CN102805864A - 鸡新城疫和h9n2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法，涉及生物工程领域。所述二联灭活疫苗，含有鸡新城疫病毒LaSota株和禽流感病毒A/chicken/HeNan/03/2009/(H9N2)株。制备所述疫苗的方法：病毒液的制备、浓缩与灭活，水相制备，油相制备，乳化，即得二联灭活疫苗。本发明鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，免疫原性好，产生的抗体水平高，不仅能够抵抗同源病毒攻毒，而且能够抵抗2011年以来新流行的H9N2亚型禽流感病毒SH01、H9N2亚型禽流感病毒JX02攻毒；该二联灭活疫苗能够产生高水平的抗体，持续期长；其制备方法简单，安全。

Description

鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

新城疫又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病，OIE将其列为A类疫病。新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。该病死亡率高，对养鸡业危害严重。1926年首先发现于印度尼西亚，不久又在英国新城发现，世界各国均有流行记载。

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）隶属于正粘病毒科A型流感病毒属，因为该病毒是AIV负链、分节段的RNA病毒，所以该病毒很容易发生变异并不断的突破其感染宿主的种属障碍，引起新的流感流行。自1966年首次在北美的火鸡体内分离到H9N2亚型AIV以来，该亚型的病毒不断传播，目前已在全世界范围的禽群中广泛存在。我国也于1992年首次报道了鸡群中H9N2亚型AIV的感染，H9N2亚型是目前我国鸡群中存在的AIV主要亚型，占禽流感总发病率的90%以上。H9N2亚型禽流感发病后虽然致死率不高（一般不超过30%），但常导致呼吸道症状，蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能。AIV不仅对我国的养殖业造成了严重的损失，而且对人类健康也构成了威胁。

目前新城疫、H9N2亚型禽流感严重危害家禽养殖业的发展，在各种防控措施中，疫苗的免疫仍为最重要的措施。针对新城疫、H9N2亚型禽流感，已有相应的灭活单苗及二联灭活苗，但是免疫剂量大，抗体水平低，对流行毒株的交叉免疫保护率不高，给免疫鸡群带来一定的风险。因此，研制出免疫剂量小，交叉免疫效果更好的新城疫、禽流感H9N2亚型二联苗是一项具有重要意义的工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，该二联灭活疫苗中含有的H9亚型禽流感病毒HN03株，免疫原性好，产生的抗体水平高，不仅能够抵抗同源病毒攻毒，而且能够抵抗2011年以来新流行的H9N2亚型禽流感病毒SH01、H9N2亚型禽流感病毒JX02攻毒；该二联灭活疫苗能够产生高水平的抗体，持续期长。

本发明的另一目的在于提供鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法，该方法简单，安全。

本发明采用如下技术方法来实现发明目的：

一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，含有鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株；所述禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株，保藏号为CGMCC NO：6258。

所述鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株的含量比为2: 1～3。

一种制备所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，包括如下步骤：

（1） 病毒液的制备：将鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株分别接种SPF鸡胚，分别收获鸡胚液，作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液；

（2）病毒液的浓缩与灭活：将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液分别浓缩，然后分别加入β-丙内酯获得鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液；

（3）水相制备：将鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液混合，获得混合病毒液；将混合病毒液与吐温-80混合，制得水相；

（4）油相制备：将注射用白油和司本－80混匀，作为油相；

（5）乳化：将水相和油相混合均匀，即得鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗。

步骤（2）中，所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液浓缩至每0.1毫升浓缩后鸡新城疫病毒液中病毒含量为3×10^8.0 EID₅₀～3×10^9.0EID₅₀；所述H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液浓缩至每0.1毫升浓缩后禽流感H9病毒液中病毒含量为3×10^8.0 EID₅₀～3×10^8.5EID₅₀。

所述步骤（2）中各灭活病毒液中β-丙内酯的体积百分数为0.04%～0.06%。

步骤（3）中所述混合病毒液中鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液与H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液的体积比为2:1～3；步骤（3）中所述混合病毒液与吐温-80混合的体积比为96∶4。

步骤（4）中所述注射用白油和司本－80混合的体积比为94∶6。

步骤（5）所述水相和油相混合的体积比为1:3。

有益效果：

本发明鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗中含有的H9亚型禽流感病毒HN03株，是发明人自行分离、筛选、鉴定的，该毒株免疫原性好，产生的抗体水平高，不仅能够抵抗同源病毒攻毒，而且能够抵抗2011年以来新流行的H9N2亚型禽流感病毒SH01、H9N2亚型禽流感病毒JX02攻毒；该二联灭活疫苗能够使接种对象产生高水平的抗体，持续期长，不仅能够抵抗H9N2亚型禽流感病毒JX02攻毒，而且能够抵抗2011年以来新流行的H9N2亚型禽流感病毒SH01、H9N2亚型禽流感病毒JX02攻毒。

本发明制备鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗的方法，简单，安全。因为制备方法中对病毒液进行了浓缩，所以提高单位体积疫苗中的抗原含量，有效降低了使用剂量，成年鸡由原来免疫剂量0.5ml/羽降到0.3ml/羽，达到同样的免疫效果；使用了使用了β-丙内酯作为灭活剂，使产品中不含甲醛，确保受免动物体内无甲醛残留，提高畜产品的品质。

具体实施方式

实例1  H9N2亚型禽流感病毒HN03株的分离与鉴定

1. 病料

病料为无菌采集死亡病鸡的心血、肝、脑、肺组织。

2. 组织触片

将病料作心血涂片及各脏器的病毒组织触片，并进行染色镜检，发现病毒组织触片染色镜检结果为阴性。

3. 细菌培养

将上述病料，分别用马丁肉汤和绵羊血培养基培养（按现行《中国兽药典》附录方法配制），结果显示无菌落生长，说明所述病料中不含有细菌。

4. 病料处理

将上述病料在无菌容器中剪碎、磨碎，用含青链霉素的灭菌生理盐水（每毫升生理盐水含2000单位的青霉素和2000单位的链霉素）作1∶5倍稀释，反复冻融三次后，3000r/min离心20分钟，取上清液保存于-20℃备用。

5. 病毒分离、接种及收获

将本实施例标题4中获得的上清液，尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，每胚接种量0.2ml，接种后置37℃条件孵化。接种24小时以内死亡胚弃去，收获24小时以后死亡鸡胚尿囊液，测定尿囊液红细胞凝集价，将红细胞凝集价不低于1∶64的尿囊液置-20℃保存，为鸡胚扩繁的第一代种毒，简称E1代种毒。将E1代种毒继续传3代，即为E4代种毒，用于病毒生物学特性鉴定。

红细胞凝集价采用红细胞凝集试验（微量法）进行检测，具体方法如下：在96孔（角度为110°）微量板上，从第1孔至12孔，每孔加入生理盐水30μl，用加液器吸取含毒尿囊液30μl，从每排第1孔起，依次作倍比稀释，至11孔，弃去加液器内30μl 液体，最后1个孔不加作为空白对照。每孔加入1%鸡红细胞悬液30μl，立即在微量振荡器上摇匀，置20℃室温，20分钟后观察结果，使红细胞完全凝集的最高稀释度，作为判定终点。结果表明：E1代种毒的红细胞凝集价为1∶256，E4代种毒的红细胞凝集价为1∶1024。

6. 血凝抑制试验

将E4代种毒用灭菌生理盐水作1∶256稀释，即为4个血凝单位抗原。分别用购自中国兽医药品监察所的鸡新城疫、鸡产蛋下降综合征、禽流感（H9）、禽流感（H5）标准阳性血清进行血凝抑制试验（参照现行《中国兽药典》中方法），结果显示被检E4代种毒只可被禽流感（H9）标准阳性血清抑制，其它三种血清均不能抑制，初步说明本株病毒为H9亚型禽流感病毒。

7. 病毒含量测定

将E4代种毒10倍倍比稀释，取10^-7、10^-8、10^-9三个稀释度，分别通过尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，置37℃孵育120小时。120小时后，逐胚测定红细胞凝集价（方法同前），以红细胞凝集价不低于1∶16判为感染，按Reed-Muench方法计算病毒含量。结果表明：E4代种毒的病毒含量为10^8.5EID₅₀/0.1ml。

8. 静脉致病指数（IVPI）测定

参照二OOO年版《中华人民共和国兽用生物制品规程》（以下简称《规程》）附录448页方法进行。结果表明：E4代种毒的静脉致病指数为0，表明该毒株为低致病禽流感H9亚型病毒。

9. 鸡胚最小致死量的平均死亡时间（MDT/MLD）测定

按《规程》附录447页方法进行。结果表明：E4代种毒的鸡胚最小致死量的平均死亡时间为81.5小时/10^-9。

10. 免疫原性测定

将E4代种毒按常规方法制成含量为10^8.0EID₅₀/0.3ml的灭活疫苗。按0.2ml/羽份免疫1月龄SPF鸡10只，另取5只不免疫，作为空白对照。免疫21天后，所有试验鸡采血，分离血清，参照现行《中国兽药典》中方法进行血凝抑制试验。同时对免疫组和对照组进行攻毒，静脉注射E4代种毒10^5.0EID₅₀/只，免疫后第5天逐只用棉拭子采集鸡喉头分泌物，过滤除菌，接种9～10日龄SPF鸡胚，每个样品尿囊腔接种5枚鸡胚，0.2ml/胚。37℃孵育120小时，测定尿囊液红细胞凝集价。5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚的鸡胚液的红细胞凝集价不低于1∶16（微量法）则判为感染。对病毒感染为阴性的鸡胚，应盲传一次。结果表明，该疫苗按照0.2ml/羽份剂量免疫后21天，免疫组血清中E4代种毒血凝抑制抗体水平不低于1∶128（微量法），空白对照组均不高于1∶4（微量法），免疫攻毒保护试验结果表明，免疫组10/10病毒分离为阴性，对照组5/5病毒分离为阳性。

11. 血凝素HA基因及神经氨酸酶NA基因鉴定

由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室进行，鉴定结果为：E4代种毒的HA基因（如SEQ ID NO:1所示）属于A型流感病毒H9亚型，NA基因（如SEQ ID NO:2所示）属于A型流感病毒N2亚型。因此，将该毒株命名为禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株，缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株。将E4代种毒进行保藏。

保藏信息如下：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院 中科院微生物研究所。

分类命名：禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株。

保藏号：CGMCC NO：6258。

保藏日期：2012年7月2日。

为了方便描述，将禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株。

12. 对流行毒株的交叉攻毒保护性研究

A/Chinken/Shanghai/01/2011/（H9N2）（简称H9N2亚型禽流感病毒SH01），由上海兽医研究所2011年于上海分离。A/Chinken/Jiaxing/02/2011/（H9N2）（简称H9N2亚型禽流感病毒JX02）由南京天邦公司生物技术研究所2011年于浙江嘉兴分离。将H9N2亚型禽流感病毒HN03株按常规方法制成病毒含量为10^8.0EID₅₀/0.3ml的灭活疫苗，免疫1月龄SPF鸡30只；另取15只1月龄SPF鸡，分为3组，5只/组，不免疫作为空白对照组。免疫后21天，将免疫组随机分成三组，其中一组静脉注射H9N2亚型禽流感病毒HN03株尿囊液攻毒，另一组静脉注射H9N2亚型禽流感病毒SH01尿囊液攻毒，剩余的一组静脉注射H9N2亚型禽流感病毒JX02尿囊液攻毒；3个空白对照组的攻毒方法同免疫组。攻毒后第5天，逐只用棉拭子采集鸡喉头分泌物，过滤除菌，接种9~10日龄SPF鸡胚，每个样品尿囊腔接种5枚鸡胚，0.2ml/胚。37℃孵育120小时，测定尿囊液红细胞凝集价。5枚鸡胚中只要有1枚鸡胚的鸡胚液的红细胞凝集价不低于1∶16（微量法）则判为感染。对病毒分离阴性的样品，肓传一代。结果表明：H9N2亚型禽流感病毒HN03株对同源毒及非同源毒保护率均为100%，表明该毒株不但可以针对同源毒提供良好保护，对2011新分离的流行毒株也同样具有良好的保护性。

H9N2亚型禽流感病毒HN03株生物学特性研究结果表明，该毒株可在鸡胚中高滴度增殖，血凝效价较高，为1∶1024（微量法），免疫原性好，能完全抵抗同源病毒攻击，异源攻毒保护率也高达100%。因此可作为H9N2亚型禽流感疫苗候选毒株，用于制备灭活疫苗。

 

实施例2  鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗的制备

1. 制苗用毒种来源：  

制造本品用的毒种为鸡新城疫病毒La Sota 株和禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株CGMCC NO：6258，其中禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株。

鸡新城疫病毒La Sota 株（中国兽医药品监察所菌毒种编号：CVCC AV1615株）购自中国兽医药品监察所，H9N2亚型禽流感病毒HN03株由国家兽用生物制品工程技术研究中心按照实施例1方法分离，经哈尔滨兽医研究所鉴定，提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。

2. 病毒液的制备：将鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株分别接种SPF鸡胚，分别收获鸡胚液，作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液；

（1）鸡新城疫病毒La Sota株病毒液的制备：将鸡新城疫病毒La Sota株接种SPF鸡胚，收获鸡胚液作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液。

具体方法如下：

接种：取鸡新城疫病毒La Sota株，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10^-4或10^-5），尿囊腔内接种9~10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36~37℃继续孵育，不必翻蛋。

孵育和观察：鸡胚接种后，每日照蛋1次，将60小时以前死亡的鸡胚弃去。此后，每4~8小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时弃去。当孵育时间达到96或120小时，不论死亡与否，全部收回，气室向上，置于2~8℃冷却12~24小时。

收获：将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部位卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜（勿使卵黄破裂），吸取鸡胚液作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液。

在鸡新城疫病毒La Sota株病毒液中，加入适宜抗生素（每毫升抗原中青霉素终浓度800单位，链霉素终浓度800单位），每组抽样测定红细胞凝集价，红细胞凝集价低于1∶512（微量法）者应弃之，同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

注意：在吸取胚液前，对每个鸡胚均应注意检查，凡出现腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获。

（2）H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液的制备：将H9N2亚型禽流感病毒HN03株接种SPF鸡胚，收获鸡胚液作为H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液。

具体方法如下：

接种：将H9N2亚型禽流感病毒HN03株用灭菌生理盐水作1∶5000稀释，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。

孵育和观察：鸡胚接种后，24小时内照蛋1次，弃去死胚。此后，每4～8小时照蛋1次。当孵育时间达到96～120小时，随时收回死亡的鸡胚，气室向上，置2～8℃冷却4～24小时。

收获：将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜（勿使卵黄破裂），吸取鸡胚液作为H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液。

在鸡新城疫病毒La Sota株病毒液中，加入适宜抗生素（每毫升抗原中青霉素终浓度800单位，链霉素终浓度800单位），每组抽样测定红细胞凝集价，红细胞凝集价低于1∶256（微量法）者弃去，同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

注意：在吸取胚液前对每个鸡胚均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获。每若干枚鸡胚的胚液分为一组。

3. 病毒液的浓缩与灭活：将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液分别浓缩，然后分别加入β-丙内酯获得灭活病毒液。各灭活病毒液中β-丙内酯的体积百分数为0.04%～0.06%。

所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液浓缩至每0.1毫升浓缩后鸡新城疫病毒液中病毒含量为3×10^8.0 EID₅₀～3×10^9.0EID₅₀；所述H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液浓缩至每0.1毫升浓缩后禽流感H9病毒液中病毒含量为3×10^8.0 EID₅₀～3×10^8.5EID₅₀。一般来说，浓缩至原体积的1/2～1/4，即能达到要求。

（1）病毒液的浓缩：

将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液分别连续离心澄清（连续离心转速：10000转/秒），除去病毒液中的大颗粒，使其成为透明或半透明溶液。然后，用病毒超滤浓缩系统（购自美国Millipore公司，超滤膜孔径：300KD）分别将上述病毒液滤浓至原体积的1/3，获得浓缩病毒液。用超滤浓缩过程中产生的滤出废液接种鸡胚，均应无血凝性，且不引起鸡胚死亡。

（2）病毒液的灭活： 

将上述两种浓缩病毒液分别置无菌灭活罐内，加入β-丙内酯溶液，随加随搅拌，使其充分混合。加完β-丙内酯溶液后用无菌压缩空气将其压入另一无菌灭活罐内，置4℃下灭活24小时，期间每隔4小时搅拌1次，即获得灭活病毒液。灭活病毒液中β-丙内酯的体积百分数为0.05%。从灭活病毒液中取样进行灭活检验。灭活病毒液置2～8℃保存。

4.半成品检验：

（1）无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

（2）病毒含量测定：

鸡新城疫病毒La Sota株浓缩病毒液的含量测定：将浓缩病毒液作3倍稀释后，测病毒含量。每0.1ml稀释后的浓缩病毒液中病毒含量为10^8.0～10^9.0EID₅₀，所以每0.1ml浓缩病毒液中病毒含量为3×10^8.0 EID₅₀～3×10^9.0EID₅₀；同时进行红细胞凝集价测定（同实施例1），红细胞凝集价为1∶512～1024（微量法）。

H9N2亚型禽流感病毒HN03株浓缩病毒液的含量测定：将浓缩病毒液先作3倍稀释后，测病毒含量，每0.1ml稀释后的浓缩病毒液中病毒含量为10^8.0～10^8.5EID₅₀，所以每0.1ml浓缩病毒液中病毒含量为3×10^8.0 EID₅₀～3×10^8.5EID₅₀；红细胞凝集价测定，红细胞凝集价（检测方法同实施例1）为1∶512～1024（微量法）。 

（3）灭活检验：

鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液灭活检验：取灭活病毒液，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚6枚，每胚0.2ml，置36～37℃孵育，弃去24小时内死亡鸡胚，观察120小时，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现血凝，并盲传1代，测定红细胞凝集价，均应不出现血凝。

H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液灭活检验：取灭活病毒液，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚6枚，每胚0.2ml，置36～37℃孵育，弃去24小时内死亡鸡胚，观察120小时，鸡胚非特异性死亡应不超过1枚。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现血凝，并盲传1代，测定红细胞凝集价，均应不出现血凝。

5. 鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗的制备：

每羽份（0.3ml）鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗，鸡新城疫病毒La Sota株含量10^8.0EID₅₀～10^9.0EID₅₀，H9N2亚型禽流感病毒HN03株含量10^8.0EID₅₀～10^8.5EID₅₀。

（1）油相制备：将注射用白油和司本－80按照体积比为94：6混匀，作为油相。

（2）水相制备：

将鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液等体积混合制备混合病毒液；将混合病毒液与吐温-80按照体积比96∶4混合，充分搅拌直至吐温-80完全溶解，即得水相溶液。

（3）乳化：

将油相和水相按照体积比3∶1混合，搅拌均匀获得鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗。

具体操作步骤如下：将3份油相放入乳化罐内，启动乳化罐搅拌机搅拌，同时徐徐加入水相一份，加完后继续搅拌10~15min，打开均质机进出口开关，启动均质机，使乳化液经均质机进入另一罐，如此反复乳化数次（一般6~8次），乳化后取10ml疫苗，以3000r/min 离心15分钟，应不出现分层现象。

实施例3  鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗双倍剂量接种安全试验

按实施例2制备5批次鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗（批号：20100301、20100502、20100603、20110104、20110305），灭活前鸡新城疫病毒La Sota株及禽流感（H9亚型）HN03株抗原含量均为10^8.0EID₅₀/0.3ml/羽份。

考察对象为7日龄SPF鸡（购自北京梅里亚维通实验动物有限公司）和7日龄三黄肉鸡（购自南京石佛寺养鸡场）。各批鸡购回后，适应数天，核实鸡的全身状况和临床疾病情况，剔除弱鸡，选择健康鸡进入试验。对SPF鸡分别双倍剂量（0.6ml/只）颈部皮下注射五批鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗，每次设1组不接种，作为对照；对三黄肉鸡分别双倍剂量（0.6ml/只）颈部皮下注射三批鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗，每次设1组不接种，作为对照。接种后观察14天内是否出现由疫苗引起的任何局部和全身反应，接种后14天、28天各随机抽取试验鸡5～10只，剖检注射部位，检查疫苗的吸收情况。

结果：用双倍剂量鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗对7日龄SPF鸡和7日龄三黄肉鸡进行接种。接种后14日内，未观察到临床异常，采食、饮水正常，健康情况良好，未发现由疫苗引起的任何局部和全身反应，具体见表1。接种后14天，各组取5～10只鸡剖检注射部位，80%以上肉眼可见少量粟粒样大小颗粒未吸收完全；注射后28天剖检，70%以上疫苗已基本吸收，注射部位未见由疫苗接种引起的异常反应，具体见表2。因此，鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗双倍剂量接种是安全的。

表1  双倍剂量接种鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗后14天内临床观察结果

表2  双倍剂量接种鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗的吸收检验结果

实施例4  鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗免疫效力试验

按实施例2方法制备鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗（批号：20100301、20100502、20100603、20110104、20110305），并按下列方法进行成品的效力检验。

1.鸡新城疫血清学效力检验：每批苗取1月龄SPF鸡15只，其中10只作为免疫组，每只SPF鸡颈部皮下注射20μl所述二联灭活疫苗；另5只作为对照组，不免疫。免疫后21天采血，分离血清，参照现行《中国兽药典》方法进行血凝抑制试验。五批次二联灭活疫苗组免疫后21天，平均血凝抑制抗体效价分别为5.2log2、5.7log2、5.1log2、5.7log2、5.2log2，均不低于4log2的标准，对照组均不高于2log2，达到合格标准，具体见表3。

2. H9亚型禽流感血清学效力检验：每批苗取1月龄SPF鸡15只，其中10只作为免疫组，各颈部皮下注射二联灭活苗0.3ml；另5只作为对照组，不接种。免疫21日后采血，参照现行《中国兽药典》方法进行血凝抑制试验。五批次二联灭活疫苗免疫组免疫后21天，血凝抑制平均抗体水平分别为9.0log2、8.6log2、9.1log2、8.7log2、8.9log2，均不低于7log2的标准，对照组均不高于2log2，达到合格标准，具体见表3。

表3 五批次鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗血凝抑制检验结果

3. H9N2禽流感免疫攻毒保护效力检验：取本实施例标题2中免疫21天后的免疫组SPF鸡和对照SPF鸡用H9N2亚型禽流感病毒HN03株含量为10^5.0EID₅₀的病毒液进行静脉注射，攻毒后第5日，采集喉拭子进行病毒分离。每只鸡的喉拭子样品尿囊腔接种9~10日龄SPF鸡胚5枚，孵育观察120小时，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，以5枚鸡胚中有1枚鸡胚液红细胞凝集价不低于1∶16（微量法）判为感染。对病毒感染为阴性的鸡胚，盲传一次。结果表明：免疫组攻毒后病毒分离阴性率均为100%，对照组病毒分离阳性率均为100%，具体见表4。

表4 五批次二联苗H9N2禽流感攻毒保护效力试验结果

实施例5 鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗对2011年流行毒株交叉攻毒保护效果研究

为了检测鸡新城疫、禽流感H9亚型二联灭活疫苗（La Sota株+HN03株）对2009年以后新分离流行毒株的保护效果，按实施例2方法制备鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗（批号： 20110104、20110305），并选择了2011年新分离的H9N2亚型禽流感病毒SH01、H9N2亚型禽流感病毒JX02进行禽流感（H9）交叉攻毒保护试验。结果表明，两批试验室制品对SH01株、JX02株的保护率均为10/10，对照组分别为4/5（SH01株）、5/5（JX02株）感染，说明用鸡新城疫病毒La Sota株、禽流感病毒HN03株制备的灭活疫苗，可以良好的抵抗禽流感H9亚型当前流行株的攻击。

（1）二联灭活疫苗对H9N2亚型禽流感病毒SH01株交叉攻毒保护试验及结果：每批苗取1月龄SPF鸡10只作为免疫组，各颈部皮下注射二联灭活苗0.3ml；另设5只作为对照组，不接种。免疫后21天，免疫组SPF鸡和对照SPF鸡用H9N2亚型禽流感病毒SH01株含量为10^8.0EID₅₀（0.2ml）的病毒液进行静脉注射，攻毒后第5日，采集喉拭子进行病毒分离。每只鸡的喉拭子样品尿囊腔接种9~10日龄SPF鸡胚5枚，孵育观察120小时，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，以5枚鸡胚中有1枚鸡胚液红细胞凝集价不低于1∶16（微量法）判为感染。对病毒感染为阴性的鸡胚，盲传一次。结果表明：两批二联灭活疫苗针对SH01株病毒攻击均可达到10/10保护，对照组4/5感染。结果见表5。

表5 二联灭活疫苗对H9N2亚型禽流感病毒SH01交叉攻毒保护试验结果(阳性数/攻毒数)

（2）二联灭活疫苗对H9N2亚型禽流感病毒JX02株交叉攻毒保护试验及结果：每批苗取1月龄SPF鸡10只作为免疫组，各颈部皮下注射二联灭活苗0.3ml；另5只作为对照组，不接种。免疫后21天，免疫组SPF鸡和对照SPF鸡用H9N2亚型禽流感病毒JX02株含量为10^8.0EID₅₀（0.2ml）的病毒液进行静脉注射，攻毒后第5日，采集喉拭子进行病毒分离。每只鸡的喉拭子样品尿囊腔接种9~10日龄SPF鸡胚5枚，孵育观察120小时，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，以5枚鸡胚中有1枚鸡胚液红细胞凝集价不低于1∶16（微量法）判为感染。对病毒感染为阴性的鸡胚，盲传一次。结果表明：两批二联灭活疫苗针对JX02株病毒攻击均可达到10/10保护，对照组5/5感染。结果见表6。

表6 二联灭活疫苗对H9N2亚型禽流感病毒JX02株交叉攻毒保护试验结果(阳性数/攻毒数)

实施例6  鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗与同类产品比较试验

为了对比本专利鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗与目前市场销售的其他同类产品的免疫效果，按实施例2方法制备鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗（每羽份疫苗中鸡新城疫病毒 La Sota株为10^8.0EID₅₀、H9N2亚型禽流感病毒HN03株为10^8.0EID₅₀）。

购买南京天邦生物科技有限公司的鸡新城疫、禽流感H9亚型二联灭活疫苗产品（生产批号：119029；产品批准文号：兽药生字（2009）100992078；H9亚型禽流感采用F毒株）作为同类制品对照疫苗，该产品中每羽份（0.3ml）疫苗中含灭活的鸡新城疫病毒 La Sota株为10^7.5EID₅₀、禽流感（H9亚型）F株为10^8.0EID₅₀，可用于任何品种及不同日龄的鸡。颈部皮下或肌肉注射。

为了与同类制品相区分，下述实验中，将本发明鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗简称为自制疫苗。

将SPF鸡设为自制疫苗组、同类制品组和对照组，自制疫苗组和同类制品组分别有20只鸡，对照组5只鸡。接种方法：自制疫苗组与同类制品组均采用颈部皮下注射，按照剂量0.3ml/只接种与其组名对应的疫苗，对照组不接种。接种21日后，自制疫苗组、同类制品组分别随机抽取10只鸡采血，测定血清中鸡新城疫抗体和H9亚型禽流感抗体，通过测定免疫后抗体产生期、血清学效力检验（免疫后21天各免疫组抗体水平）及抗体持续情况对比两种疫苗的免疫效果。

（1）鸡新城疫病毒抗体产生期测定结果：两种疫苗按照1羽份（0.3ml）免疫3周龄SPF鸡后，鸡新城疫病毒抗体在免疫后7～14天产生，抗体产生期比较试验的结果表明：采用自制苗免疫SPF鸡后7天、14天、21天，产生的抗鸡新城疫病毒抗体效价分别为2.7log2、6.2log2和7.4log2，均高于同类苗免疫相同时间后产生的抗体水平。结果见表7。

表7 SPF鸡鸡新城疫抗体产生期比较结果

（2）H9亚型禽流感病毒抗体产生期测定结果：两种疫苗按照1羽份（0.3ml）免疫3周龄SPF鸡后，H9亚型禽流感病毒抗体在免疫后7～14天产生，抗体产生期比较试验的结果表明：采用自制苗免疫SPF鸡后7天、14天、21天，产生的禽流感H9抗体效价分别为3.4log2、6.7log2和8.7log2，均高于同类苗免疫相同时间后产生的抗体水平。结果见表8。

表8  SPF鸡禽流感H9抗体产生期比较结果

（3）鸡新城疫效力检验：自制疫苗按20μl/只免疫SPF鸡后21天，鸡新城疫病毒抗体水平为5.7log₂；同类制品免疫组鸡新城疫病毒抗体水平分别4.7log₂，对照组抗体水平为0.8log₂。说明自制二联苗中鸡新城疫的抗体效价较同类产品高1个滴度，结果见表9。

表9  鸡新城疫血清学效力检验结果（log₂）

（4）H9亚型禽流感效力检验结果：各批苗免疫后21天H9亚型禽流感病毒抗体检测如下，自制疫苗免疫组为8.7log₂，同类制品免疫组抗体水平为7.0log₂，对照组抗体水平为0.4log2，说明自制二联苗中禽流感的抗体效价显著高于同类产品，结果见表10。

表10  禽流感（H9）部分血清学效力检验结果 

（5）新城疫病毒抗体持续期测定结果：采用自制苗免疫SPF鸡后1个月、2个月、3个月和4个月，鸡新城疫抗体效价分别为7.8log2、8.5log2、7.0log2和6.1log2，均显著高于同类苗免疫相同时间后产生的抗体水平。结果见表11。

 

表11  SPF鸡新城疫免疫持续期比较结果

（6）H9亚型禽流感病毒抗体持续期测定结果：采用自制苗免疫SPF鸡后1个月、2个月、3个月和4个月，H9亚型禽流感病毒抗体水平分别为9.1log2、10.4log2、8.8log2和8.0log2，均显著高于同类苗免疫相同时间后产生的抗体水平。结果见表12。

表12  H9亚型禽流感病毒抗体持续期比较结果

   SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏省农业科学院

 

<120>  鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法

 

<130>  201209302

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1683

<212>  DNA

<213>  禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株

 

<400>  1

atggaagcag catcactaat aactatgcta ctagtagcaa cagtaagcaa tgcagataaa     60

 

atctgcatcg gctaccaatc aacaaactcc acagaaactg tagacacact aacagaaaac    120

 

aatgtccctg tgacacatgc caaagaactg ctccacacag agcataatgg gatgttgtgt    180

 

gcaacaagct taggacatcc tcttattcta gacacctgta ctgttgaagg actaatctat    240

 

ggcaatcctt cttgtgattc actgttggga ggaagagaat ggtcctatat cgtcgagaga    300

 

ccatcggctg ttaatggatt gtgttacccc gggaatgtag aaaatctaga agagctaagg    360

 

tcacttttta gttctgctag ttcttatcaa aggatccaga tttttccaga cacaatctgg    420

 

aatgtgtctt acaatgggac aagcaaagca tgttcagatt cattctacag aagcatgaga    480

 

tggttgaccc aaaagaacaa cgcttaccct attcaagatg cccaatacac aaataatcaa    540

 

gaaaagaaca ttcttttcat gtggggcata aaccacccac ccaccgatac tgtgcagaca    600

 

aatctgtaca caagaaccga cacaacaaca agtgtggcaa cagaagaaat aaataggacc    660

 

ttcaaaccat tgataggacc aaggcctctt gttaatggtt ttcaggggag aattgactat    720

 

tattggtcgg tattgaaacc aggtcaaaca ctgcgaataa gatccaatgg gaatctaata    780

 

gctccatggt atggacacat tctttcagga gagagccacg gaagaatcct gaagactgat    840

 

ttaaaaaggg gtagctgcac agtgcaatgt cagacagaaa aaggtggctt aaacacaaca    900

 

ttgccattcc aaaacgtaag taagtatgca tttggaaact gctcgaaata tattggaata    960

 

aagagtctca aacttgcagt tggtctgaga aatgtgcctt ctagatctag tagaggacta   1020

 

ttcggggcca tagctggatt catagaggga ggttggtcag ggctagtcgc tggttggtat   1080

 

ggattccagc attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa   1140

 

acggcaattg ataaaataac atccaaagtg aataacatag tcgacaaaat gaacaagcag   1200

 

tatgaaatta ttgatcatga attcagtgag gttgaaacta gacttaacat gatcaataat   1260

 

aagattgatg atcaaatcca agacatatgg gcatataatg cagaattgct agttctgctt   1320

 

gaaaaccaga aaacactcga tgagcatgat gcaaatgtaa acaatctata taataaagtg   1380

 

aagagggcat tgggttccaa tgcggtggaa gatgggaaag gatgtttcga gctataccac   1440

 

aaatgtgatg accagtgcat ggagacaatc cggaacggga cctacaacag gaggaagtat   1500

 

caagaggaat caaaattaga aagacagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagga   1560

 

acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgat tgcaatgggg   1620

 

tttgctgcct tcttgttctg ggccatgtcc aatgggtctt gcagatgcaa catttgtata   1680

 

taa                                                                 1683

 

 

<210>  2

<211>  1457

<212>  DNA

<213>  禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株

 

<400>  2

agcaaaagca ggagtgaaga tgaatccaaa tcagaagata atagcaattg gatctgtttc     60

 

tctaaccatt gcgataatat gttttctcat gcagattgcc atcttaacaa cgaccatgac    120

 

actacatttc agacagaatg aatgcagcaa accatcgaat aatcaagtgg tgccatgtga    180

 

acctatcata atagagagga acacagtgca tttgaacagt actaccatag agaaggaaat    240

 

ttgtcctaaa gtggcagaat acaagaattg gtcaaaacca caatgtcaaa ttacagggtt    300

 

cgctcctttc tcaaaggaca actcaattag gctttctgca ggtggagata tctgggtgac    360

 

aagagaacct tatgtgtcgt gcagtcttgg caaatgttat caatttgcac ttggacaggg    420

 

aaccactctg aaaaacaagc actcaaatgg cactacacat gatagaattc cccacagaac    480

 

tcttttaatg aatgagttgg gtgtcccatt tcatttggga accaaacaag tgtgcatagc    540

 

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tgataaaaat gctactgcta gtatcattta tgatgggatg ctggttgaca gtattggttc    660

 

atggtccaaa aacatcctaa gaactcagga gtcagaatgc gtttgcatca atggaacttg    720

 

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aagagaggga aaaattataa acattaggcc attgtcagga agtgctcagc acgtggagga    840

 

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aactccttgt ttctact                                                  1457

Claims (9)

1.一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于：含有鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株；所述禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株，保藏号为CGMCC NO：6258。

2.根据权利要求1所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于所述鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株的含量比为2: 1～3。

3.一种制备权利要求1所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于：包括如下步骤：

（1） 病毒液的制备：将鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株分别接种SPF鸡胚，分别收获鸡胚液，作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液；

（2）病毒液的浓缩与灭活：将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液分别浓缩，然后分别加入β-丙内酯获得鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液；

（3）水相制备：将鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液混合，获得混合病毒液；将混合病毒液与吐温-80混合，制得水相；

（4）油相制备：将注射用白油和司本－80混匀，作为油相；

（5）乳化：将水相和油相混合均匀，即得鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗。

4.根据权利要求3所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于：步骤（2）中，所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液浓缩至每0.1毫升浓缩后鸡新城疫病毒液中病毒含量为3×10^8.0 EID₅₀～3×10^9.0EID₅₀；所述H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液浓缩至每0.1毫升浓缩后禽流感H9病毒液中病毒含量为3×10^8.0 EID₅₀～3×10^8.5EID₅₀。

5.根据权利要求3或4所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于：所述步骤（2）中各灭活病毒液中β-丙内酯的体积百分数为0.04%～0.06%。

6.根据权利要求5所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于：步骤（3）中所述混合病毒液中鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液与H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液的体积比为2:1～3。

7.根据权利要求6所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于步骤（3）中所述混合病毒液与吐温-80混合的体积比为96∶4。

8.根据权利要求7所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于步骤（4）中所述注射用白油和司本－80混合的体积比为94∶6。

9.根据权利要求8所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于步骤（5）所述水相和油相混合的体积比为1:3。