CN114350618A

CN114350618A - 一种猪流行性腹泻病毒及其应用

Info

Publication number: CN114350618A
Application number: CN202111676051.2A
Authority: CN
Inventors: 魏平华
Original assignee: Guangzhou Great Biological Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Great Biological Technology Co ltd
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114350618B

Abstract

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒及其应用，该猪流行性腹泻病毒命名为PEDV‑HuN，于2021年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20280。该毒株与传统毒株属于不同分支，传代稳定，病毒滴度高。基于其制备得到的灭活疫苗保护效果显著，能够完全预防当前猪流行性腹泻病毒流行毒株的侵害，降低了猪流行性腹泻病毒的感染率和死亡率，降低了养殖风险，保证了养猪业的稳定。

Description

一种猪流行性腹泻病毒及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是一种可引起猪发生以水样呕吐、腹泻、脱水为主要特征的肠道传染病，死亡率高达100％。PEDV感染除会造成仔猪的直接经济损失外，同时也会感染母猪，造成母猪泌乳减少或停止、回乳、情期紊乱等，对养猪业具有极高的危害性。

经典PEDV毒株感染力弱，传播速度慢，主要以地方性流行为主要流行特点。但近年来，世界范围内不断出现新的PEDV变异流行毒株，其特点主要为传播速度快、高发病率和高死亡率。这些PEDV变异毒株无论是在致病性还是流行特点方面都与以往的经典毒株有所不同，其基因水平差异甚大，同一性相对较低。但尽管不同国家和地区的分离毒株在基因序列有所差异，但它们都仍处在一个遗传分支上，而经典PEDV毒株则处在另外一个遗传分支。相关研究表明，相对经典毒株，变异毒株的主要抗原基因出现较大范围的插入、缺失和点突变，这表明变异毒株在整体上发生较大变异，这个PEDV的防治工作提出了较大的挑战。

因此，由于PEDV变异株的流行，市售商品化疫苗已无法产生有效的防护作用，开发能够有效防护PEDV变异株的疫苗及相关成产品对于养殖业具有极为重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种猪流行性腹泻病毒及其应用，发明人通过分离得到的新的流行性腹泻病毒毒株CH-HuN，基于该毒株制备得到的疫苗相较于传统毒株疫苗，产生更多的抗体，具有更好的保护效果，能够很好的应对当下流行的流行性腹泻病毒。

本发明的第一个方面，提供一种猪流行性腹泻病毒。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述猪流行性腹泻病毒被命名为猪传染性腹泻病毒(在实施例中，代称为CH-HuN或PEDV-HuN)，其于2021年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为：CGMCC No.20280。

发明人经过测序发现，该毒株属于猪流行性腹泻病毒，但其与经典的猪流行性腹泻病毒株分属于不同分支，且同一性较低。该毒株的TCID₅₀值为10^-6.46TCID₅₀/0.2mL。

本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的猪流行性腹泻病毒作为猪流行性腹泻病毒疫苗候选株的应用。

发明人经过测序发现，该毒株属于猪流行性腹泻病毒，但其与经典的猪流行性腹泻病毒株分属于不同分支，因此，可以作为猪流行性腹泻病毒疫苗候选株，以应对当下流行的猪流行性腹泻病毒的爆发。

本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的猪流行性腹泻病毒在制备用于预防和/或控制猪流行性腹泻病毒引起的相关疾病的药物中的应用。

本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的猪流行性腹泻病毒在制备猪流行性腹泻病毒疫苗中的应用。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述猪流行性腹泻病毒疫苗的适用对象包括妊娠期母猪和仔猪。

当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，将该猪流行性腹泻病毒疫苗用于其他类型的猪或用于其他牲畜。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述猪流行性腹泻病毒疫苗为灭活疫苗。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，用于制备猪流行性腹泻病毒疫苗的猪流行性腹泻病毒的病毒液中的病毒含量≥10^-6.0TCID₅₀/0.2mL。

在本发明的一些优选实施方式中，所述猪流行性腹泻病毒疫苗还含有药学上可接受的佐剂或载体。

在本发明的一些优选实施方式中，所述佐剂为化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂和生化类免疫佐剂中的一种或几种。

根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述猪流行性腹泻病毒疫苗的制备方法为：

(1)取本发明第一个方面所述的猪流行性腹泻病毒(病毒含量≥10^-6.0TCID₅₀/0.2mL)接种至Vero细胞上进行扩繁；

(2)离心回收病毒液，灭活得到抗原；

(3)将抗原加入水相中，与油相溶液混合后即得灭活疫苗。

在本发明的一些优选实施方式中，步骤(2)中所述灭活采用终浓度0.2％的甲醛进行灭活。

在本发明的一些优选实施方式中，步骤(3)的具体操作为：

油相制备：将注射用白油与司本-80按96∶4比例(v/v)混合，以质量份计，再加入硬脂酸铝2份，充分混匀后，高压蒸气灭菌后得到油相溶液。

水相制备：以质量份计，将96份步骤(1)中得到的抗原液与4份灭菌后的吐温-80混合，充分振摇后使吐温-80完全溶解，制成水相溶液。

乳化：将上述制备得到的油相溶液和水相溶液按1:1的比例(v/v)进行混合，8000～12000r/min条件下乳化3次，每次2～3分钟，得到免疫用灭活疫苗。

本发明的第五个方面，提供一种猪流行性腹泻病毒疫苗，该疫苗中包括本发明第一个方面所述的猪流行性腹泻病毒。

根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述猪流行性腹泻病毒疫苗的适用对象包括妊娠期母猪和仔猪。

根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述猪流行性腹泻病毒疫苗为灭活疫苗。

根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，用于制备猪流行性腹泻病毒疫苗的猪流行性腹泻病毒的病毒液中的病毒含量≥10^-6.0TCID₅₀/0.2mL。

根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述猪流行性腹泻病毒疫苗的制备方法为：

(2)离心回收病毒液，灭活得到抗原；

(3)将抗原加入水相中，与油相溶液混合后即得灭活疫苗。

在本发明的一些优选实施方式中，步骤(3)的具体操作为：

本发明的有益效果是：

本发明发现了一株猪流行性腹泻病毒PEDV-HuN，该毒株与传统毒株属于不同分支，传代稳定，病毒滴度高，生产性能好。

本发明中的猪流行性腹泻病毒PEDV-HuN可灭活后作为抗原使用，基于该抗原制备得到的疫苗保护效果显著，能够完全预防当前猪流行性腹泻病毒流行毒株的侵害，降低了猪流行性腹泻病毒的感染率和死亡率，降低了养殖风险，保证了养猪业的稳定。

本发明中的猪流行性腹泻病毒疫苗制备方法简单，免疫效果强，具有极好的应用价值和医用价值。

附图说明

图1为本发明实施例中的猪流行性腹泻病毒毒株的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明实施例中的猪流行性腹泻病毒毒株序列同源比对进化分析结果。

图3为本发明实施例中的猪流行性腹泻病毒毒株的毒性检测实物图，其中，A为攻毒组仔猪感染后的表征记录照片，B为猪流行性腹泻病毒感染死亡仔猪的病理解剖图。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

猪流行性腹泻疫苗毒株CH-HuN的分离与鉴定

本发明实施例中的猪流行性腹泻病毒CH-HuN株是发明人2014年从湖南省郴州市某发病猪场仔猪小肠组织中分离得到的。该毒株(分类命名为：猪传染性腹泻病毒，PEDV-HuN)于2021年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为：CGMCC No.20280。

病毒毒株的分离培养：

无菌条件下，剪取上述实施例中获得的仔猪小肠组织，使用匀浆器研磨均匀，加入5倍体积的无血清MEM(购自Gibco)，同时补充1％双抗，混合均匀，得到组织匀浆。将组织匀浆置于-70℃冰箱反复冻融三次，于4℃、8000rpm离心收集上清液，并将上清液用0.22μm过滤器过滤，得到病料液，分装保存于-70℃冰箱备用。

取适量非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)培养，待Vero细胞长至80％密度且状态良好时，弃掉培养基，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入5mL无血清的MEM培养基，同时加入2mL上述实施例中制备的病料液，混匀后置于37℃、5％CO₂培养箱孵育1h，补充无血清MEM培养基至15mL。加入胰蛋白酶(其终质量浓度为6μg/mL)，充分摇匀，然后置于37℃、5％CO₂培养箱培养24～72小时，待80％细胞产生细胞病变时收获细胞病毒培养液。同时培养正常Vero细胞作为对照组。

病毒毒株的鉴定：

取上述实施例制备得到的细胞病毒培养液，用RNA提取试剂盒(购自OMEGA公司)，按照说明书操作提取总RNA，并将RNA使用反转录试剂盒(购自OMEGA公司)，按照说明书操作反转为cDNA。以得到的cDNA为模板进行RT-PCR反应，扩增产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

RT-PCR反应体系如表1所示。

表1猪流行性腹泻病毒CH-HuN株RT-PCR反应体系

组分	体积(μL)
		10μM上游引物	2
10μM下游引物	2
		HotStar premix Taq	25
cDNA	4
		ddH<sub>2</sub>O	17
总体积	50

在本实施例中，引物根据Genbank登录的PEDV病毒S1、ORF3、N基因序列设计得到，共3对特异性扩增引物(核苷酸序列如表2所示)，该引物均由生工生物工程技术有限公司合成。

表2 PEDV病毒相关基因PCR扩增引物

RT-PCR反应程序如表3所示。

表3猪流行性腹泻病毒CH-HuN13株RT-PCR反应条件

1％的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。

如图1所示，以DL 5000作为marker，ORF3、S1、N基因为PEDV基因组成部分，其中ORF3是PEDV基因组中唯一的辅助基因，编码蛋白与病毒毒力相关；S1是编码纤突的基因序列，具有特征性变异；N是N基因，编码病毒N蛋白，参与病毒装配及转录复制。NC是正常细胞，F3是本实施例中的病毒的Vero细胞培养物第三代，F5是病毒的Vero细胞培养物第五代。1000与2000bp之间的那个条带是Marker的1500bp条带。

回收扩增产物，送至华大基因进行序列测定。然后使用DNAStar和Mega等分子生物软件对测定序列于GenBank中的PEDV参考序列进行比对分析并绘制进化树，结果如图2所示，可以发现，上述实施例中分离得到的猪流行性腹泻病毒CH-HuN株(图2中的CH-HuN13)属于当前流行毒株，与经典的猪流行性腹泻病毒株分属于不同分支。

猪流行性腹泻疫苗毒株CH-HuN的毒性检测

在本实施例中，采用动物回归试验检测新毒株毒性，具体检测步骤为：

取1日龄PEDV抗体阴性仔猪8头，分为2组(每组4只)。一组为攻毒组，另一组为正常对照组。

攻毒组：每头灌服上述实施例中制备得到的病料液3mL；

正常对照组：每头灌服灭菌的pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)3mL。

灌服后每隔2小时观察仔猪临床状态并记录，若出现死亡则进行解剖观察内脏器官病变情况。

结果如图3所示。

图3为本发明实施例中的猪流行性腹泻病毒毒株的毒性检测实物图，图3A为攻毒后仔猪出现采食减少、拉稀、精神沉郁症状的相关照片记录，而图3B则显示出死亡时间集中在48～72小时内解剖的仔猪胃内仍有未消化乳块、小肠壁变薄鼓气，说明确实感染了猪流行性腹泻病毒，且受病毒感染而亡。

为了进一步探究猪流行性腹泻疫苗毒株CH-HuN的毒性，对其TCID50进行测定，具体步骤为：

用无血清MEM培养基将上述实施例中制备得到的CH-HuN病料液进行10倍等比稀释，取10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10共10个稀释度，每个稀释度接种等量Vero细胞各5孔，以正常Vero细胞作空白对照。置于37℃、5％CO₂培养箱培养24～72小时，每隔12小时观察一次细胞病变情况，记录各稀释度的病变孔数，并使用Reed-Mueeh法计算TCID₅₀。

结果如表4所示。

表4 CH-HuN毒株TCID₅₀测定结果

CPE数表示细胞病变数量。

结果发现，可以发现，在10^-5稀释梯度时，CPE比例既可以达到100％，有效TCID₅₀值为10^-6.46TCID₅₀/0.2mL。

猪流行性腹泻疫苗的制备

(1)抗原的制备：

将上述实施例中的CH-HuN毒株作为生产种子(病毒含量≥10^-6.0TCID₅₀/0.2mL)，以5MOI接种于长至80％的状态良好的Vero细胞上，摇匀，加入含有胰蛋白酶(终质量浓度6μg/mL)的无血清MEM培养基，于37℃、5％CO₂培养箱培养24～72小时，待80％细胞产生细胞病变时收获细胞病毒培养液，反复冻融3次后，经3000r/min离心10分钟，收集上清液，加入终浓度0.2％甲醛灭活，即为抗原液。

收获的抗原利用Vero细胞进行TCID₅₀测定，方法同上述实施例。

经测定，培养的抗原病毒含量为10^-6.68TCID₅₀/0.2mL。

(2)疫苗的制备：

对疫苗成品进行病毒含量测定，并按照《中华人民共和国兽药典》方法进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验。

结果发现制备得到的疫苗成品均符合各项要求。

猪流行性腹泻疫苗稳定性试验

(1)极端高温存放稳定性：

将上述实施例中制备得到的疫苗成品于37℃放置7d，测定毒价变化(TCID₅₀)，测定方法同上述实施例。

结果发现经过7d(37℃)放置后，毒价下降10^-0.23TCID₅₀，毒价下降不显著，表明疫苗的稳定性较好，能够在37℃条件下有效存放7d。

(2)冷藏稳定性：

将上述实施例中制备得到的疫苗成品放置于-20℃冰箱，分别于冷藏0个月、12个月、24个月、36个月时测定其毒价变化。

结果如表5所示。

表5疫苗成品冷藏不同时间后的毒价变化

可以发现，上述实施例中制备得到的疫苗成品在保存1年后，毒价保持不变，在保存3年后仅下降0.38个滴度，说明上述实施例中制备得到的疫苗成品稳定性较好。

免疫原性试验

取7日龄PEDV抗体阴性仔猪9头，随机分为3组，每组3头。分别接种上述实施例中的疫苗、传统毒株疫苗(洛阳普莱柯生物工程有限公司生产猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联灭活疫苗，抗原为猪流行性腹泻病毒CV777株)和等量生理盐水。接种方式为肌肉注射。免疫后14d测定抗体效价，比较不同组免疫猪的抗体水平，抗体检测方法采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)，具体使用PEDV IgA抗体检测试剂盒(购自IDEXX)进行检测，操作方法参考使用说明书。

结果如表6所示。

表6免疫原性试验结果

接种物	上述实施例中的疫苗	传统毒株疫苗	生理盐水
				抗体水平	1:256	1:64	<1:4

从上述结果可以发现，采用上述实施例中的疫苗相较于传统毒株疫苗能够产生更好的免疫效果，抗体水平显著上升。

上述实施例中的疫苗的实际应用

为了进一步验证上述实施例中的疫苗的实际保护效果，发明人随机选择妊娠60d的母猪6头，随机分为三组，每组2头，A组肌肉注射上述实施例中的疫苗(1头份/头)，B组肌肉注射1头份传统毒株疫苗，C组作为对照不进行免疫。A、B两组首次免疫后均间隔14d以同样的方法进行二次免疫。检测母猪的抗体水平，检测方法同上述实施例。

从每组每头母猪所产的7日龄仔猪中随机挑选4头，采用上述实施例中制备得到的CH-HuN病料液进行灌服攻毒，观察仔猪的临床症状，确定攻毒保护力情况。

结果如表6所示。

表6疫苗被动免疫试验结果

接种物	上述实施例中的疫苗	传统毒株疫苗	对照组
				母猪抗体水平	1:256	1:64	<1:4
仔猪保护率	100％	62.5％	0

结果发现，接种上述实施例中的疫苗的免疫母猪所产仔猪可抵御CH-HuN强毒的攻击，疫苗保护率为100％，而使用传统毒株疫苗的保护率仅为62.5％(8头仔猪中3头出现感染死亡)，而未免疫的母猪所产仔猪攻毒后全部发病死亡，说明接种上述实施例中的疫苗对于母猪所产仔猪具有极好的保护效果，能够有效抵抗强毒的攻击，保证仔猪的生存能力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州格雷特生物科技有限公司

<120> 一种猪流行性腹泻病毒及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaagtctt taacttactt ctggttg 27

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcaccacta gtgacattct taaag 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtttcttg gactttttca atac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

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<400> 4

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<211> 21

<212> DNA

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<400> 5

atggcttctg tcagctttca g 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atttcctgta tcgaagatct cg 22

Claims

1.一种猪流行性腹泻病毒，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒命名为猪传染性腹泻病毒，于2021年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20280。

2.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒作为猪流行性腹泻病毒疫苗候选株的应用。

3.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒在制备用于预防和/或控制猪流行性腹泻病毒引起的相关疾病的药物中的应用。

4.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒在制备猪流行性腹泻病毒疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒疫苗的适用对象包括妊娠期母猪和仔猪。

6.一种猪流行性腹泻病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗中包括如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒。

7.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒疫苗，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒疫苗为灭活疫苗。

8.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒疫苗，其特征在于，用于制备猪流行性腹泻病毒疫苗的猪流行性腹泻病毒的病毒液中的病毒含量≥10^-6.0TCID₅₀/0.2mL。

9.根据权利要求7～8任一项所述的猪流行性腹泻病毒疫苗，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒疫苗还含有药学上可接受的佐剂或载体。

10.根据权利要求9所述的猪流行性腹泻病毒疫苗，其特征在于，所述佐剂为化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂和生化类免疫佐剂中的一种或几种。