CN107557346B - 一株h9亚型低致病性禽流感病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株H9亚型低致病性禽流感病毒，分类命名：H9亚型禽流感病毒X‑13毒株，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2017年7月26日，保藏编号：CCTCC NO：V201733。本发明提供的H9亚型禽流感病毒X‑13毒株具有良好的特异性和免疫原性，免疫鸡群能抵抗新型H9亚型禽流感病毒的感染。本发明作为对抗新型H9亚型禽流感病毒的疫苗毒株，可以预防禽类的H9亚型禽流感，也可以用于病毒的鉴定和流行病学的调查。

Description

一株H9亚型低致病性禽流感病毒及其应用

技术领域

本发明属于生物疫苗技术领域，具体涉及一株H9亚型低致病性禽流感病毒及其应用。

背景技术

禽流行性感冒(Avian Influenza，AI)简称禽流感，是由禽流感病毒(AvianInfluenza Virus，AIV)所引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。禽流感病毒属于正粘病毒科、流感病毒属、A型禽流感病毒。病毒粒子感染谱广，呈多形性、多宿主性。将禽流感按致病力和毒力的不同划分，可以分为三类，分别为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。低致病性禽流感主要以H9N2亚型为主，感染H9N2的临床症状主要表现为呼吸道症状，如：气管水肿、干酪样渗出物等。蛋鸡感染后症状不明显，多表现为产蛋率和孵化率下降。禽类感染禽流感病毒后表现的临床症状复杂，加之该病毒的亚型众多，各亚型间缺少交叉保护性，对养禽业危害巨大。

自从1994年我国首次在广东分离到H9N2亚型禽流感病毒以后，该病毒在我国广泛流行，主要危害表现为产蛋减少和混合感染致死等形式，对我国养禽业造成了巨大损失。为减少H9N2禽流感病毒的危害，自九十年代末起，以CK/GD/SS/94、CK/SD/6/96、和CK/SH/F/98等为代表的早期疫苗毒株在我国已经广泛使用，在我国早期H9亚型禽流感病毒的防控过程中发挥了巨大作用。然而，随着H9亚型禽流感病毒的不断变异，早期疫苗的保护效果开始下降。2010年河南省接种过疫苗的鸡场中，已经有零星的H9亚型禽流感暴发事件。

发明内容

本发明的目的是提供一株抗原特性不同于传统H9亚型禽流感疫苗毒株的新型H9亚型低致病性禽流感病毒毒株。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一株H9亚型低致病性禽流感病毒，分类命名：H9亚型禽流感病毒X-13毒株，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2017年7月26日，保藏编号：CCTCC NO：V201733。

如上述的H9亚型低致病性禽流感病毒在制备生产用种毒中的应用。

如上述的H9亚型低致病性禽流感病毒在制备H9亚型禽流感病毒诊断用抗原试剂中的应用。

如上述的H9亚型低致病性禽流感病毒在制备H9亚型禽流感病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。

如上述的H9亚型低致病性禽流感病毒在制备H9亚型禽流感病毒治疗用抗血清中试剂的应用。

一种预防禽流感的疫苗，所述疫苗的活性成分包含灭活后的上述的H9亚型低致病性禽流感病毒。

本发明的H9N2亚型禽流感病毒毒株具有下述特点：

(1)所述毒株为禽流感病毒H9N2亚型毒株；

(2)所述毒株具有抗原特异性；

(3)所述毒株具有免疫原性。

(4)所述毒株能突破早期H9亚型禽流感疫苗的保护。

相对于现有技术，本发明提供的H9亚型禽流感病毒X-13毒株具有良好的特异性和免疫原性，免疫鸡群能抵抗新型H9亚型禽流感病毒的感染。本发明作为对抗新型H9亚型禽流感病毒的疫苗毒株，可以预防禽类的H9亚型禽流感，也可以用于病毒的鉴定和流行病学的调查。

附图说明

图1是HA基因的PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳结果。

图2是NA基因的PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳结果。

图3是交叉保护试验的病毒检出率。

图4是交叉保护试验检出的病毒滴度。

具体实施方式

申请人自2010年起，在河南省监测到多起H9亚型禽流感暴发的事件，陆续从免疫过H9亚型传统疫苗的禽流感暴发鸡场中分离到了36株H9亚型禽流感病毒毒株。在这些H9亚型禽流感病毒毒株中，经过HA、NA基因的序列比对和HI交叉保护试验的比较，筛选出一株抗原性优秀、免疫原性好、免疫效力高的新型H9亚型禽流感病毒X-13毒株A/chicken/Henan/13/2010(H9N2亚型)。该病毒的抗原特性已经发生改变，可以突破早期疫苗株的保护，感染鸡群。随着H9亚型禽流感病毒的不断变化，该病毒毒株作为原有H9亚型疫苗毒株的更替和储备是很有意义的。

一株H9亚型低致病性禽流感病毒，分类命名：H9亚型禽流感病毒X-13毒株，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2017年7月26日，保藏编号：CCTCC NO：V201733。

如上述的H9亚型低致病性禽流感病毒在制备生产用种毒中的应用。

如上述的H9亚型低致病性禽流感病毒在制备H9亚型禽流感病毒诊断用抗原试剂中的应用。

如上述的H9亚型低致病性禽流感病毒在制备H9亚型禽流感病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。

如上述的H9亚型低致病性禽流感病毒在制备H9亚型禽流感病毒治疗用抗血清中试剂的应用。

一种预防禽流感的疫苗，所述疫苗的活性成分包含灭活后的上述的H9亚型低致病性禽流感病毒。

实施例1：H9亚型禽流感病毒X-13毒株的分离与鉴定

1.流行病学调查

调查鸡群的临床表现、剖检病变及死亡率等情况。2010年12月河南新郑某大型养鸡场的三黄肉鸡群开始出现食欲不振、精神沉郁、咳嗽甩头、打喷嚏、呼吸困难等症状。剖检发现，发病鸡呼吸系统和消化道均有明显的病理变化，气管环有严重充血、出血，肺脏严重充血出血，小肠淋巴结红肿出血，肝脏和肾脏肿大。部分病鸡发生急性死亡，使用各种抗生素治疗无明显好转。

2.病料采集与处理

选择临床症状典型的濒死鸡，无菌采集气管、泄殖腔棉拭子，按体积加入适量含青霉素1000U/mL、链霉素1000U/mL的灭菌生理盐水，混匀后置4℃冰箱抑菌反应2h，-30℃冰箱中反复冻融3次后6000rpm离心10min取上清液，0.22μm无菌滤器过滤备用。

3.病毒鸡胚接种

将病毒液尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，每枚胚0.2mL，37℃孵化，每8h照蛋1次，将24h以前死亡的鸡胚弃去。收获24h后死亡的鸡胚及96h未死亡活鸡胚，置4℃冰箱冷却8～16h，无菌收获尿囊液，连续盲传3～5代。测定血凝性，弃去效价不超过1：16的鸡胚尿囊液，收获其他鸡胚尿囊液。

4.HA试验及HI试验

取10份来自不同SPF鸡胚的尿囊液，按β微量法在96孔V型板上进行HA试验。具体操作与结果判定按《中华人民共和国兽药典》进行。结果见表1。然后分别用抗NDV、抗H9亚型、抗H7亚型、抗H5亚型禽流感病毒标准阳性血清进行HI试验。具体操作与结果判定按《中华人民共和国兽药典》进行。所有样品检测结果均为H9亚型，都不与其他血清反应。

表1 HA试验结果

5.病毒纯化

对于有血凝性的尿囊液进行3次终点稀释法克隆纯化病毒，即每一次均将病毒稀释至最小感染剂量，接种9～10日龄SPF鸡胚，置37℃孵育，每8h照胚一次，弃去24h内死亡鸡胚，96h后收集鸡胚尿囊液，测其HA效价，弃去效价不超过7log2的鸡胚。以上有限稀释方法重复三次，得到纯化的病毒。

6.基因的扩增与分析

取病毒液用病毒RNA提取试剂盒(TAKARA)提取RNA，进行反转录操作，反转录引物：5’-AGCAAAAGCAGG-3’。取5μL RNA加入1μL反转录引物，70℃水浴10min，冰浴5min。然后加入dNTP 1μL、反转录酶0.5μL、5×反转录酶Buffer 4μL、RNasin 0.5μL、ddH₂O 8μL，混匀后42℃水浴1h，70℃15min，所得即为反转录产物。反转录产物用PCR的方法扩增HA基因，其引物如下：

F1：5’-TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGG-3’，

R1：5’-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT，

用PCR的方法扩增NA基因，其引物如下：

F1：5’-TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGAGT-3’，

R1：5’-ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3’，HA与NA基因的PCR反应体系：模板2μL，上、下游引物各1μL，mix Taq预混酶12.5μL，ddH₂O 9.5μL，总体积25μL。反应程序：95℃5min；94℃20sec，58℃45sec，72℃2min，循环30次；72℃10min。HA预期扩增长度为1742+29bp，NA预期扩增长度为1413+29bp。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳观察。结果见图1、图2。

7.H9亚型禽流感X-13毒株的鸡胚半数感染量(EID₅₀)的测定

将H9亚型禽流感X-13毒株进行10倍梯度稀释，经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚鸡胚，接种量均为0.1mL，接种后用蜡密封，在37℃孵化器中培养，剔除24h内死亡胚，观察至96h，收集各组鸡胚尿囊液测定血凝价，效价不低于1：16判为感染。按Reed-Muench法计算每0.1mL细胞培养液中病毒的鸡胚半数感染量(EID₅₀)，结果见表2。

表2 H9亚型禽流感X-13毒株的EID₅₀

注:*分母表示总SPF鸡胚数，分子表示为感染的鸡胚数。

实施例2：H9亚型禽流感X-13株病毒抗原的制备

1.H9亚型禽流感X-13毒株种子批的制备

取纯化后的H9亚型禽流感X-13毒株用灭菌生理盐水10-⁴倍稀释，接种9～10日龄SPF鸡胚，每枚鸡胚尿囊腔内接种0.1mL，接种后用蜡密封，置37℃孵化器孵育，每8h照胚一次，剔除24h内死亡鸡胚，观察至96h。收获鸡胚尿囊液于灭菌容器内，测定血凝价，凡效价低于7log2的鸡胚应弃去。同时作无菌检查。收获的病毒液灭活前在-30℃以下冻存，应不超过3个月。

2.无菌检验

按《中华人民共和国兽药典》进行病毒液的无菌检验与支原体检验。

3.抗原灭活

将甲醛溶液加入到病毒液中，使其终浓度为0.2％(V/V)，震荡混匀后，转入另一无菌容器中，密封后37℃灭活24h，间隔4～6h震荡混匀一次。灭活后的病毒液取样品进行无菌检验。方法及判定标准按《中华人民共和国兽药典》进行。

4.乳化

油相的制备：取注射用白油、司本-80和硬脂酸铝按94：6：2的比例混合，加热至透明，经121℃高压灭菌后冷却备用，即为油相。

水相的制备：经灭活检验的病毒液按3％(V/V)加入灭菌后的司本-80，充分混合均匀，即成为水相。

乳化：取油相3份，打开电机慢速搅拌，然后徐徐加入1份水相，高速乳化至形成稳定油包水剂型。所制备得到的的免疫制品用于检验X-13病毒的免疫特性。

实施例3：H9亚型禽流感X-13毒株的免疫效果

1.血清学效力试验

50只7～10日龄SPF鸡随机分为2组，实验组30只，对照组20只。实验组于颈部皮下注射疫苗，接种免疫制剂剂量为0.3mL，其中抗原剂量为75μl。接种前采血1次，接种后每周采血一次，直到第5周。每次每组分别随机采血5只，分离血清，进行抗禽流感病毒H9亚型HI抗体的检测，结果取几何平均值。HI检测结果如表3所示，实验组免疫后28d达到高峰，之后也维持在高水平。

表3血清学效力检验

3.攻毒交叉保护试验

取70只3周龄的SPF鸡，取40只分为每组10只的1～4组，分别使用4种H9亚型禽流感商品疫苗：SS株(肇庆大华农生物药品有限公司，批号01708023)、SY株(杨凌绿方生物有限公司，批号20161004)、WD株(山东华宏生物工程有限公司，批号201703004)、YBF003株(青岛易邦生物工程有限公司，批号160271605)按照说明书进行免疫；取10只为第5组，作为X-13免疫组；取20只分别为每组10只的第6组和第7组，分别作为阳性对照组、阴性对照组。免疫3周后其抗体水平均达到较高水平，然后使用含有10⁶EID₅₀的X-13病毒液0.2mL静脉注射SPF鸡，攻毒5天后用棉拭子采集气管、泄殖腔分泌物，处理后每份病料接种SPF鸡胚，分别测定SPF鸡胚的血凝性，HA效价不低于1：16即判该病料为阳性，对于HA效价低于1：16的尿囊液盲传一代，如果HA效价不低于1：16仍然判该病料为阳性。根据阳性病料的数量计算出病毒检出率。根据以上结果，将同一组的阳性病料混合后，测定该组的平均病毒滴度(log10EID₅₀/mL)，反应出病毒的复制情况。结果如表4所示。使用1994年到2005年分离到的4种H9亚型禽流感商业疫苗免疫SPF鸡后，使用2010年分离到的H9亚型禽流感X-13毒株攻毒，攻毒5天后检测排毒，发现攻毒鸡的病毒检出率均在80％以上，即试验中4种早期的H9亚型禽流感商品化疫苗面对X-13病毒毒株的攻击，其产生的高水平抗体不能抵御X-13毒株的攻击。结果见图3、图4。

表4攻毒交叉保护试验

注：*分母表示攻毒鸡只数，分子表示病毒分离为阳性的鸡只数。“-”表示没有测定

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一株H9亚型低致病性禽流感病毒，分类命名：H9亚型禽流感病毒X-13毒株，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2017年7月26日，保藏编号：CCTCC NO：V201733。

2.如权利要求1所述的H9亚型低致病性禽流感病毒在制备生产用种毒中的应用。

3.如权利要求1所述的H9亚型低致病性禽流感病毒在制备H9亚型禽流感病毒诊断用抗原试剂中的应用。

4.如权利要求1所述的H9亚型低致病性禽流感病毒在制备H9亚型禽流感病毒诊断用阳性血清试剂中的应用。

5.如权利要求1所述的H9亚型低致病性禽流感病毒在制备H9亚型禽流感病毒治疗用抗血清中试剂的应用。

6.一种预防禽流感的疫苗，其特征在于：所述疫苗的活性成分包含灭活后的权利要求1所述的H9亚型低致病性禽流感病毒。

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