNA连接酶，漩涡混匀，室温离心数秒(反应体系：载体10μl、待插入片段30μl、10XLigation Buffer 5μl、双蒸水4μl、T4DNA ligase 1μl。)；20-25℃孵育连接2小时后可以取20μl直接转化大肠杆菌BL21(DE3)，并涂布在含有100μg氨苄青霉素LB固体培养基中培养过夜，长出的菌落即为阳性克隆，命名为pColdⅢ_VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株。挑取单克隆在含有100μg氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后，送Invitrogen公司测序分析，分析测序结果，与Genebank中登录号为KF021490.1VP2基因序列一致。
7.表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白生产用菌种制备
一级种子繁殖和鉴定：将pColdⅢ_VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株冻干菌种分别接种于加卡那霉素的LB液体培养基中，35～36℃培养24小时，然后划线接种于加卡那霉素的LB固体培养基上培养，选取符合标准的典型菌落10个混合于少量LB培养液中，接种于LB琼脂斜面若干支、置35～36℃培养20～24小时，作为一级种子。在2～8℃保存，不超过14日；在培养基上传代，应不超过4代。二级种子繁殖取一级种子接种于加卡那霉素的LB培养液中，35～36℃培养20～24小时。置2～8℃保存，不超过3日。
8.鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制备
用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的2％～4％接种二级种子液，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～1.0，加入0.2mol/Lα-乳糖，使终浓度达到0.02mol/L，再继续培养5～8h。开始小量通气，逐渐增大气量。
培养结束后，离心收集菌体。收集的菌体用PBS液清洗2次，将收集的菌体加适量PBS液进行重悬，在4℃下用超声波破碎。破碎后的菌液，3000r/min，离心30min，收集上清液。经硫酸铵沉淀后，收集VP2蛋白液随即进行灭活。
将上层的上清液中按比例加入10％的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.2％，然后将加入甲醛的上清液导入另一灭活罐内，37℃灭活12小时(以罐内液体温度达到37℃开始计时)，以灭活残存的大肠杆菌及毒素。
实施例9减蛋综合征抗原的制备
将鸡减蛋综合征AV-127株(购自中国兽医药品监察所)，用灭菌生理盐水比例稀释，尿囊腔接种10日龄易感鸭胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育，24小时前死亡的鸭胚弃去，此后每6～8小时照蛋1次，死亡的鸭胚随时取出，直至120小时，取出全部鸭胚，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时；然后无菌收获鸭胚尿囊液，测定病毒含量，为108.5EID50/0.1ml。加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔4～6h搅拌一次，灭活16h，灭活完全后备用。
实施例10血清4型禽腺病毒联合疫苗的制备
将实施例3制备的血清4型禽腺病毒(细胞源)抗原分别和实施例5制备的新城疫抗原、实施例6制备的禽流感抗原、实施例7制备的传染性支气管炎抗原、实施例8制备的传染性法氏囊抗原、实施例9制备的减蛋综合征抗原按比例混合，加入到白油佐剂中，同时开动电机，以12000r/min乳化5分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％。具体配比见表4。
表4血清4型禽腺病毒联合疫苗配比
实施例11血清4型禽腺病毒联合疫苗的效力试验
取3周龄的SPF鸡460只，分成46组，每组10只。
第1组～第12组分别经颈部皮下注射免疫实施例10制备的疫苗9～疫苗20，0.3ml/只；
第13组～第22组分别经颈部皮下注射免疫实施例10制备的疫苗9～疫苗18，20ul/只；
第23组～第28组分别经颈部皮下注射免疫实施例10制备的疫苗9、疫苗13、疫苗15、疫苗16、疫苗17、疫苗19，0.3ml/只；
第29组～第33组各点眼、滴鼻接种传染性支气管炎活疫苗(H120株)1羽份(0.05ml)。接种后21日，分别采血并分离血清。同时，各组经颈部皮下注射免疫实施例10制备的疫苗10、疫苗13、疫苗14、疫苗16、疫苗17，0.3ml/只。接种后28日，分别采血并分离血清；
第34组～第37组分别经颈部皮下注射免疫实施例10制备的疫苗11、疫苗15、疫苗17、疫苗20，0.3ml/只；
第38组～第40组经颈部皮下注射免疫实施例10制备的疫苗12、疫苗14、疫苗16，0.3ml/只；
第41组～第46组为不免疫对照组。
所有试验鸡均隔离饲养。
免疫后21日，将第1组～第12组免疫鸡，连同第41组对照鸡用FAV-HN株病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表5。
表5血清4型禽腺病毒联合疫苗禽腺病毒部分效力试验结果
结果显示，疫苗9～疫苗20免疫组在免疫后21天均能产生较好的免疫保护。表明本发明提供的血清4型禽腺病毒FAV-HN株，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。
免疫后21日，将第13组～第22组免疫鸡，连同第42组对照鸡，采血并分离血清。检测新城疫病毒HI抗体，同时用新城疫强毒HN1101株病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表6。
表6血清4型禽腺病毒联合疫苗新城疫部分效力试验结果
注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数。
结果显示，疫苗9～疫苗18组在免疫后21天均能产生较高的新城疫抗体，而且免疫组和对照相比，可以完全保护强毒的攻击。表明以本发明提供的N7a株新城疫病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。
免疫后21日，将第23组～第28组免疫鸡，连同第43组对照鸡，采血并分离血清。检测H9亚型禽流感HI抗体效价，同时用SZ株病毒液静脉注射攻击，每只0.2ml(含107.0EID50)。于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性；对照组应至少4只鸡病毒分离为阳性。结果见表7。
表7血清4型禽腺病毒联合疫苗禽流感部分效力试验结果
注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数。
结果显示，疫苗9、疫苗13、疫苗15、疫苗16、疫苗17、疫苗19在免疫后21天均能产生较高的禽流感抗体，而且免疫组和对照相比，可以完全保护强毒的攻击。表明本发明提供的H9亚型禽流感病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。
第29～第33组免疫鸡在活苗首免后21日、灭活苗免后28日两次采集的血清(第44组对照鸡同样时间采集血清)测HI抗体效价。免疫组二免血清HI抗体效价几何平均值不低于首免血清HI抗体效价几何平均值的4倍，未免疫对照组血清HI抗体效价的几何平均值不高于1:8(微量法)。同时用鸡传染性支气管炎M41强毒每羽滴鼻攻毒103.0EID50，作攻毒实验。结果见表8。
表8 血清4型禽腺病毒联合疫苗传染性支气管炎部分效力试验结果
结果显示，疫苗10、疫苗13、疫苗14、疫苗16、疫苗17二免血清HI抗体效价几何平均值均不低于首免血清HI抗体效价几何平均值的4倍，攻毒后全部免疫鸡的气管内未分离出病毒，可以完全保护强毒的攻击。表明本发明提供的的传染性支气管炎病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。
免疫21日，第34组～第37组，每只点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85((CVCC AV7株)购于中国兽医药品监察所)株病毒液0.1ml(实含毒量≥100个BID)。攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至72～96小时，扑杀存活鸡，逐只解剖，观察法氏囊等病变。免疫鸡应至少8只正常，不出现法氏囊病变；对照鸡应至少4只鸡发病，出现明显的法氏囊病变(如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变)。结果见表9。
表9血清4型禽腺病毒联合疫苗法氏囊部分效力试验结果
结果显示，疫苗11、疫苗15、疫苗17、疫苗20在免疫后21天，可以完全保护鸡传染性法氏囊病强毒的攻击。
免疫21日，第38组～第40组采血，测定减蛋综合征HI抗体效价，免疫鸡HI抗体几何平均效价应≥7log2，对照鸡HI抗体效价应≤2log2。结果见表10。
表10血清4型禽腺病毒联合疫苗减蛋综合征部分效力试验结果
注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数。
结果显示，疫苗12、疫苗14、疫苗16在免疫后21天均能产生较高的减蛋综合征抗体，可有效保护鸡群产蛋综合征的发生。
证明了本发明提供的血清4型型禽腺病毒联合疫苗能够抵抗相关病原的侵袭，显示出良好的免疫原性，可有效控制我国禽腺病毒相关疾病的流行。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.血清4型禽腺病毒FAV-HN株，保藏号为：CCTCC NO.V201609。
2.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的权利要求1所述的禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的抗原和药学上可以接受的载体；其中，所述的禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的抗原包括灭活抗原、活的减毒的全病毒抗原、亚单位抗原或合成肽抗原。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括鸡胚源的所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原，含量为灭活前≥105.0EID50/0.1ml；优选地，所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前105.0～108.0EID50/0.1ml；更优选地，所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前106.5EID50/0.1ml。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括细胞源的所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原，含量为灭活前≥105.0TCID50/0.1ml；优选地，所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前105.0～108.0TCID50/0.1ml；更优选地，所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原含量为灭活前106.5TCID50/0.1ml。
5.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可以接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；
优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；
优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其特别是L121))；
优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；
优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；
优选地，佐剂为白油佐剂；
佐剂的浓度范围是从10％到70％V/V，优选从30％到60％V/V，更优选60％V/V。
6.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述的疫苗组合物还包括一种或多种以下抗原：鸡新城疫病毒抗原、禽流感病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原、鸡传染性法氏囊病毒抗原、减蛋综合征病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、大肠杆菌抗原、副鸡禽杆菌抗原、滑液囊支原体、鸡毒支原体抗原、多杀性巴氏杆菌抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、或鸡传染性喉气管炎病毒抗原。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述鸡新城疫病毒抗原为鸡新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原，所述禽流感病毒抗原为H9亚型禽流感病毒SZ株灭活全病毒抗原，所述传染性支气管炎病毒抗原为传染性支气管炎病毒M41株灭活全病毒抗原，所述鸡传染性法氏囊病毒抗原为VP2蛋白抗原，所述减蛋综合征病毒抗原为鸡减蛋综合征AV-127株灭活全病毒抗原。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，所述的疫苗组合物包括鸡胚源的所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原，含量为灭活前105.0～108.0EID50/0.1ml或细胞源的所述禽腺病毒FAV-HN株或其培养物的灭活抗原，含量为灭活前105.0～108.0TCID50/0.1ml，所述鸡新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml，所述禽流感病毒灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml；所述传染性支气管炎病毒灭活全病毒抗原含量为灭活前106.0EID50/0.1ml；所述鸡传染性法氏囊病毒抗原为VP2蛋白抗原，抗原含量为AGP效价1:16，所述减蛋综合征病毒灭活全病毒抗原含量为灭活前107.0EID50/0.1ml；
优选地，所述的疫苗组合物包括禽流感病毒抗原、禽腺病毒抗原，所述禽流感病毒抗原为H9亚型禽流感病毒SZ株灭活全病毒抗原，所述禽腺病毒抗原为禽腺病毒FAV-HN株灭活全病毒抗原，所述H9亚型禽流感病毒SZ株灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml，所述禽腺病毒FAV-HN株灭活全病毒抗原含量为灭活前105.0～108.0TCID50/0.1ml或灭活前105.0～108.0EID50/0.1ml；
优选地，所述的疫苗组合物包括鸡新城疫病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原、禽腺病毒抗原，所述鸡新城疫病毒抗原为鸡新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原，所述鸡传染性支气管炎病毒抗原为鸡传染性支气管炎病毒M41株灭活全病毒抗原，所述禽腺病毒抗原为禽腺病毒FAV-HN株灭活全病毒抗原，所述鸡新城疫病毒N7a株灭活全病毒抗原含量为灭活前108.0EID50/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒M41株灭活全病毒抗原含量为灭活前106.0EID50/0.1ml，所述禽腺病毒FAV-HN株灭活全病毒抗原含量为灭活前105.0～108.0TCID50/0.1ml或灭活前105.0～108.0EID50/0.1ml。
9.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中，所述的疫苗组合物还包括药物，免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；优选地，免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。
10.根据权利要求2～9任一项所述疫苗组合物在制备预防和治疗禽腺病毒感染的药物中的应用；优选地，所述疫苗组合物在制备预防和治疗心包积液综合征的药物中的应用。
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