CN102743751A

CN102743751A - 一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法

Info

Publication number: CN102743751A
Application number: CN2012102725035A
Authority: CN
Inventors: 吴红云; 徐进; 哈斯通拉嘎; 郭俊清
Original assignee: Zhengzhou Houyi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhengzhou Houyi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-07-31
Filing date: 2012-07-31
Publication date: 2012-10-24

Abstract

本发明涉及了一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，先通过制备出免疫性强的毒株制成疫苗，并制备高免蛋，经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取净化处理、配制、冻干得到二联卵黄抗体冻干粉。采用本发明的方法制备的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉可以同时针对鸡新城疫、鸡传染性法氏囊病进行治疗的制剂，在临床上减少了操作强度、降低饲养成本，本发明的鸡新城疫、传染性法氏囊二联高免卵黄抗体冻干制剂便于运输和储藏，而且保存时间长，能保持较高的抗体效价。

Description

一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法

技术领域

本发明涉及一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，属于疾病免疫技术领域。

背景技术

鸡新城疫病、鸡传染性法氏囊病是养鸡业中常见的疾病，容易大面积爆发从而造成严重的经济损失。其中，鸡新城疫（NewCastledisease），由副粘病毒引起的高度接触性传染病。又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟。常呈急性败血鸡新城疫鸡新城疫症状。主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊乱、粘膜和浆膜出血。死亡率高，对养鸡业为害严重。1926年首先发现于印度尼西亚，不久又在英国新城发现，世界各国均有流行记载，有强毒株和弱毒株两类。病毒分为低毒力型（即缓发型）、中等毒力型（即中发型）、强毒力型（即速发型）3型。多数高强度毒力株常属嗜内脏型新城疫病毒。鸡科动物都可患罹本病，家鸡最易感，雏鸡比成年鸡易感性更高。鸡传染性法氏囊病又称鸡传染性腔上囊病，是由传染性法氏囊病毒引起的一种急性、接触传染性疾病，以法氏囊发炎、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重受损为特征，从而引起鸡的免疫机能障碍，干扰各种疫苗的免疫效果，发病率高，几乎达100%，死亡率低，一般为5%～15%，是目前养禽业最重要的疾病之一。自然条件下，此病只感染鸡，所有品种的鸡均可感染，但不同品种的鸡中，白来航鸡比重型品种的鸡敏感，肉鸡较蛋鸡敏感，此病仅发生于2周至开产前的小鸡，3～7周龄为发病高峰期。病毒主要随病鸡粪便排出，污染饲料、饮水和环境，使同群鸡经消化道、呼吸道和眼结膜等感染；各种用具、人员及昆虫也可以携带病毒，扩散传播；此病还可经蛋传递。目前主要防止方法包括抗病毒药、中西药及其制剂、单一病的卵黄抗体及其他生物制剂等，其中卵黄抗体是最有效的治疗鸡发生病毒病的方法。

发明内容

本发明的目的提供了一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，以针对鸡两种病毒疾病制备的二联高免卵黄抗体冻干粉制剂，不仅方便运输、保存，同时减少饲养成本和劳动操作，减少对鸡群的刺激，提高养殖经济效益。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法：将两种不同的传染病的病毒株制成相应的疫苗，首次免疫接种0.5mL，二、三次免疫接种1mL，每次间隔5天，两种疫苗交替进行免疫，第二次免疫后开始检测抗体效价，达到抗体效价要求时开始收集高免蛋，然后经过一系列物理、化学方法从高免蛋的卵黄中提取抗体，再经过配制加入辅料冻干，得到鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄冻干粉制剂。

本发明的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，具体包括以下步骤：

1）选出标准毒株制成疫苗，采用每间隔5天对选定的健康鸡群免疫，新城疫抗体与法氏囊抗体交替进行，第二次免疫后开始抗体效价检测，新城疫抗体效价达1：256、法氏囊抗体效价达1：512时，开始收集高免蛋；

2）收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；

3）分离高免卵黄，加入等体积的无菌水，搅拌混匀，直到颜色发白为止，得到充分混匀卵黄溶液；搅拌混匀的程度到发白色，这样卵黄才能破碎彻底，抗体释放比较完全；

4）步骤3)得到的卵黄溶液放入水浴锅内加热30min，然后加入pH为4.9-5.2的预冷酸化水溶液，混匀，静置沉淀，取上清液，离心20min，15000rpm/min，留上清液；

5）向步骤4）上清液中加入0.8-1.0%体积的辛酸，混匀，静置，弃去杂质漂浮物；

6）将步骤5）得到上清液离心10min，20000rpm/min，留取上清液，静置，再用0.45μm的滤膜进行过滤，除去较大的杂质或者杂蛋白，得到卵黄抗体溶液；

7）采用超滤装置进行超滤浓缩，浓缩到已定好的体积和抗体效价为止；

8）将浓缩好的卵黄溶液加入灭活剂和防腐剂；

9）加入辅料；

10）制定出合理的冻干曲线，冻出完整的卵黄抗体冻干粉。

步骤3）所述无菌水的加入量与卵黄溶液等体积。

步骤4）中的采用盐酸配制的酸化水pH为4.9-5.2，预冷于温度为4-6℃，时间为1-2h，加入量为未稀释卵黄液体积的6倍。

步骤4）中卵黄溶液加热温度为60-65℃，时间30min，要间断性搅拌。

步骤6）所述第一次过滤要求的滤膜孔径为0.45μm。

将步骤7）中超滤装置的滤膜孔径为截流分子量大于30-100KD的卵黄抗体溶液。

步骤8）所述的灭活剂为甲醛，甲醛的加入量为0.2-0.3%。

步骤8）所述的防腐剂为硫柳汞，硫柳汞为0.01-0.02%。

步骤9）所述的辅料为葡萄糖、山梨醇、甘氨酸或甘露醇，各辅料的重量百分比为4%葡萄糖、1%山梨醇、3%甘氨酸、3%甘露醇。

冻干曲线程序：-40℃开始升华，2h后升到-35℃保持14h。

本发明的制备方法是针对这两种发生率最较高、最流行的病毒病，开发一种二联高免卵黄抗体生物制剂，采用鸡新城疫、传染性法氏囊病病毒株制成相应疫苗，制定合理的免疫程序，免疫健康鸡群，收集达到高抗体效价鸡蛋，从鸡蛋的卵黄中提取鸡新城疫、传染性法氏囊病的抗体，为了便于运输和保存将这种二联高免卵黄抗体制成冻干粉剂型，这种通过鸡强化免疫后制成的二联卵黄抗体对鸡新城疫、传染性法氏囊病见效快、疗效显著，而且针对性强，同时对鸡的这两种病具有很好的预防效果。

本发明提供一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉制剂的制备，分别采用冷热酸化水处理、辛酸溶液、高速离心及过滤提纯和净化，最后经超滤浓缩制得浓缩卵黄抗体液，然后加入各种辅助料，制定冻干曲线和冻干程序得到完美的冻干粉，这种制剂不仅减少饲养成本，而且便于运输、保存，还可以提高工作效率，减少对机体的刺激。

具体实施方式

实施例1

本实发明鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其步骤如下：

2）收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；

4）步骤3)得到的卵黄溶液放入60℃水浴锅内加热30min，然后加入pH为4.9的预冷酸化水溶液，混匀，静置沉淀，取上清液，离心20min，15000rpm/min，留上清液；

5）加热后加入6倍预冷的pH为4.8盐酸水溶液，混匀，静置，取上清液，离心20min，15000rpm/min，留上清液；

6）将步骤5）得到的上清液中按体积加入0.8%辛酸，混匀，静置，弃除上浮杂质，留取下清液，离心10min，20000rpm/min，取上清液；

7）将步骤6）上清液经过0.45μm滤膜过滤，得到滤液，经过超滤装置截流分子量大于50KD的物质，采用的是循环方式浓缩至已计算好的体积和抗体效价为止；

8）浓缩液按体积加入甲醛量为0.2%，硫柳汞量为0.01%；

9）配制过程中，加入辅料为4%葡萄糖、1%山梨醇、3%甘氨酸、3%甘露醇物质；

10）预冷，根据冻干曲线程序将配制好的浓缩液进行预冻；

11）按照冻干曲线设定冻干程序。

质量标准：

[性状]本品为淡黄色，呈致密的团块。

[无菌检验]按《中国兽药典》进行，应无菌生长。

[支原体检验]按《中国兽药典》进行，应支原体生长。

[外源病毒检验]按《中国兽药典》进行，应符合规定。

[安全检验]用14日龄SPF鸡5只，各肌肉注射羽份，观察2周，应全部健活，注射部位没有病变。

[效力检验]按生产的规格进行稀释至1羽份/mL。

1）保护力检测：用21日龄SPF雏鸡30只，其中10只，每只肌肉注射1羽份卵黄抗体，另20只对照隔离饲养。24h，取试验组和对照组中的10只雏鸡点眼接种IBD和ND稀释后病毒液，记录96h死亡情况，试验组的保护率应该在90%以上，攻毒对照组死亡率应在80%以上，空白对照组雏鸡无任何变化。

2）治愈力测定：用21日龄SPF雏鸡90只，30只作阴性对照，60只点眼接种IBD和ND稀释的病毒液，感染12h后，其中30只，每只肌肉注射本品，每日1次，连续3日，另30只做阳性对照，隔离饲养。治疗后72h，记录各组死亡情况，攻毒阳性对照组死亡率应80%以上，治疗组存活率应在90%以上，健康阴性对照组30只无任何变化。

[剩余水分测定]按《中国兽药典》进行，应符合兽用生物制品通则规定。

[真空度测定]按《中国兽药典》进行，应符合规定。

[保质期]根据常温效价检测实验结果，至少可以存放2年。

本发明在研制过程中，为了检测卵黄抗体冻干粉在常温下的保质期，做了以下试验：将本品保存在37℃环境中，保存30个月，分别1周、2周、1月、4月、8月、12月、16月、20月、24月、28月、30月后，用琼脂扩散（AGP）法，测定每个时间点取样品的抗体效价变化，结果见表1。

表1.常温放置冻干粉不同时间段效价的变化

实施例2

1）选择标准毒株制备成疫苗，备用；

2）这两种疫苗第一次免疫接种0.5mL，每次免疫间隔5天时间，以后免疫加1倍量，两种疫苗交替免疫健康鸡群；

3）收集高免蛋，将高免蛋经过消毒、晾干，分离卵黄，打碎，加入等体积的无菌水，搅拌混匀，直到颜色发白为止，得到卵黄溶液；

4）将上述的卵黄液放入65℃水浴锅内加热30min，期间要间断性的搅拌，使其受热均匀。

5）加热后加入6倍预冷的pH为5.0盐酸水溶液，混匀，静置，取上清液，离心20min，15000rpm/min，留上清液；

6）将步骤5）得到的上清液中按体积加入0.9%辛酸，混匀，静置，弃除上浮杂质，留取下清液，离心10min，20000rpm/min，取上清液；

7）将步骤6）上清液经过0.45μm滤膜过滤，得到滤液，经过超滤装置截流分子量大于100KD的物质，采用的是循环方式浓缩至已计算好的体积和抗体效价为止；

8）浓缩液按体积加入甲醛量为0.25%，硫柳汞量为0.015%；

9）配制过程中，加入辅料为4%葡萄糖、1%山梨醇、3%甘氨酸、3%甘露醇；

10）预冷，根据冻干曲线程序将配制好的浓缩液进行预冻；

11）按照冻干曲线设定冻干程序。

质量标准：

同实例1。

实施例3

1）选择标准毒株制备成疫苗，备用；

4）将上述的卵黄液放入63℃水浴锅内加热30min，期间要间断性的搅拌，使其受热均匀。

5）加热后加入6倍预冷的pH为5.2盐酸水溶液，混匀，静置，取上清液，离心20min，15000rpm/min，留上清液；

6）将步骤5）得到的上清液中按体积加入1.0%辛酸，混匀，静置，弃除上浮杂质，留取下清液，离心10min，20000rpm/min，取上清液；

8）浓缩液按体积加入甲醛量为3%，硫柳汞量为0.02%；

10）预冷，根据冻干曲线程序将配制好的浓缩液进行预冻；

11）按照冻干曲线设定冻干程序。

质量标准：

同实例1。

Claims

1.一种鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于：先通过制备出免疫性强的毒株制成疫苗，并制备高免蛋，经过消毒、酸化处理、辛酸处理、精制提取净化处理、配制、冻干得到二联卵黄抗体冻干粉。

2.根据权利要求1所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

2）收集的高免蛋进行清理、消毒，晾干备用；

3）分离高免卵黄，加入等体积的无菌水，搅拌混匀，直到颜色发白为止，得到充分混匀卵黄溶液；

8）将浓缩好的卵黄溶液加入灭活剂和防腐剂；

9）加入辅料；

10）制定出合理的冻干曲线，冻出完整的卵黄抗体冻干粉。

3.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤3）所述无菌水的加入量与卵黄溶液等体积。

4.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤4）中的采用盐酸配制的酸化水pH为4.9-5.2，预冷于温度为4-6℃，时间为1-2h，加入量为未稀释卵黄液体积的6倍。

5.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤4）中卵黄溶液加热温度为60-65℃，时间30min，要间断性搅拌。

6.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤6）所述第一次过滤要求的滤膜孔径为0.45μm。

7.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于：将步骤7）中超滤装置的滤膜孔径为截流分子量大于30-100KD的卵黄抗体溶液。

8.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤8）所述的防腐剂为硫柳汞，硫柳汞为0.01-0.02%。

9.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤9）所述的辅料为葡萄糖、山梨醇、甘氨酸或甘露醇中的一种或任意组合。

10.根据权利要求2所述的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联高免卵黄抗体冻干粉的制备方法，其特征在于：冻干曲线程序：-40℃开始升华，2h后升到-35℃保持14h。