CN117224666B - 一种禽流感、新城疫病毒二联五价疫苗组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种禽流感、新城疫病毒二联五价疫苗组合物及其应用，所述疫苗组合物包含保藏号为CCTCC NO：V202159的人工重组的H5N6流感病毒H5‑Re13株、保藏号为CCTCC NO：V202160的人工重组的H5N8流感病毒H5‑Re14株、保藏号为CCTCC NO：V202161的人工重组的H7N9流感病毒H7‑Re4株、保藏号为CCTCC NO：V202333的H9N2亚型禽流感病毒CK/GX/S11583/2019株和保藏号为CCTCC NO：V202334的人工重组的新城疫病毒rLa‑Ⅶ株。本发明为五价疫苗，达到“一针防五病”的免疫保护效果，极大降低家禽免疫负担，具有广阔市场前景和重要应用价值。
Description
技术领域
本发明属于疫苗领域，具体涉及一种禽流感、新城疫病毒二联五价疫苗组合物及其应用。
背景技术
禽流感是一种重要的人兽共患传染病，严重危害我国家禽产业和公共卫生健康，我国对其防控采取疫苗免疫的策略。目前，H5亚型2.3.4.4b分支和2.3.4.4h分支禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)是近期危害我国养禽业的主要分支AIV，其中2.3.4.4b分支AIV已在全球累计导致2亿多只家禽死亡或被销毁，损失惨重；H7亚型AIV仍然在我国北方环渤海区域鸡群中存在，对局部鸡群健康构成重要危害。我们研制的同时针对2.3.4.4h分支H5亚型禽流感、2.3.4.4b分支H5亚型禽流感、H7亚型禽流感的重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N6 H5-Re13株+H5N8 H5-Re14株+H7N9 H7-Re4株)已推向临床应用，效果显著，但蛋鸡饲养过程需要多次接种该疫苗。
低致病性H9亚型禽流感尽管对家禽不构成致死性威胁，但家禽尤其是鸡感染后，生产性能下降，如果混合感染其他病原，则可出现死亡；同时H9N2亚型AIV感染人的事件也偶有发生。为有效预防H9亚型禽流感，我国当前40余种H9亚型禽流感疫苗在售，疫苗毒株20余株，临床中使用疫苗频繁，多次接种。但疫苗效果层次不齐，免疫失败的现象时有发生，免疫鸡群感染H9N2亚型AIV的现象仍比较普遍，急需新型高效疫苗。
新城疫(Newcastledisease，ND)是危害养禽业的另一种重要传染病。新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)可划分为多种基因，近年来，基因Ⅶ型新城疫病毒是我国分布最为广泛，危害最为严重的病毒。常规新城疫疫苗免疫后，难以有效控制基因Ⅶ型新城疫病毒，常出现非典型新城疫，导致重要危害。
针对家禽中H5、H7和H9亚型禽流感及新城疫防控需要，急需同时预防这些禽病的多价疫苗。当前我国没有同时针对2.3.4.4h分支H5亚型禽流感、2.3.4.4b分支H5亚型禽流感、H7亚型禽流感、H9亚型禽流感和新城疫的疫苗，需要对家禽分别接种禽流感(H5+H7亚型)疫苗、H9亚型禽流感灭活疫苗和新城疫疫苗，才能有效预防H5/H7/H9禽流感和新城疫。由于H5/H7禽流感和新城疫疫苗在蛋鸡及种禽生产种均需要多次免疫，3类疫苗同时接种造成免疫次数过多，家禽免疫负担过重，极大增加养殖成本。研发出“一针防多病”的禽流感(H5+H7+H9)、新城疫五价疫苗并应用，可显著降低家禽免疫负担、节省人工成本、增加养殖收入，具有重要临床应用价值和巨大的市场前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供一种禽流感(H5+H7+H9)、新城疫病毒疫苗组合物及其制备方法和应用。
本发明的技术方案为：一种禽流感、新城疫病毒二联五价疫苗组合物，所述疫苗组合物含有保藏号为CCTCC NO：V202159的人工重组的H5N6流感病毒H5-Re13株、保藏号为CCTCC NO：V202160的人工重组的H5N8流感病毒H5-Re14株、保藏号为CCTCC NO：V202161的人工重组的H7N9流感病毒H7-Re4株、保藏号为CCTCC NO：V202333的H9N2亚型禽流感病毒CK/GX/S11583/2019株和保藏号为CCTCC NO：V202334的人工重组的新城疫病毒rLa-Ⅶ株五种病毒抗原。
进一步地，所述疫苗组合物中H5-Re13株、H5-Re14株、H7-Re4株、CK/GX/S11583/2019株和rLa-Ⅶ株病毒抗原的比例为1:1:1:1:1。
上述所述的疫苗组合物在制备预防H5亚型禽流感2.3.4.4h分支病毒、H5亚型禽流感2.3.4.4b分支病毒、H7N9亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒所导致疾病和新城疫病毒所致疾病的药物中的用途。
H9N2亚型禽流感病毒CK/GX/S11583/2019株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V202333。
上述所述的H9N2亚型禽流感病毒CK/GX/S11583/2019株在制备预防H9N2亚型禽流感病毒所导致的疾病的药物中的用途。
本发明还公开了一种上述所述的疫苗组合物的制备方法，包括如下步骤：将所述H5-Re13株、H5-Re14株、H7-Re4株、CK/GX/S11583/2019株和rLa-Ⅶ株分别接种鸡胚，孵化培养后收获病毒液；分别浓缩5倍，经甲醛灭活后，按照抗原含量1:1:1:1:1的比例进行混合，添加佐剂后制备成油乳剂灭活疫苗。
进一步地，所述添加佐剂后制备成油乳剂灭活疫苗的方法为：
(1)油相制备：取注射用白油95份，司盘-80 5份，混匀后，121℃高压灭菌，冷却后备用；
(2)水相制备：取灭菌冷却后的吐温-80 7份，加入H5-Re13株、H5-Re14株、H7-Re4株、CK/GX/S11583/2019株和rLa-Ⅶ株病毒浓缩液各18.6份，充分搅拌至吐温-80完全溶解；
(3)乳化：取步骤(1)得到的油相3份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入步骤(2)得到的水相1份，进行充分搅拌乳化；定量分装。
人工重组的H5N6流感病毒H5-Re13株(保藏号为CCTCC NO：V202159，专利号ZL202111216162.5)具有H5亚型禽流感病毒A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)表面抗原血凝素(HA)，但HA裂解位点呈典型低致病性禽流感病毒分子特征(-RETR-)，HA基因分支为2.3.4.4h分支，属于我国H5亚型禽流感病毒的主流HA基因分支。该毒株以全球广泛使用的鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)的PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6个基因为重组病毒的内部基因供体，以2.3.4.4h分支H5N6病毒A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因为表面基因供体，但HA裂解位点修饰为典型低致病性禽流感病毒分子特征(-RETR-)，通过反向遗传操作技术，构建出的重组病毒H5-Re13株。重组病毒与H5-Re13株血清呈阳性反应，与H7、H9亚型禽流感阳性血清和新城疫、减蛋综合征阳性血清均呈阴性反应，HA基因氨基酸序列与A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)表面抗原血凝素(HA)氨基酸序列完全一致，但裂解位点呈低致病性分子特征。
人工重组的H5N8流感病毒H5-Re14株(保藏号为CCTCC NO：V202160，专利号ZL202111217660.1)具有H5亚型禽流感病毒A/swan/Shanxi/4-1/2020(H5N8)表面抗原血凝素(HA)，但HA裂解位点呈典型低致病性禽流感病毒分子特征(-RETR-)，HA基因分支为2.3.4.4b分支，属于我国H5亚型禽流感病毒的主流HA基因分支。该毒株以全球广泛使用的鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)的PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6个基因为重组病毒的内部基因供体，以2.3.4.4b分支H5N8病毒A/swan/Shanxi/4-1/2020(H5N8)表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因为表面基因供体，但HA裂解位点修饰为典型低致病性禽流感病毒分子特征(-RETR-)，通过反向遗传操作技术，构建出的重组病毒H5-Re14株。重组病毒与H5-Re14株血清呈阳性反应，与H7、H9亚型禽流感阳性血清和新城疫、减蛋综合征阳性血清均呈阴性反应，HA基因氨基酸序列与A/swan/Shanxi/4-1/2020(H5N8)表面抗原血凝素(HA)氨基酸序列完全一致，但裂解位点呈低致病性分子特征。
人工重组的H7N9流感病毒H7-Re4株(保藏号为CCTCC NO：V202161，专利号ZL202111217661.6)具有H7亚型禽流感病毒A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)表面抗原血凝素(HA)，但HA裂解位点氨基酸序列为-PKGR-，HA基因分支属于我国H7亚型禽流感病毒的主流HA基因分支。该毒株以全球广泛使用的鸡胚高滴度适应株A/PR/8/34(H1N1)的PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6个基因为重组病毒的内部基因供体，以H7N9病毒A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因为表面基因供体，但HA裂解位点修饰为典型低致病性禽流感病毒分子特征(-PKGR-)，通过反向遗传操作技术，构建出的重组病毒H7-Re4株。重组病毒具有H7N9病毒与H7-Re4株血清呈阳性反应，与H5、H9亚型禽流感阳性血清和新城疫、减蛋综合征阳性血清均呈阴性反应，HA基因氨基酸序列与A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)表面抗原血凝素(HA)氨基酸序列完全一致，但裂解位点呈低致病性分子特征。
H9N2亚型禽流感病毒CK/GX/S11583/2019株(保藏号为CCTCC NO：V202333)HA基因(SEQ ID No.1)分支属于我国H9亚型禽流感病毒的主流HA基因分支。该病毒与H9病毒血清呈阳性反应，与H5、H7亚型禽流感阳性血清和新城疫、减蛋综合征阳性血清均呈阴性反应；该毒株制备的血清可中和不同抗原群H9N2毒株，以其为种毒制备疫苗免疫后可抵御不同抗原群的H9N2病毒感染。
人工重组的新城疫病毒rLa-Ⅶ株(保藏号为CCTCC NO：V202334)具有基因Ⅶ型新城疫病毒chicken/Hebei/38/2006表面抗原血凝素(HN)，基因Ⅶ型属于我国新城疫病毒的主流基因型。该毒株以全球广泛使用的一株新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株为载体，通过反向遗传操作技术，以基因Ⅶ型新城疫病毒chicken/Hebei/38/2006株HN基因(SEQ ID No.2)替换NDV LaSota疫苗株HN基因，而构建出的重组病毒rLa-Ⅶ株。重组病毒具有基因Ⅶ新城疫强毒的保护性抗原(HN基因)，又保留了LaSota弱毒疫苗株的低致病性和高滴度的鸡胚生长特性，疫苗生产成本低廉，便于规模化生产。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明疫苗组合物中包含H5-Re14株H5N8亚型禽流感病毒疫苗、H5-Re13株H5N6亚型禽流感病毒疫苗、H7-Re4株H7N9亚型禽流感病毒疫苗、H9N2亚型禽流感病毒疫苗和rLa-Ⅶ株新城疫病毒疫苗，为五价疫苗，达到“一针防五病”的免疫保护效果，极大降低家禽免疫负担，具有广阔市场前景和重要应用价值。
保藏信息：
A型流感病毒(Influenza A virus)A/chicken/Guangxi/S11583/2019(H9N2)，简称H9N2亚型禽流感病毒CK/GX/S11583/2019，于2023年5月8日保藏于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：V202333。
新城疫病毒(Newcastledisease virus)NDV harbin/ND rLa-Ⅶ/2022，简称新城疫病毒rLa-Ⅶ，于2023年5月8日保藏于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：V202334。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
缩略语和关键术语定义
禽流感病毒(AIV)
新城疫病毒(NDV)
血凝素蛋白(HA)
血凝抑制试验(HI)
100倍鸡半数致死量(100CLD50)
鸡胚半数感染量(EID50)
实验材料
1.病毒株
疫苗组合物使用疫苗毒株：携带H5亚型2.3.4.4h分支病毒HA基因的人工重组的H5N6流感病毒H5-Re13株(保藏号为CCTCC NO：V202159，专利号ZL202111216162.5)，携带H5亚型2.3.4.4b分支病毒HA基因的人工重组的H5N8流感病毒H5-Re14株(保藏号为CCTCC NO：V202160，专利号ZL202111217660.1)，携带H7N9亚型禽流感病毒HA基因的人工重组的H7N9流感病毒H7-Re4株(保藏号为CCTCC NO：V202161，专利号ZL202111217661.6)，携带基因Ⅶ型新城疫病毒HN基因的人工重组的新城疫病毒rLa-Ⅶ株(以新城疫La sota株为基因背景，插入基因Ⅶ型新城疫病毒chicken/Hebei/38/2006的HN基因，rLa-Ⅶ株的保藏号为CCTCCNO：V202334)，以上病毒均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建和鉴定。H9N2亚型禽流感病毒CK/GX/S11583/2019株(保藏号为CCTCCNO：V202333)属于我国H9亚型主流HA基因分支禽流感病毒，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离和鉴定。以上5株病毒均保藏在位于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉的武汉大学，其中3株病毒(保藏号分别CCTCCNO：V202159、CCTCC NO：V202160、CCTCC NO：V202161)的保藏时间为2021年8月3日，另2株病毒(保藏号分别为CCTCC NO：V202334、CCTCC NO：V202333)的保藏时间为2023年5月8日。
疫苗组合物评估使用毒株：2.3.4.4h分支H5N6病毒A/duck/Fujian/S1424/2020(H5N6)(简称DK/FJ/S1424/20)分离自2020年福建鸭样品；2.3.4.4b分支H5N8病毒A/swan/Shanxi/4-1/2020(H5N8)(简称SW/SX/4-1/20)分离自2020年山西天鹅样品；H7亚型禽流感病毒A/chicken/Yunnan/SD024/2021(H7N9)(简称CK/YN/SD024/21)分离自2021年云南鸡样品；基因Ⅶ型新城疫病毒chicken/Hebei/38/2006(简称CK/HeB/38/2006)分离自2006年的鸡样品，以上病毒对鸡均呈高致病性，均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离、鉴定，均在该研究所的生物安全三级实验室内保存。申请人保证从申请日起二十年内可开放提供该生物材料。H9亚型禽流感病毒A/chicken/Guangxi/S11583/2019(H9N2)(简称CK/GX/S11583/2019株)分离自2019年广西鸡样品，为低致病性禽流感毒株，已提交中国典型培养物保藏中心(地址在中国武汉的武汉大学)。
2.鸡胚和SPF鸡
SPF鸡胚和SPF鸡购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/国家禽类实验动物资源库，易感鸡胚购自哈尔滨当地养殖场后孵化而得。
3.主要试剂
病毒RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；反转录试剂盒(ReverTraAce RT Kit)购自日本Toyobo公司；Ex-taq酶购自Takara公司；PCR产物纯化试剂盒(CYCLE-PURE-KIT)购自Omega公司；胶回收试剂盒(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System)购自Promega公司；测序试剂盒(ABI BigDye Terminator v3.1)购自美国Thermo Fisher公司。
4.引物
分析比较，设计合成H5-Re13株、H5-Re14株、H7-Re4株、H9N2-CK/GX/S11583/2019株株病毒主要抗原HA基因和rLa-Ⅶ株病毒抗原基因HN基因的特异性引物，合成引物序列见表1。
表1各疫苗种毒主要抗原基因鉴定引物序列
实施例1：H5亚型2.3.4.4h分支禽流感疫苗成分的制备与鉴定
1H5亚型2.3.4.4h分支病毒液的制备
1.1接种将H5亚型2.3.4.4h分支重组禽流感H5-Re13株毒种用灭菌生理盐水稀释至10-4，尿囊腔内接种10～11日龄健康易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36℃孵育，不必翻蛋。
1.2孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋，孵育至72小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置2～8℃冷却12小时。
1.3收获将冷却的鸡胚取出，消毒气室部位，然后以无菌剥除气室部卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，吸取胚液，放于同一灭菌的容器内，每组抽样测定HA效价。结果显示，接种后收获的病毒液HA价均为1∶256。
1.4病毒液的浓缩将H5-Re13株病毒液用适当的方法澄清，除去病毒液中的大颗粒物质，使其成为透明或半透明溶液后，将H5-Re13株病毒液浓缩至原体积的1/5，监测HA价。结果显示，浓缩后测定H5-Re13株病毒液HA效价为1∶1024。
1.5灭活将浓缩后的H5-Re13株病毒液混合于一个大容器内，吸出数毫升样品备测毒价。其余胚液加入甲醛溶液，边加边搅拌，使其充分混合。甲醛溶液的最终浓度为0.2％。置37℃灭活24小时，期间不停搅拌。取10日龄SPF鸡胚10枚，经尿囊腔接种灭活的H5-Re13株病毒液，每枚0.1ml。36℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定HA效价。结果显示，灭活尿囊液接种鸡胚后HA价为阴性；盲传1代，仍为阴性，表示灭活完全。
2H5亚型2.3.4.4h分支病毒液的鉴定
2.1HA基因鉴定取病毒液200μl，用RNA提取试剂盒提取病毒RNA，用上游引物ATGCATACAAAATCATCAAGACAGG和下游引物AGTCCAGACATCTAGGAATCCGTCT，经RT-PCR方法扩增含HA裂解位点的基因片段，全自动测序仪对扩增的PCR产物进行序列分析。结果显示，扩增病毒液HA基因裂解位点氨基酸序列应为-RETR-的典型低致病力分子特征，且与公开的H5亚型2.3.4.4h分支DK/FJ/S1424/20(H5N6)病毒的HA基因编码区第800位至第1311位核苷酸序列完全一致。
2.2病毒液无菌取灭活的H5-Re13株病毒液，进行无菌检验检验。结果显示，病毒液无菌生长。
实施例2：H5亚型2.3.4.4b分支禽流感疫苗成分的制备与鉴定
1H5亚型2.3.4.4b分支病毒液的制备
1.1接种将H5亚型2.3.4.4b分支重组禽流感H5-Re14株毒种用灭菌生理盐水稀释至10-4，尿囊腔内接种10～11日龄健康易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36℃孵育，不必翻蛋。
1.2孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋，孵育至72小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置2～8℃冷却12小时。
1.3收获将冷却的鸡胚取出，消毒气室部位，然后以无菌剥除气室部卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，吸取胚液，放于同一灭菌的容器内，每组抽样测定HA效价。结果显示，病毒液HA价均为1∶256。
1.4病毒液的浓缩将H5-Re14株病毒液用适当的方法澄清，除去病毒液中的大颗粒物质，使其成为透明或半透明溶液后，将H5-Re14株病毒液浓缩至原体积的1/5，并检测HA价。结果显示，H5-Re14株病毒液HA效价为1∶1024。
1.5灭活将浓缩后的H5-Re14株病毒液混合于一个大容器内，吸出数毫升样品备测毒价。其余胚液加入甲醛溶液，边加边搅拌，使其充分混合。甲醛溶液的最终浓度为0.2％。置37℃灭活24小时，期间不停搅拌。取10日龄SPF鸡胚10枚，经尿囊腔接种灭活的H5-Re14株病毒液，每枚0.1ml。36℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定HA效价。结果显示，灭活尿囊液接种鸡胚后HA价为阴性；盲传1代，仍为阴性，表示灭活完全。
2H5-Re14株病毒液的鉴定
2.1HA基因鉴定取收获病毒液200μl，用RNA提取试剂盒提取病毒RNA，用上游引物AAGAAAGGGGACTCAACAATTATGA和下游引物CCTTTCTAAGTTATTAAACTCCCTT，经RT-PCR方法扩增含HA裂解位点的基因片段，全自动测序仪对扩增的PCR产物进行序列分析。结果显示，扩增的病毒液HA基因裂解位点氨基酸序列应为-RETR-的典型低致病力分子特征，且与公开的H5亚型2.3.4.4b分支SW/SX/4-1/20(H5N8)(2.3.4.4b分支)病毒的HA基因编码区第820位至第1260位区域核苷酸序列完全一致。
2.2病毒液无菌检验取灭活的H5-Re14株病毒液，进行检验。结果显示，病毒液无菌生长。
实施例3：H7亚型禽流感疫苗成分的制备与鉴定
1H7亚型禽流感病毒液的制备
1.1接种将H7亚型重组禽流感H7-Re4株毒种用灭菌生理盐水稀释至10-4，尿囊腔内接种10～11日龄健康易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36℃孵育，不必翻蛋。
1.2孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋，孵育至72小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置2～8℃冷却12小时。
1.3收获将冷却的鸡胚取出，消毒气室部位，然后以无菌剥除气室部卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，吸取胚液，放于同一灭菌的容器内，每组抽样测定HA效价。结果显示，收获的病毒也HA价均为1∶256。
1.4病毒液的浓缩将H7-Re4株病毒液用适当的方法澄清，除去病毒液中的大颗粒物质，使其成为透明或半透明溶液后，将H7-Re4株病毒液浓缩至原体积的1/5，且H7-Re4株株病毒液HA效价均为1∶1024时可用于制苗。
1.5灭活将浓缩后的H7-Re4株病毒液混合于一个大容器内，吸出数毫升样品备测毒价。其余胚液加入甲醛溶液，边加边搅拌，使其充分混合。甲醛溶液的最终浓度为0.2％。置37℃灭活24小时，期间不停搅拌。取10日龄SPF鸡胚10枚，经尿囊腔接种灭活的H5-Re13株病毒液，每枚0.1ml。36℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定HA效价。结果显示，灭活尿囊液接种鸡胚后HA价为阴性；盲传1代，仍为阴性，表示灭活完全。
2H7-Re4株病毒液的鉴定
2.1HA基因鉴定取毒种200μl，用RNA提取试剂盒提取病毒RNA，用上游引物ATAGCTCCAGATCGTGCAAGCTTCC和下游引物TTATAGAATCTCTGGTCCAATTTAT，经RT-PCR方法扩增含受体结合位点及HA裂解位点的基因片段，全自动测序仪对扩增的PCR产物进行序列分析。结果显示，H7-Re4株毒种HA基因裂解位点氨基酸序列为-PEVPKGR↓GLF-，符合禽流感H7亚型病毒低致病力分子特征，且与公开的H7N9亚型CK/YN/SD024/21(H7N9)病毒的HA基因编码区第781位至1294位区域核苷酸序列完全一致。
2.2灭活病毒液检验取灭活的H7-Re4株病毒液，进行检验。结果显示，病毒液无菌生长。
实施例4：H9亚型禽流感疫苗成分的制备与鉴定
1H9亚型禽流感病毒液的制备
H9N2亚型禽流感病毒CK/GX/S11583/2019株为经过对全国分离的H9N2病毒大量中和试验筛选而得；可中和不同抗原群H9N2毒株，以其为种毒制备疫苗免疫后可抵御不同抗原群的H9N2病毒感染。
1.1接种将H9亚型重组禽流感H9N2-CK/GX/S11583/2019株毒种用灭菌生理盐水稀释至10-4，尿囊腔内接种10～11日龄健康易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36℃孵育，不必翻蛋。
1.2孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋，孵育至72小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置2～8℃冷却12小时。
1.3收获将冷却的鸡胚取出，消毒气室部位，然后以无菌剥除气室部卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜，吸取胚液，放于同一灭菌的容器内，每组抽样测定HA效价。结果显示，收获的病毒液HA价均为1∶512。
1.4病毒液的浓缩将H9N2-CK/GX/S11583/2019株株病毒液用适当的方法澄清，除去病毒液中的大颗粒物质，使其成为透明或半透明溶液后，将H9N2-CK/GX/S11583/2019株株病毒液浓缩至原体积的1/5，病毒液HA效价均为1∶1024时可用于制苗。
1.5灭活将浓缩后的H9N2-CK/GX/S11583/2019株株病毒液混合于一个大容器内，吸出数毫升样品备测毒价。其余胚液加入甲醛溶液，边加边搅拌，使其充分混合。甲醛溶液的最终浓度为0.2％。置37℃灭活24小时，期间不停搅拌。取10日龄SPF鸡胚10枚，经尿囊腔接种灭活的H9N2-CK/GX/S11583/2019株病毒液，每枚0.1ml。36℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定HA效价。结果显示，灭活尿囊液接种鸡胚后HA价为阴性；盲传1代，仍为阴性，表示灭活完全。
2H9N2-CK/GX/S11583/2019株病毒液的鉴定
2.1HA基因鉴定取毒种200μl，用RNA提取试剂盒提取病毒RNA，用上游引物CAATCACTCAAGATGGAGACAGTATCAC和下游引物CGGTTAATATATGTTTACAACGTAGACG，经RT-PCR方法扩增含受体结合位点及HA裂解位点的基因片段，全自动测序仪对扩增的PCR产物进行序列分析。结果显示，H9N2-CK/GX/S11583/2019株毒种HA基因扩增序列与H9N2亚型CK/GX/S11583/19(H9N2)病毒的HA基因编码区核苷酸序列完全一致。HA基因序列如SEQ ID No.1所示。
2.2灭活病毒液检验取灭活的H9N2-CK/GX/S11583/2019株病毒液，进行检验。结果显示，病毒液无菌生长。
实施例5：新城疫ND rLa-Ⅶ株疫苗成分的制备与鉴定
1ND rLa-Ⅶ株病毒液的制备
ND rLa-Ⅶ株病毒的构建参考禽流感(H5亚型)重组新城疫活载体疫苗(rLa-H5株)构建(Ge,JVI,2007)进行：以全球广泛使用的一株新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株为载体，通过反向遗传操作技术，以基因Ⅶ型新城疫病毒chicken/Hebei/38/2006株HN基因替换NDVLaSota疫苗株HN基因，而构建出的重组病毒rLa-Ⅶ株。重组病毒具有基因Ⅶ新城疫强毒的保护性抗原(HN基因)，又保留了LaSota弱毒疫苗株的低致病性和高滴度的鸡胚生长特性，疫苗生产成本低廉，便于规模化生产。
1.1接种将毒种用灭菌生理盐水稀释至10-4，尿囊腔内接种10～11日龄健康易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置37℃孵育，不必翻蛋。
1.2孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋，将24小时内死亡鸡胚弃去。24小时后死亡的鸡胚随时取出，至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置2～8℃冷却12小时。
1.3收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液，放于同一灭菌的容器内，每组抽样测定HA效价，应不低于1∶256。收获的胚液灭活前置2～8℃保存，应不超过3日。
1.4病毒液的浓缩将ND rLa-Ⅶ株病毒液用适当的方法澄清，除去病毒液中的大颗粒物质，使其成为透明或半透明溶液后，将rLa-Ⅶ株病毒液浓缩至原体积的1/5，检测病毒液HA价。结果显示，浓缩后rLa-Ⅶ株病毒液HA效价为1∶1024。
1.5灭活将浓缩后的ND rLa-Ⅶ株病毒液混合于一个大容器内，吸出数毫升样品备测毒价。其余胚液加入甲醛溶液，边加边搅拌，使其充分混合。甲醛溶液的最终浓度为0.2％。置37℃灭活24小时，期间不停搅拌。取10日龄SPF鸡胚10枚，经尿囊腔接种灭活的NDrLa-Ⅶ株病毒液，每枚0.1ml。36℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定HA效价。结果显示，灭活尿囊液接种鸡胚后HA价为阴性；盲传1代，仍为阴性，表示灭活完全。
2ND rLa-Ⅶ株病毒液的鉴定
2.1HN基因鉴定取毒种200μl，用RNA提取试剂盒提取病毒RNA，用上游引物CTGTTATTGGCAGTGTAGC和下游引物ATAAAGTGCCTGGATGGT，经RT-PCR方法扩增HN基因片段，全自动测序仪对扩增的PCR产物进行序列分析。结果显示，病毒液HA基因扩增片段与基因Ⅶ型CK/HeB/38/2006(ND)的HN基因全长核苷酸序列应完全一致。HN基因序列如SEQ ID No.2所示。
2.2灭活病毒液无菌检验取灭活的ND rLa-Ⅶ株病毒液，进行检验。结果显示，灭活的病毒液无菌生长。
实施例6：禽流感(H5+H7+H9)、新城疫五价疫苗复合物的制备和免疫效果评估
1疫苗的制备
1.1油相制备取注射用白油95份，司盘-80 5份，混匀后，121℃高压灭菌20分钟，冷却后备用。
1.2水相制备取灭菌冷却后的吐温-80 7份，加检验合格的H5-Re13株、H5-Re14株、H7-Re4株、H9N2-CK/GX/S11583/2019株和ND rLa-Ⅶ株病毒液各18.6份，充分搅拌至吐温-80完全溶解。
1.3乳化取油相3份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢加入水相1份，进行充分搅拌乳化；定量分装，加盖密封，并粘贴标签。
按照上述方法连续制备3批次疫苗，批号分别2023001、2023002、2023003。
1.4疫苗物理性状及无菌检验
1.4.1性状检验按以下方法进行。
1.4.1.1外观观察疫苗的颜色、状态，疫苗为乳白色均匀乳剂。
1.4.1.2剂型取一支清洁吸管，吸取少许疫苗滴于冷水表面，观察状态。结果显示，疫苗在冷水表面7秒钟不扩散。
1.4.1.3稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，测定管底析出水量。结果显示，疫苗离心后无水相析出。
1.4.1.4黏度按照现行《中国兽药典》附录进行测定3批疫苗的黏度分布为56.9cP、57.3cP、58.5cP。
1.4.2无菌检验和甲醛含量测定按照现行《中国兽药典》附录进行。结果表明，3批次疫苗均无细菌污染，加强含量在0.03％-0.04％范围。
表2 3批疫苗性状、无菌和甲醛含量检验结果
2.疫苗的安全性评估
将每批疫苗用4周龄SPF鸡10只，各颈部皮下或胸部肌肉注射疫苗2.0ml，各10只，连续观察14日，应全部健活，且不出现因疫苗引起的局部或全身不良反应。结果表明，该疫苗对鸡具有良好的安全性。
表3 3批疫苗安全检验结果
3.疫苗的免疫效力评估
3.1疫苗免疫对H5亚型2.3.4.4h分支禽流感病毒的预防效果
3.1.1方法将制备的3批油乳剂灭活疫苗以0.3ml/只的剂量、不同接种方式免疫30只3周龄SPF鸡，另设10只SPF鸡不接种疫苗作为空白对照组。在免疫后第3周，采血分离血清，进行HI抗体测定；并参考现有疫苗免疫攻毒方法，使用H5亚型2.3.4.4h分支DK/FJ/S1424/2020(H5N6)株(鼻腔感染方式，每只100CLD50剂量)，进行人工攻毒效力评估，攻毒后观察试验鸡发病死亡、情况，并在攻毒后采集3日和5日喉头及泄殖腔拭子样品，接种9-11日龄鸡胚，检测排毒情况(喉头或泄殖腔拭子样品接种鸡胚后HA呈阴性样品，则再次接种鸡胚盲传一代，HA价仍为阴性，则判定该样品为阴性；喉头和泄殖腔样品均为阴性，则表明该只鸡排毒阴性)，以评估疫苗对H5亚型2.3.4.4h分支病毒的免疫保护效力。
3.1.2抗体测定结果用3批疫苗分别免疫SPF鸡3周时，采血测定抗体。结果显示，疫苗免疫后3周H5亚型H5-Re13株HI抗体平均值分别为7.8log2、7.9log2和8.1log2，对照组抗体均＜1log2，结果见表4。
表4疫苗免疫后对H5亚型2.3.4.4h分支禽流感病毒株HI抗体测定结果
3.2.2攻毒结果将3批疫苗免疫SPF鸡21天后分别用H5亚型2.3.4.4h分支毒株攻毒，疫苗免疫组鸡均全部健活，病毒分离阴性数均为10/10；对照组全部发病、死亡，而且10/10病毒分离阳性。结果详见表5。
表5疫苗免疫鸡攻击对H5亚型2.3.4.4h分支禽流感病毒的结果
*表示攻毒后5日内，对照鸡全部发病死亡。
3.2疫苗免疫对H5亚型2.3.4.4b分支禽流感病毒的预防效果
3.2.1方法将制备的3批油乳剂灭活疫苗以0.3ml/只的剂量、不同接种方式免疫30只3周龄SPF鸡，另设10只SPF鸡不接种疫苗作为空白对照组。在免疫后第3周，采血分离血清，进行HI抗体测定；并使用H5亚型2.3.4.4b分支SW/SX/4-1/2020(H5N8)株(鼻腔感染方式，每只100CLD50剂量)，进行人工攻毒效力评估，攻毒后观察试验鸡发病死亡、情况，并在攻毒后采集3日和5日喉头及泄殖腔拭子样品，接种9-11日龄鸡胚，检测排毒情况(喉头或泄殖腔拭子样品接种鸡胚后HA呈阴性样品，则再次接种鸡胚盲传一代，HA价仍为阴性，则判定该样品为阴性；喉头和泄殖腔样品均为阴性，则表明该只鸡排毒阴性)，以评估疫苗对H5亚型2.3.4.4b分支病毒的免疫预防效力。
3.2.2抗体测定结果用3批疫苗分别免疫SPF鸡3周时，采血测定抗体。结果显示，疫苗免疫后3周H5亚型H5-Re14株HI抗体平均值分别为8.0log2、7.9log2和8.1log2，对照组抗体均＜1log2，结果见表6。
表6疫苗免疫后对H5亚型2.3.4.4b分支禽流感病毒株HI抗体测定结果
3.2.3攻毒结果将3批疫苗免疫SPF鸡21天后，用H5亚型2.3.4.4b分支毒株分别攻毒，免疫组鸡均全部健活，病毒分离阴性数均为10/10；对照组全部发病、死亡，而且10/10病毒分离阳性。结果详见表7。
表7疫苗免疫鸡攻击H5亚型2.3.4.4b分支禽流感病毒株的结果
*表示攻毒后5日内，对照鸡全部发病死亡。
3.3疫苗免疫对H7N9亚型禽流感病毒的预防效果
3.3.1方法将制备的3批油乳剂灭活疫苗以0.3ml/只的剂量、不同接种方式免疫30只3周龄SPF鸡，另设10只SPF鸡不接种疫苗作为空白对照组。在免疫后第3周，采血分离血清，进行HI抗体测定；并使用H7N9亚型CK/YN/SD024/21(H7N9)株(鼻腔感染方式，每只100CLD50剂量)，进行人工攻毒效力评估，攻毒后观察试验鸡发病死亡、情况，并在攻毒后采集3日和5日喉头及泄殖腔拭子样品，接种9-11日龄鸡胚，检测排毒情况(喉头或泄殖腔拭子样品接种鸡胚后HA呈阴性样品，则再次接种鸡胚盲传一代，HA价仍为阴性，则判定该样品为阴性；喉头和泄殖腔样品均为阴性，则表明该只鸡排毒阴性)，以评估疫苗对H7N9亚型禽流感病毒的免疫预防作用。
3.3.2抗体测定结果用3批疫苗分别免疫SPF鸡3周时，采血测定抗体。结果显示，疫苗免疫SPF鸡后3周H7亚型H7-Re4株HI抗体平均值分别为7.8log2、7.8log2和8.0log2，对照组抗体均＜1log2，结果详见表8。
表8免疫后H7亚型禽流感HI抗体测定结果
3.3.3攻毒结果将3批疫苗分别免疫SPF鸡3周时，攻击H7N9亚型禽流感强毒毒株。14日观察期内，各免疫组SPF鸡均全部存活，不发病、不排毒，均10/10保护；对照组全部发病、死亡，10/10病毒分离阳性。结果详见表9。
表9疫苗免疫鸡攻击H7N9亚型禽流感病毒的结果
*表示攻毒后5日内，对照鸡全部发病死亡。
3.4疫苗免疫对H9N2亚型禽流感病毒的预防效果
3.4.1方法将制备的3批油乳剂灭活疫苗以0.3ml/只的剂量、不同接种方式免疫30只3周龄SPF鸡，另设10只SPF鸡不接种疫苗作为空白对照组。在免疫后第3周，采血分离血清，进行HI抗体测定；并使用H9N2亚型H9N2-CK/GX/S11583/2019株株(H9N2)株(鼻腔感染方式，每只10CID50剂量)，进行人工攻毒效力评估，攻毒后观察试验鸡发病死亡、情况，并在攻毒后采集3日和5日喉头及泄殖腔拭子样品，接种9-11日龄鸡胚，检测排毒情况(喉头或泄殖腔拭子样品接种鸡胚后HA呈阴性样品，则再次接种鸡胚盲传一代，HA价仍为阴性，则判定该样品为阴性；喉头和泄殖腔样品均为阴性，则表明该只鸡排毒阴性)，以评估疫苗对H9N2亚型禽流感病毒的免疫预防作用。
3.4.2抗体测定结果用3批疫苗分别免疫SPF鸡3周时，采血测定抗体。结果显示，疫苗免疫SPF鸡后3周H7亚型H7-Re4株HI抗体平均值分别为10.3log2、10.5log2和10.3log2，对照组抗体均＜2log2，结果详见表10。
表10免疫后H9亚型禽流感HI抗体测定结果
3.4.3攻毒结果将3批疫苗分别免疫SPF鸡3周时，攻击H7N9亚型禽流感强毒毒株。14日观察期内，各试验组鸡均全部存活，不发病；免疫组SPF鸡均不排毒，获得完全保护，对照组10/10病毒分离阳性。结果详见表11。
表11疫苗免疫鸡攻击H9N2亚型禽流感病毒的结果
3.5疫苗免疫对新城疫病毒的预防效果
3.5.1方法根据现行新城疫相关灭活疫苗的效力检验方法(使用常规剂量0.5ml/只的1/25进行疫苗接种检验)，将制备的3批油乳剂灭活疫苗以20μl/只的剂量、不同接种途径免疫30只3周龄SPF鸡，另设10只SPF鸡不接种疫苗作为空白对照组。在免疫后第3周，采血分离血清，进行HI抗体测定；并使用基因Ⅶ型新城疫病毒CK/HeB/38/2006株(肌肉注射方式，每只105EID50剂量)，进行人工攻毒效力评估，攻毒后观察试验鸡发病死亡、情况，并在攻毒后采集3日和5日喉头及泄殖腔拭子样品，接种9-11日龄鸡胚，检测排毒情况(喉头或泄殖腔拭子样品接种鸡胚后HA呈阴性样品，则再次接种鸡胚盲传一代，HA价仍为阴性，则判定该样品为阴性；喉头和泄殖腔样品均为阴性，则表明该只鸡排毒阴性)，以评估疫苗对基因Ⅶ型新城疫病毒的免疫预防作用。
3.5.2抗体测定结果用3批疫苗分别免疫SPF鸡3周时，采血测定抗体。结果显示，疫苗免疫SPF鸡后3周新城疫HI抗体平均值分别为6.2log2、6.0log2和6.0log2，对照组抗体均＜1log2，结果详见表12。
表12免疫后新城疫HI抗体测定结果
3.5.3攻毒结果将3批疫苗分别免疫SPF鸡3周时，攻击基因Ⅶ型新城疫病毒毒株。14日观察期内，各免疫组SPF鸡均全部存活，不发病、不排毒，均10/10保护；对照组全部发病、死亡，10/10病毒分离阳性。结果详见表13。
表13疫苗免疫鸡攻击新城疫病毒的结果
*表示攻毒后5日内，对照鸡全部发病死亡。
以上结果表明，禽流感(H5+H7+H9)、新城疫五价疫苗组合物以肌肉注射和颈部皮下免疫接种方式免疫鸡可以诱导出理想的HI抗体水平，能够完全抵御2.3.4.4h和2.3.4.4b分支H5亚型禽流感病毒、H7N9亚型禽流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒和ND病毒的攻击，具有同时预防禽流感(H5+H7+H9)、新城疫的免疫作用，达到“一针防多病”的效果。
Claims (4)
1.一种禽流感、新城疫病毒二联五价疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物含有保藏号为CCTCC NO：V202159的人工重组的H5N6流感病毒H5-Re13株、保藏号为CCTCC NO：V202160的人工重组的H5N8流感病毒H5-Re14株、保藏号为CCTCC NO：V202161的人工重组的H7N9流感病毒H7-Re4株、保藏号为CCTCC NO：V202333的H9N2亚型禽流感病毒CK/GX/S11583/2019株和保藏号为CCTCC NO：V202334的人工重组的新城疫病毒rLa-Ⅶ株。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述H5-Re13株、H5-Re14株、H7-Re4株、CK/GX/S11583/2019株和rLa-Ⅶ株病毒抗原的比例为1:1:1:1:1。
3.权利要求1或2所述的疫苗组合物在制备预防H5亚型禽流感2.3.4.4h分支病毒、H5亚型禽流感2.3.4.4b分支病毒、H7N9亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒感染的药物中的用途。
4.权利要求1或2所述的疫苗组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述H5-Re13株、H5-Re14株、H7-Re4株、CK/GX/S11583/2019株和rLa-Ⅶ株分别接种鸡胚，孵化培养后收获病毒液；分别浓缩5倍，经甲醛灭活后，按照抗原含量1:1:1:1:1的比例进行混合，添加佐剂后制备成油乳剂灭活疫苗。
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