CN108653725B - 一种用于预防禽减蛋综合征的疫苗组合物、及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的禽减蛋综合征病毒Penton蛋白或免疫量的含有重组禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因的活载体，以及兽医学上可接受的载体。该疫苗组合物可有效保护鸡群产蛋综合征的发生，且能针对不同地域的禽减蛋综合征病毒野毒株进行完全保护。

Description

一种用于预防禽减蛋综合征的疫苗组合物、及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于预防禽减蛋综合征的疫苗组合物、制备方法和应用。

背景技术

禽减蛋综合征(Egg drop syndrome,EDS)是由禽减蛋综合征病毒(Egg dropsyndrome virus,EDSV)引起的以禽产蛋下降，以及产畸形蛋为主要特征的传染病，常发生于禽产蛋高峰期，给蛋禽养殖带来了巨大经济损失。

EDSV属于禽腺病毒Ⅲ群，具有典型的腺病毒形态，无囊膜，具有红细胞凝集活性，在禽输卵管中增殖。病毒基因组为约33kb的线状双股DNA，血清型单一，毒株之间抗原性无明显差异。病毒颗粒由结构蛋白构成，核衣壳直径70～80nm，呈二十面体对称，DNA被包于衣壳内。核衣壳由252个壳粒组成，其中240个是六邻体(Hexon蛋白)，构成二十面体的20个面以及棱的大部分。这些壳粒呈棱柱状，宽7nm，长11nm。另外12个是五邻体(Penton蛋白)，分别位于二十面体的12个顶角上。每个Penton蛋白有一条纤维突起(Fiber蛋白)。

禽减蛋综合征是当前世界范围内严重危害家禽养殖业发展的重要疾病之一。在各种防控措施中，疫苗免疫仍为最重要的措施。目前养禽业中普遍使用的EDS灭活疫苗是基于鸭胚增殖的病毒灭活后与矿物油佐剂乳化而成的疫苗。但是，由于禽减蛋综合征病毒在鸭胚上培养难以获得高滴度的病毒，导致制备的疫苗往往难以提供理想的免疫效果；此外，该病毒抗原的生产方式完全依赖于鸭种蛋，在禽流感等传染病发生时，鸭种蛋供应困难，严重影响禽减蛋综合征的防控。另外全病毒疫苗生产过程中还存在病毒灭活不完全造成的生物安全方面的风险。

亚单位疫苗是近几年发展起来的一种比较切实可行的新型基因工程疫苗，禽减蛋综合征亚单位疫苗研究以Hexon(240/252)为主要研究对象，然而一直以来，免疫效力低下，未开发成产品。现有技术中还没有制备出用于疫苗的免疫原性良好的蛋白。至今未有禽减蛋综合征亚单位疫苗上市。因此，临床上急需开发出免疫效果好的亚单位疫苗组合物，能够有效防止该病的流行，且能避免鸭种蛋供应波动的影响。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供一种禽减蛋综合征病毒免疫原性蛋白、及其制备的疫苗组合物及其制备方法以及应用，该疫苗组合物能够有效预防禽减蛋综合征病毒的感染。

本发明涉及一种用于预防禽减蛋综合征的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的所述的禽减蛋综合征病毒抗原以及兽医学上可接受的载体；其中，所述禽减蛋综合征病毒抗原包括蛋白抗原或含有重组有所述禽减蛋综合征病毒免疫原性蛋白基因的活载体。

本发明还涉及一种制备所述疫苗组合物的方法，所述制备方法包括：步骤(1)克隆所述禽减蛋综合征病毒蛋白基因；步骤(2)转化重组所述步骤(1)中克隆的蛋白基因；步骤(3)表达所述重组的禽减蛋综合征病毒蛋白；步骤(4)分离纯化所述重组的禽减蛋综合征病毒蛋白，使用非离子表面活性剂处理所述纯化的重组的禽减蛋综合征病毒蛋白；步骤(5)将所述禽减蛋综合征病毒蛋白抗原与佐剂按比例混合，乳化。

本发明还涉及所述的疫苗组合物在制备预防和治疗禽减蛋综合征病毒感染的药物中的应用。

本发明首次采用禽减蛋综合征病毒Penton蛋白，选取的禽减蛋综合征病毒蛋白基因高效表达后，制备疫苗组合物，可预防或治疗禽减蛋综合征疫情蔓延，并且含有该蛋白的疫苗组合物免疫动物后能使动物机体快速产生抗体，对当前流行的禽减蛋综合征病毒单独或混合感染有良好的预防和控制效果，生物安全性好。

本发明禽减蛋综合征病毒Penton蛋白制备的疫苗组合物，其免疫原性好，能对鸡和鸭产生完全攻毒保护，能有效对多种地域来源的野毒株进行预防，也即在临床应用上能对禽减蛋综合征病毒的感染、蔓延进行预防。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

术语“禽减蛋综合征病毒”(Egg Drop Syndrome Virus,EDSV)属于禽腺病毒Ⅲ群，基因组为双股DNA。所引发的临床症状包括使蛋鸡产软壳、薄壳、无壳蛋，产蛋率严重下降。病理变化以卵巢静止不发育和输卵管萎缩为特征。

本发明涉及一种用于预防禽减蛋综合征的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的禽减蛋综合征病毒抗原以及兽医学上可接受的载体；所述禽减蛋综合征病毒抗原为Penton蛋白抗原或重组有所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因的活载体。

本发明首次发现，在禽减蛋综合征病毒壳粒表面含量极少的Penton蛋白具有良好的免疫原性，其制备的亚单位抗原或含有其重组基因的活载体均能在免疫后产生良好的免疫效力，对鸡和鸭提供100％的保护。

术语“疫苗组合物”指含有禽减蛋综合征病毒免疫原性的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强鸡、鸭只针对禽减蛋综合征病毒的免疫反应。

术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试动物的临床征兆如产蛋量的减少、畸形蛋数量的增加、受试动物总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

术语“禽减蛋综合征病毒抗原”是指至少含有一种禽减蛋综合征病毒抗原形式的任何组合物，所述禽减蛋综合征病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗禽减蛋综合征病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、减毒的或亚单位的抗原。

本发明所述的禽减蛋综合征病毒Penton蛋白抗原可以是重组表达的Penton蛋白亚单位抗原，其表达体系可以为原核表达系统、真核表达系统，也可以是通过人工合成的合成肽抗原。

“亚单位抗原”指的是利用基因工程方法将病原体的保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的抗原。它比全病毒抗原引起副反应的可能性小。

“合成肽抗原”指的是一种仅含免疫决定簇组分的小肽,即用人工方法按天然蛋白质的氨基酸顺序合成保护性短肽,与载体连接后加佐剂所制成的抗原。

“活载体”指的是非致病微生物通过基因工程的方法使之携带并表达某种抗原或抗原决定簇的基因，产生免疫原性，非致病微生物可以是细菌和病毒，病毒活载体常作为载体的病毒有痘苗病毒、禽痘病毒、火鸡疱疹病毒、腺病毒、伪狂犬病毒、反转录病毒、慢病毒；细菌活载体可以是减毒沙门菌、卡介苗、减毒单核细胞李氏杆菌、减毒霍乱弧菌、减毒志贺氏菌、乳酸球菌、芽胚乳酸杆菌、高氏链球菌。

作为本发明的一种实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述的禽减蛋综合征病毒Penton蛋白为SEQ.ID NO 1所示的核苷酸序列编码的蛋白。

作为本发明的一种实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述的禽减蛋综合征病毒Penton蛋白其编码基因具有SEQ.ID NO 1所示的核苷酸序列或其简并序列。

作为本发明的一种实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白抗原含量为≥10.2μg/ml。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白抗原含量为10.2μg/ml～40.8μg/ml。

作为本发明的一种更优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白抗原含量为20.4μg/ml～30.6μg/ml。

本发明所述的疫苗组合物中，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白抗原含量范围还可以选自10.2μg/ml～20.4μg/ml，或10.2μg/ml～30.6μg/ml，或20.4μg/ml～40.8μg/ml，或30.6μg/ml～40.8μg/ml。

作为本发明的一种实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述重组有禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因的活载体为重组减毒沙门氏菌、重组新城疫病毒、重组痘病毒。

本发明的活载体疫苗组合物因为兼具有灭活疫苗和活疫苗的优点，在免疫效力上可以保证能够对产蛋禽进行保护，且其免疫效力强，可以不添加佐剂。

本发明的禽减蛋综合征病毒Penton基因还可以应用于表达载体、核酸疫苗、诊断试剂开发以及其他预防和/或治疗禽减蛋综合征病毒相关药物开发。

本发明涉及一种重组载体，所述重组载体能表达本发明所述的核苷酸序列编码的Penton蛋白，其具有免疫原性并能产生免疫反应。

本发明涉及一种转化子，所述转化子包含有导入的本发明所述的表达Penton蛋白的重组载体。

术语“兽医学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除禽腺病毒抗原之外的其他所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。

作为本发明的一种实施方式，所述的兽医学上可接受的载体包括药物，免疫刺激剂、抗氧化剂、表面活性剂、着色剂、挥发性油、缓冲剂、分散剂、推进剂和防腐剂；所述免疫刺激剂包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)。

本发明疫苗组合物可以进一步将其他的试剂加入到本发明的组合物。

为了制备这样的组合物，可以使用本领域公知的方法。

术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如Quil A、QS-21(CambridgeBiotech Incorporation,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica PharmaceuticalsIncorporation，Birmingham AL)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(European Pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants》(Ed.by DES Stewart-Tull,John Wiley and Sons,New York,1995:51-94)和Todd等编写的《Vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用Powell M和Newman M编写的《Vaccinedesign,the Subunit and adiuvant approach》(Plenum Press,1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(Carbomer，商品名Carbopol)(Phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利US2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(BFGoodrich,Ohio,USA)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，RIBI佐剂系统(Ribi Incorporation)、Block co-polymer(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A)、Avridine 脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。

作为本发明的一种实施方式，所述兽医学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括：(1)铝胶佐剂、皂苷、阿夫立定、DDA；(2)油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂；或(3)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物；以及RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS 1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂中的一种或几种；

优选地，皂苷为Quil A、QS-21、GPI-0100；

优选地，乳剂为SPT乳剂、MF59乳剂，或乳剂由油与乳化剂组合形成，乳剂可基于轻液体石蜡油、因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(如角鲨烷或角鲨烯油，烯烃，特别是异丁烯或癸烯低聚化产生的油)、酸或醇的含线性烷基的酯(更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯)、支链脂肪酸或醇的酯(尤其异硬脂酸酯)；乳化剂为非离子表面活性剂(尤其聚氧乙烯化脂肪酸(例如油酸)的酯、山梨聚糖的酯、二缩甘露醇的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇的酯、甘油的酯、聚甘油的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，上述酯可经乙氧基化、脂肪醇和多元醇(例如油醇)的醚、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其

特别是L121))；

优选地，丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖的聚链烯基醚或聚醇交联的化合物卡波姆、优选为卡波普974P、934P和971P；

优选地，顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物EMA；

优选地，所述佐剂为白油佐剂，制备油包水乳剂；

所述佐剂的浓度范围是从5％到70％V/V，优选从30％到70％，更优选66％V/V。

本发明的疫苗组合物进一步包含其他病原体或抗原组合，以制备抵抗包括禽减蛋综合征病毒感染的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。

术语“联合疫苗”指本发明的禽减蛋综合征病毒抗原与至少一种不同病毒的抗原混合物制备的疫苗。术语“复合疫苗”指本发明的禽减蛋综合征病毒抗原和细菌抗原制备的疫苗。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物还包括以下抗原的一种或多种：鸡新城疫病毒抗原、禽流感病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原、鸡传染性法氏囊病病毒抗原、禽腺病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、大肠杆菌抗原、副鸡禽杆菌抗原、滑液囊支原体抗原、鸡毒支原体抗原、多杀性巴氏杆菌抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、鸡传染性喉气管炎病毒抗原。

作为本发明的一种实施方式，所述疫苗组合物还包括由以下抗原组成的组中的一种或多种：鸡新城疫病毒灭活抗原、禽流感病毒灭活抗原、鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原、鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原、禽腺病毒灭活抗原或亚单位抗原。作为本发明的一种优选实施方式，所述鸡新城疫病毒灭活抗原为N7a株灭活抗原、所述禽流感病毒灭活抗原为SZ株灭活抗原、所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原为M41株灭活抗原、所述鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原为鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白、所述禽腺病毒灭活抗原为FAV-HN株灭活抗原、所述禽腺病毒亚单位抗原为禽腺病毒Penton蛋白或Fiber-2蛋白。

作为本发明的一种实施方式，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白含量为10.2～40.8μg/ml，所述鸡新城疫病毒灭活抗原含量为灭活前10^8.0～10^9.0EID₅₀/0.1ml，所述禽流感病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.5～10^8.5EID₅₀/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.0～10^7.0EID₅₀/0.1ml，所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白含量为AGP效价1:16～1:128，所述禽腺病毒Penton蛋白含量为AGP效价1:2～1:16，所述禽腺病毒Fiber-2蛋白含量为AGP效价1:2～1:16。

作为本发明的一种优选实施方式，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白含量为10.2～40.8μg/ml，所述鸡新城疫病毒灭活抗原含量为灭活前10^8.0EID₅₀/0.1ml，所述禽流感病毒灭活抗原含量为灭活前10^8.0EID₅₀/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.0EID₅₀/0.1ml，所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白含量为AGP效价1:16，所述禽腺病毒Penton蛋白含量为AGP效价1:4，所述禽腺病毒Fiber-2蛋白含量为AGP效价1:4。

本发明的Penton蛋白可以通过本领域内任何已知的方法制备，例如可以通过重组表达Penton基因制备Penton蛋白，表达系统可以使用任何已知的表达系统，例如：真核表达系统、原核表达系统。或者直接合成Penton蛋白。真核表达系统可以包括哺乳动物细胞表达，酵母表达系统和昆虫表达系统。

本发明还涉及一种制备所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)克隆所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因，并将所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因重组到表达载体以获得含有所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因的重组表达载体；步骤(2)将所述含有所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因的重组表达载体和分子伴侣的表达载体一同转化大肠杆菌，表达所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白；步骤(3)将所述表达的禽减蛋综合征病毒Penton蛋白使用非离子表面活性剂处理除去内毒素；以及步骤(4)将所述去除内毒素的禽减蛋综合征病毒Penton蛋白与佐剂混匀，得到所述疫苗组合物。

作为本发明的一种实施方式，在所述的制备所述疫苗组合物的方法中，所述步骤(1)中所述含有禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因的重组表达载体为重组pET28a质粒，所述步骤(2)中所述分子伴侣的表达载体为pG-Tf2，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；所述步骤(3)中非离子表面活性剂为Triton X-114。本发明还涉及所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗禽减蛋综合征的药物中的应用。

本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗禽减蛋综合征病毒感染的药物中的应用。

本发明所述的制备预防和治疗禽减蛋综合征病毒感染的药物其施用对象包括鸡或鸭。

术语“预防和/或治疗”在涉及禽减蛋综合征病毒感染时是指抑制禽减蛋综合征病毒的复制、抑制禽减蛋综合征病毒的传播或防止禽减蛋综合征病毒在其宿主体内定居，以及减轻禽减蛋综合征病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 pET28a-EDSV-Penton表达载体的构建

1、EDSV病毒DNA的提取

质粒提取试剂盒购自天根生物；T4 DNA Ligase购自BioLab；pET28a质粒购自Novagen；琼脂糖凝胶胶回收试剂盒购自天泽生物，其他试剂均为分析纯。

按照病毒DNA提取试剂盒说明书，取0.2ml禽减蛋综合征病毒液于无菌1.5ml离心管中，加0.4ml VB于样品液中，旋涡混匀，室温静置10分钟。加0.45ml AD buffer于样品液中，用力混匀。将VB柱放入2ml收集管中，取0.6ml混合液加入VB柱中，14000g离心1分钟，将剩余的混合液加入VB柱中，14000g离心1分钟，弃掉2ml收集管，将VB柱放入新的2ml收集管中，加入0.4ml W1buffer，14000g离心30秒，加0.6ml Wash buffer于VB柱，14000g离心30秒，然后不加buffer再空离3分钟，将VB柱放入新的1.5mlEP管中，加入50μl RNase freewater置膜中央，静置3分钟，14000g离心1分钟，离心的液体即为DNA基因组。

2、Penton基因扩增

根据Penton基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，进行PCR。引物序列见表1。

表1 Penton基因扩增引物

Penton-F	atggagtcttttgtgccgccgcctc
		Penton-R	ttattgcaaagtagcgctagaaatc

将PCR产物送Invitrogen公司测序，根据测序结果对Penton基因进行密码子优化，优化后的Penton基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

3、表达载体构建

优化后Penton基因送苏州金唯智生物科技有限公司进行全序列合成，并连接到pET28a质粒上。连接后的质粒和分子伴侣质粒pG-Tf2共转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，阳性克隆即为pET28a-EDSV-Penton/pG-Tf2表达菌株。

实施例2 Penton蛋白的制备

将含有实施例1中制备的pET28a-EDSV-Penton/pG-Tf2/E.Coli BL21(DE3)菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的LB培养基中，同时LB培养基中含有5-10ng/ml四环素用于分子伴侣蛋白的诱导表达，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD₆₀₀＝0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1～1.0mM，28℃振荡培养24小时。培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH 7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。表达产物中可溶性目的蛋白含量较高，可溶性Penton蛋白表达量可达菌体蛋白总量的45％，内毒素含量为0.23×10⁵EU/ml。

实施例3 大肠杆菌表达Penton蛋白内毒素清除

1.5ml离心管中加入0.5ml待处理溶液和终浓度为1％(v/v)的曲拉通X-114(Triton X-114)(5μl)，涡旋振荡。样品在冰上放置5分钟。涡旋振荡冷却的样品后，离心管立即放入37℃水浴中温浴5min，使得产生新的两相。然后，把样品在37℃离心60s。离心过后，目的蛋白将留在上层，而含有内毒素的洗涤剂将会以油滴的形状残留在离心管底部。整个去除内毒素的操作循环3次。经测定，蛋白纯度没有降低，内毒素含量下降为0.007×10⁵EU/ml。

结果表明Triton X-114能够清除重组蛋白中残留的内毒素，且对蛋白的纯度没有影响。

实施例4 禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗的制备

将按实施例3的方法纯化后的Penton蛋白缓缓加入到白油佐剂中，同时开动电机，17500r/min搅拌5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，具体配比见表2。

表2 禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗配比

组分	疫苗1	疫苗2	疫苗3	疫苗4
					Penton蛋白(μg/ml)	10.2	20.4	30.6	40.8
白油佐剂(V/V％)	66％	66％	66％	66％

实施例5 禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗安全性试验

取21日龄的SPF鸡75只，每组15只，第1组～第4组分别经颈部皮下注射免疫实施例4制备的疫苗1～疫苗4，免疫剂量为1.0ml，第5组皮下注射1.0ml生理盐水，作为空白对照。相同条件下饲养，从免疫后第3周开始观察3周各组的临床症状、增重率、死亡率，在3周、4周、5周各解剖5只，观察接种部位是否形成肉眼病变。结果显示(见表3、表4)，疫苗1～疫苗4接种组中未看到临床症状和死亡，此外接种组和空白对照组的增重率未表现出明显的差异，也未见有肉芽肿形成，表明本发明制备的禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗用于免疫鸡是安全的，且对增重无影响。

表3 禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗安全性试验临床症状和死亡情况

表4 禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗安全性试验鸡只体重变化和肉芽肿形成情况

实施例6 禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗对SPF鸡免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡50只，分成5组，每组10只，第5组～第8组分别经颈部皮下注射免疫实施例4制备的疫苗1～疫苗4，免疫剂量为0.5ml，第9组颈部皮下注射0.5ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫前及免疫后21日，每只鸡分别采血，分离血清，测定血清中禽减蛋综合征中和抗体效价。测定结果见表5。

表5 禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗对SPF鸡免疫原性试验结果

结果显示，第9组对照组免后21日抗体中和效价为0，而第5组～第8组免疫组鸡均产生了较高的中和抗体，免疫效果良好。表明禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗中蛋白含量不低于10.2μg/ml即可使鸡群产生较高中和抗体效价，可实现对鸡群提供有效的免疫保护。

实施例7 禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗对樱桃谷鸭免疫原性试验

取42日龄的樱桃谷鸭50只，分成5组，每组10只，第10组～第13组分别经颈部皮下注射免疫实施例4制备的疫苗1～疫苗4，免疫剂量为0.5ml，第14组颈部皮下注射0.5ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸭均隔离饲养，免疫前及免疫后21日，每只鸭分别采血，分离血清，测定血清禽减蛋综合征中和抗体效价。测定结果见表6。

表6 禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗对樱桃谷鸭免疫原性试验结果

结果显示，第14组对照组鸭免后21日抗体中和效价为0，而第10组～第13组免疫组鸭均产生了较高的中和抗体，免疫效果良好。表明禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗中蛋白含量不低于10.2μg/ml即可使免疫鸭产生较高中和抗体效价，本发明的Penton蛋白抗原免疫原性好，以低含量即可实现对鸭群有效的免疫保护。

实施例8 禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗对蛋鸡免疫原性试验

取120日龄的海兰褐商品蛋鸡50只，分成5组，每组10只，第15组～第18组分别经颈部皮下注射注射免疫实施例4制备的疫苗1～疫苗4，免疫剂量为0.5ml，第19组颈部皮下注射0.5ml生理盐水，作为空白对照。免疫前及免疫后21日，每只鸡分别采血，分离血清，测定血清禽减蛋综合征中和抗体效价。当产蛋率达90％左右时(免疫后6周)，所有5组试验鸡均用AV 127株强毒攻击，每只口服10倍稀释毒1ml，病毒含量为10^6.5EID₅₀，攻毒后观察6周，观察鸡群采食、精神、粪便等状况，记录产蛋数量，计算产蛋率。结果见表7。

表7 禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗对蛋鸡的免疫原性试验结果

结果显示，第19组对照组免后21日禽减蛋综合征中和抗体效价为0，攻毒后产蛋开始下降，攻毒后第3周产蛋率从攻毒前的91.7％左右下降到45.8％，同时蛋壳颜色变淡，产软壳蛋、无壳蛋等；攻毒后第6周产蛋率恢复至69.8％，仍未恢复到正常水平。而第15组～第18组免疫鸡均产生了较高效价的禽减蛋综合征中和抗体，且攻毒后产蛋率几乎没有变化，表明禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗中蛋白含量不低于10.2μg/ml即可使商品蛋鸡产生较高中和抗体效价，本发明的Penton蛋白抗原免疫原性好，以低含量即可对鸡群提供有效的免疫保护，产蛋率不受禽减蛋综合征病毒感染的影响。

实施例9 禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗广谱性保护试验

取120日龄的海兰褐商品蛋鸡100只，分成10组，每组10只，第20组～第24组分别经颈部皮下注射注射免疫实施例4制备的疫苗1，免疫剂量为0.5ml，第25组～第29组分别颈部皮下注射0.5ml生理盐水。免疫前及免疫后21日，每只鸡分别采血，分离血清，测定血清中禽减蛋综合征中和抗体效价。当产蛋率达90％左右时(免疫后6周)，第20组、第25组试验鸡用新近从河南分离的禽减蛋综合征病毒HN09株强毒攻击；第21组、第26组试验鸡用新近从山东分离的禽减蛋综合征病毒SD02株强毒攻击；第22组、第27组试验鸡用新近从广东分离的禽减蛋综合征病毒GD04株强毒攻击；第23组、第28组试验鸡用新近从辽宁分离的禽减蛋综合征病毒LN02株强毒攻击；第24组、第29组试验鸡用新近从四川分离的禽减蛋综合征病毒SC01株强毒攻击；每只均口服10倍稀释毒1ml，病毒含量为10^6.5EID₅₀；攻毒后观察6周，观察鸡群采食、精神、粪便等状况，记录产蛋数量，计算产蛋率。结果见表8。

表8 禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗广谱性保护试验结果

结果显示，第25组～第29组对照组免后21日禽减蛋综合征中和抗体效价为0，攻毒后产蛋开始下降，攻毒后第3周产蛋率从攻毒前的90.4％～90.7％下降到43.8％～45.2％，同时蛋壳颜色变淡，产软壳蛋、无壳蛋等；攻毒后第6周产蛋率恢复至65.0％～68.8％，仍未恢复到正常水平。而第20组～第24组免疫鸡均产生了较高效价的禽减蛋综合征中和抗体，且攻毒后产蛋率几乎没有变化，表明本发明禽减蛋综合征病毒Penton蛋白亚单位疫苗中蛋白含量不低于10.2μg/ml即可使商品蛋鸡产生较高中和抗体效价，且抗原具有广谱性，能针对不同地域来源的禽减蛋综合征病毒对鸡的攻毒提供有效的免疫保护，产蛋率不受禽减蛋综合征病毒感染的影响。

实施例10 鸡新城疫抗原的制备

取新城疫病毒(基因Ⅶ型)，N7a株(Newcastle Disease Virus(genotypeⅦ)，strain N7a)(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201545，保藏日期为2015年10月19日，保藏地址为中国武汉·武汉大学)，用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-4或10^-5)接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置37℃继续孵育。选接种后48～120小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，测定病毒含量，为10^8.0EID₅₀/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，期间每隔4～6小时搅拌一次，灭活16小时，灭活完全后备用。

实施例11 禽流感抗原的制备

取H9亚型禽流感病毒SZ株(公开于中国专利申请CN103789272A)毒种，用无菌生理盐水稀释至10^-3(取病毒液0.1ml加入到0.9ml无菌生理盐水中，震荡混匀后依此再稀释2次)，经尿囊腔接种10日龄易感鸡胚(使用购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司的SPF种蛋自行孵化)，每胚0.1ml(含10⁵EID₅₀)。接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。至96小时，取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。将冷却后的鸡胚收获胚液。测定病毒含量，为10^8.5EID₅₀/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放37℃灭活，其间每隔4～6小时搅拌一次，灭活24小时，灭活完全后备用。

实施例12 鸡传染性支气管炎抗原的制备

取鸡传染性支气管炎病毒M41株(购自中国兽医药品监察所)，用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-2或10^-3)接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育。选接种后24～48小时死亡和存活鸡胚，收获尿囊液，测定病毒含量，为10^6.0EID₅₀/0.1ml。加入终浓度为0.1％的甲醛溶液(v/v)，放置于37℃灭活，其间每隔4～6小时搅拌一次，灭活16小时，灭活完全后备用。

实施例13 法氏囊抗原的制备

1.VP2 cDNA制备

按病毒RNA提取试剂盒操作从感染鸡传染性法氏囊病病毒超强毒成都株的SPF鸡法氏囊中提取IBDV病毒RNA，并用随机引物进行逆转录。根据VP2基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，合成寡聚核苷酸引物序列见表9，并进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒回收，-20℃保存。

表9 法氏囊病毒VP2基因扩增引物

VP2-EcoR1-F	CCGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAAC
		VP2-Sal1-R	ACGCGTCGACTTACCTTAGGGCCCGGATTATGT

2.pColdⅢ-VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株的构建

取上述制备的VP2 cDNA，进行双酶切，并将酶切后的片段连接到pColdⅢ载体上；连接产物直接转化大肠杆菌BL21(DE3)，并涂布在含有100μg氨苄青霉素LB固体培养基中培养过夜，长出的菌落即为pColdⅢ-VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株。

3.鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制备

用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的2％～4％接种pColdⅢ-VP2/E.Coli BL21(DE3)菌株种子液，37℃培养，待菌液的OD₆₀₀值达到0.6～1.0，加入0.2mol/Lα-乳糖，使终浓度达到0.02mol/L，再继续培养5～8h。

培养结束后，离心收集菌体，重悬，超声波破碎，离心收集上清液。经硫酸铵沉淀后，收集VP2蛋白液。

实施例14 禽腺病毒抗原的制备

1.Fiber-2 cDNA制备

按病毒RNA提取试剂盒操作从感染禽腺病毒FAV-HN株(禽腺病毒，FAV-HN株(Fowlaviadenovirus,strain FAV-HN)，保藏号为：CCTCC NO.V201609，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2016年2月29日)中提取FADV病毒DNA。根据Fiber-2基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，合成寡聚核苷酸引物序列见表10，并进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒回收，-20℃保存。

表10 禽腺病毒Fiber-2基因扩增引物

Fiber-2-F	CTCCGGGCCCCTAAAAG
		Fiber-2-R	CGGGACGGAGGCCGC

2表达载体构建

优化后Fiber-2基因送由苏州金唯智生物科技有限公司进行全序列合成，并分别连接到pET28a质粒上。连接后的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，阳性克隆既为pET28a-FADV-Fiber-2表达菌株。

3Fiber-2蛋白的制备

将含有实施例1中制备的pET28a-FADV-Fiber-2/E.Coli BL21(DE3)菌株接种到含50-100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，接种量为1％(V/V)，37℃振荡培养。当OD₆₀₀值达到0.4～0.6时，于28℃放置30分钟。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为1.0mM，28℃振荡培养24小时。

培养结束后，收集菌体，并用PBS(氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH 7.4,定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上清。收集Fiber-2蛋白液。

实施例15 禽减蛋综合征病毒联合疫苗的制备

将实施例3纯化后的禽减蛋综合征病毒Penton蛋白抗原分别和实施例10制备的鸡新城疫抗原、实施例11制备的禽流感抗原、实施例12制备的鸡传染性支气管炎抗原、实施例13制备的传染性法氏囊抗原、实施例14制备的禽腺病毒抗原按比例混合，加入到白油佐剂中，同时开动电机，17500r/min搅拌5min，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％。具体配比见表11、12、13、14。

表11 禽减蛋综合征病毒二联疫苗配比

组分	疫苗5	疫苗6	疫苗7	疫苗8	疫苗9
						Penton蛋白(μg/ml)	10.2	20.4	30.6	40.8	10.2
N7a株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	10<sup>8.0</sup>	—	—	—	—
						SZ株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	—	10<sup>8.0</sup>	—	—	—
M41株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	—	—	10<sup>6.0</sup>	—	—
						VP2蛋白(AGP效价)	—	—	—	1：16	—
Fiber-2蛋白(AGP效价)	—	—	—	—	1：4
						白油佐剂(V/V％)	66％	66％	66％	66％	66％

表12 禽减蛋综合征病毒三联疫苗配比

组分	疫苗10	疫苗11	疫苗12	疫苗13
					Penton蛋白(μg/ml)	10.2	20.4	30.6	40.8
N7a株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	10<sup>8.0</sup>	10<sup>8.0</sup>	10<sup>8.0</sup>	10<sup>8.0</sup>
					SZ株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	10<sup>8.0</sup>	—	—	—
M41株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	—	10<sup>6.0</sup>	—	—
					VP2蛋白(AGP效价)	—	—	1：16	—
Fiber-2蛋白(AGP效价)	—	—	—	1：4
					白油佐剂(V/V％)	66％	66％	66％	66％

表13 禽减蛋综合征病毒四联疫苗配比

表14 禽减蛋综合征病毒五联疫苗配比

组分	疫苗19	疫苗20
			Penton蛋白(μg/ml)	10.2	10.2
N7a株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	10<sup>8.0</sup>	10<sup>8.0</sup>
			SZ株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	10<sup>8.0</sup>	10<sup>8.0</sup>
M41株抗原(EID<sub>50</sub>/0.1ml)	10<sup>6.0</sup>	10<sup>6.0</sup>
			VP2蛋白(AGP效价)	1：16	—
Fiber-2蛋白抗原(AGP效价)	—	1：4
			白油佐剂(V/V％)	66％	66％

实施例16 禽减蛋综合征病毒联合疫苗免疫原性试验

1.禽减蛋综合征病毒部分免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡170只，分成17组，每组10只，第30组～第45组分别经颈部皮下注射免疫实施例15制备的疫苗5～疫苗20，0.5ml/只；第46组皮下注射0.5ml生理盐水，作为空白对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，每只鸡分别采血，分离血清，测定血清中禽减蛋综合征血清中和抗体效价。结果见表15。

表15 禽减蛋综合征病毒联合疫苗禽减蛋综合征病毒部分免疫原性试验结果

结果显示，疫苗5～疫苗20免疫组在免疫后21天均产生了较高的中和抗体效价，可有效预防鸡群禽减蛋综合征的发生。表明本发明提供的禽减蛋综合征病毒Penton蛋白，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护，联苗中其他抗原成分的存在没有对禽减蛋综合征病毒Penton蛋白的免疫反应产生干扰。

2.新城疫病毒部分免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡130只，分成13组，每组10只，第47组～第58组分别经颈部皮下注射免疫实施例15制备的疫苗5、疫苗10～疫苗20，20μl/只；第59组皮下注射20μl生理盐水，作为攻毒对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，将第47组～第58组免疫鸡，连同第59组攻毒对照鸡，采血并分离血清。检测新城疫病毒HI抗体，同时用新城疫强毒HN1101株病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表16。

表16 禽减蛋综合征病毒联合疫苗新城疫病毒部分免疫原性试验结果

注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数。

结果显示，疫苗5、疫苗10～疫苗20免疫组在免疫后21天均能产生较高的新城疫HI抗体，而且免疫组和对照相比，可以完全保护强毒的攻击。表明以本发明提供的N7a株新城疫病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。

3.禽流感部分免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡80只，分成8组，每组10只，第60组～第66组分别经颈部皮下注射免疫实施例15制备的疫苗6、疫苗10、疫苗14、疫苗17～疫苗20，0.3ml/只；第67组皮下注射0.3ml生理盐水，作为攻毒对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，将第60组～第66组免疫鸡，连同第67组对照鸡，采血并分离血清。检测H9亚型禽流感HI抗体效价，同时用SZ株病毒液静脉注射攻击，每只0.2ml(含10^7.0EID₅₀)。于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性；对照组应至少4只鸡病毒分离为阳性。结果见表17。

表17 禽减蛋综合征病毒联合疫苗禽流感部分免疫原性试验结果

注：HI抗体测定为免疫鸡抗体的几何平均数。

结果显示，疫苗6、疫苗10、疫苗14、疫苗17～疫苗20在免疫后21天均能产生较高的禽流感抗体，而且免疫组和对照相比，可以完全保护强毒的攻击。表明本发明提供的H9亚型禽流感病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。

4.鸡传染性支气管炎部分免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡80只，分成8组，每组10只，第68组～第74组各点眼、滴鼻接种鸡传染性支气管炎活疫苗(H120株)1羽份(0.05ml)。接种后21日，连同第75组攻毒对照鸡，采血并分离血清。同时，第68组～第74组各组经颈部皮下注射免疫实施例15制备的疫苗7、疫苗11、疫苗14、疫苗15、疫苗16、疫苗19、疫苗20，0.3ml/只。接种后28日，连同第75组对照鸡分别采血并分离血清；第68～第74组免疫鸡在活苗首免后21日、灭活苗免后28日两次采集的血清(第75组攻毒对照鸡同样时间采集血清)测HI抗体效价。免疫组二免血清HI抗体效价几何平均值不低于首免血清HI抗体效价几何平均值的4倍，未免疫对照组血清HI抗体效价的几何平均值不高于1:8(微量法)。同时用鸡传染性支气管炎M41强毒每羽滴鼻攻毒10^3.0EID₅₀，作攻毒实验。结果见表18。

表18 禽减蛋综合征病毒联合疫苗鸡传染性支气管炎部分免疫原性试验结果

结果显示，疫苗7、疫苗11、疫苗14、疫苗15、疫苗16、疫苗19、疫苗20二免血清HI抗体效价几何平均值均不低于首免血清HI抗体效价几何平均值的4倍，攻毒后全部免疫鸡的气管内未分离出病毒，可以完全保护强毒的攻击。表明本发明提供的鸡传染性支气管炎病毒液，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。

5.法氏囊部分免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡60只，分成6组，每组10只，第76组～第80组分别经颈部皮下注射免疫实施例15制备的疫苗8、疫苗12、疫苗15、疫苗17、疫苗19，0.3ml/只；第81组皮下注射0.3ml生理盐水，作为攻毒对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，第76组～第81组，每只点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85((CVCC AV7株)购于中国兽医药品监察所)株病毒液0.1ml(实含毒量≥100个BID)。攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至72～96小时，扑杀存活鸡，逐只解剖，观察法氏囊等病变。免疫鸡应至少8只正常，不出现法氏囊病变；对照鸡应至少4只鸡发病，出现明显的法氏囊病变(如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变)。结果见表19。

表19 禽减蛋综合征病毒联合疫苗法氏囊部分免疫原性试验结果

结果显示，疫苗8、疫苗12、疫苗15、疫苗17、疫苗19在免疫后21天，可以完全保护鸡传染性法氏囊病强毒的攻击。

6.禽腺病毒综合征部分免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡60只，分成6组，每组10只，第82组～第86组分别经颈部皮下注射免疫实施例15制备的疫苗9、疫苗13、疫苗16、疫苗18、疫苗20，0.3ml/只；第87组皮下注射0.3ml生理盐水，作为攻毒对照。所有试验鸡均隔离饲养，免疫后21日，用FAV-HN株病毒液通过肌肉注射攻击，观察14日，记录发病、死亡及保护数。结果见表20。

表20 禽减蛋综合征病毒联合疫苗禽腺病毒综合征部分免疫原性试验结果

结果显示，第87组对照组全部发病死亡，而第82组～第86组免疫组对免疫鸡均产生了较好的免疫保护效果，免疫效果良好。表明本发明提供的禽腺病毒综合征抗原，作为抗原制备的油乳剂联苗可对鸡群提供完全保护。

证明了本发明提供的禽减蛋综合征病毒联合疫苗能够抵抗相关病原的侵袭，显示出良好的免疫原性，可有效控制我国禽减蛋综合征病毒相关疾病的流行。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 普莱柯生物工程股份有限公司

<120> 一种用于预防禽减蛋综合征的疫苗组合物、及其制备方法和应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1356

<212> DNA

<213> 禽减蛋综合征病毒

<400> 1

atggaatctt tcgttccgcc gccgcgtgtt ttcgctccga ccgaaggtcg taactctatc 60

acctacaacg ctttcgctcc gctgcaggac accaccaacc tgtactacat cgacaacaaa 120

acctctgaca tcgaagctct gaacctgacc aacgaccact ctgactactt caccaacatc 180

atccagaacg ctgacgtttc tccgaccgaa tctgctaccc aggacatcaa actggacgaa 240

cgttctcgtt ggtctggtaa cctggttacc ctgctgaaaa ccaactgccc gaacgttacc 300

gaatacaaca actctaacaa agttcgtgtt cgtctgatga ccgacaaaac cgacccgcag 360

aacccggttt acgactgggt tgaaatcgaa atcccggaag gtaactacac cggtaacgaa 420

atcatcgacc tgctgaacaa cgctgttctg gaacactacc tgaaagttgg tcgtcagaac 480

aacgttgaag tttctgacat cggtgttaaa ttcgacaccc gtatgttcgg tctgggtcag 540

gacccggtta cctctctgat cgttccgggt cgttacacct acaaagcttt ccacccggac 600

atcgttctgc tgccgaactg cggtgttgac ttcaccttct ctcgtctgaa caacatcctg 660

ggtatccgta aacgtaaccc gtacatgaaa ggtttcatca tcatgtacga cgacctggaa 720

cagggtaaca tcccggctct gctggacacc accaaatacc cggctgaagt tctgccggtt 780

ctggctgacg ctgacaacgt ttcttaccgt gttcagcaga tctctaccga cccgccggct 840

tggcagaccg aataccgttc ttgggctctg gcttaccaca acaaaggtcc gatccgtacc 900

accaccctgc tgaccgttcc ggacatcacc ggtggtctgg gtcagctgta ctggtctatc 960

ccggactctt tcaaagctcc gatcaccttc acctctaaca cctctaacac cgaaaccctg 1020

ccggttgttg ctatgcagct gttcccgctg cagcagcgta tcgtttacaa cgcttctgct 1080

gtttactctc gtctggttga acagatgacc aacaacacca aagttttcaa ccgtttcccg 1140

aacaacgaaa tcctgatgca gccgccgtac ggtaccctga cctggatctc tgaaaacgtt 1200

ccgtctgttg ctgaccacgg tcagcagccg ctgaaaaact ctctgccggg tgttcagcgt 1260

atcaccctga ccgacgaccg tcgtcgtacc tgcccgtaca tctacaaatc tctggctcgt 1320

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Claims (13)

1.一种用于预防禽减蛋综合征的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的禽减蛋综合征病毒抗原以及兽医学上可接受的载体；所述禽减蛋综合征病毒抗原为Penton蛋白抗原或重组有所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因的活载体；所述的禽减蛋综合征病毒Penton蛋白为SEQ.ID NO 1所示的核苷酸序列编码的蛋白，兽医学上可接受的载体为佐剂，所述佐剂为白油佐剂，制备油包水乳剂；佐剂的浓度范围是从30％到70％。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白抗原含量为≥10.2μg/ml。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白抗原含量为10.2μg/ml～40.8μg/ml。

4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白抗原含量为20.4μg/ml～30.6μg/ml。

5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述重组有所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因的活载体为重组减毒沙门氏菌、重组新城疫病毒、重组痘病毒。

6.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，

所述佐剂的浓度是66％V/V。

7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括以下抗原的一种或多种：鸡新城疫病毒抗原、禽流感病毒抗原、鸡传染性支气管炎病毒抗原、鸡传染性法氏囊病病毒抗原、禽腺病毒抗原、禽呼肠孤病毒抗原、大肠杆菌抗原、副鸡禽杆菌抗原、滑液囊支原体抗原、鸡毒支原体抗原、多杀性巴氏杆菌抗原、马立克氏病毒抗原、禽脑脊髓炎病毒抗原、鸡传染性喉气管炎病毒抗原。

8.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括由以下抗原组成的组中的一种或多种：鸡新城疫病毒灭活抗原、禽流感病毒灭活抗原、鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原、鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原、禽腺病毒灭活抗原或亚单位抗原。

9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中，所述鸡新城疫病毒灭活抗原为N7a株灭活抗原、所述禽流感病毒灭活抗原为SZ株灭活抗原、所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原为M41株灭活抗原、所述鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原为鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白、所述禽腺病毒灭活抗原为FAV-HN株灭活抗原、所述禽腺病毒亚单位抗原为禽腺病毒Penton蛋白或Fiber-2蛋白。

10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其中，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白含量为10.2～40.8μg/ml，所述鸡新城疫病毒灭活抗原含量为灭活前10^8.0～10^9.0EID₅₀/0.1ml，所述禽流感病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.5～10^8.5EID₅₀/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.0～10^7.0EID₅₀/0.1ml，所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白含量为AGP效价1:16～1:128，所述禽腺病毒Penton蛋白含量为AGP效价1:2～1:16，所述禽腺病毒Fiber-2蛋白含量为AGP效价1:2～1:16。

11.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其中，所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白含量为10.2～40.8μg/ml，所述鸡新城疫病毒灭活抗原含量为灭活前10^8.0EID₅₀/0.1ml，所述禽流感病毒灭活抗原含量为灭活前10^8.0EID₅₀/0.1ml，所述鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原含量为灭活前10^6.0EID₅₀/0.1ml，所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白含量为AGP效价1:16，所述禽腺病毒Penton蛋白含量为AGP效价1:4，所述禽腺病毒Fiber-2蛋白含量为AGP效价1:4。

12.一种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：

步骤(1)克隆所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因，并将所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因重组到表达载体以获得含有所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因的重组表达载体；

步骤(2)将所述含有禽减蛋综合征病毒Penton蛋白基因的重组表达载体和分子伴侣的表达载体一同转化大肠杆菌，表达所述禽减蛋综合征病毒Penton蛋白；

步骤(3)将所述表达的禽减蛋综合征病毒Penton蛋白使用表面活性剂处理除去内毒素；以及

步骤(4)将所述去除内毒素的禽减蛋综合征病毒Penton蛋白与佐剂混匀，得到所述疫苗组合物。

13.根据权利要求1～11所述的疫苗组合物在制备预防减蛋综合征的药物中的应用。