CN103725651A - 一株猪流行性腹泻病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株猪流行性腹泻病毒弱毒株ZJ08株及其应用。本发明弱毒株的微生物保藏号是：CGMCC No.7806。本发明PEDV弱毒株安全性好，对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪均安全。该毒株对3日龄仔猪的主动保护率达100%，被动保护率达94.7%以上，表明本发明对于猪流行性腹泻具有良好的免疫保护效果。

Description

一株猪流行性腹泻病毒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株流行性腹泻病毒及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhoea, PED）是引起猪腹泻的一种重要急性、接触性病毒性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐、脱水和食欲下降为特征。该病最早于上世纪70年代发生在英国和比利时，1973年先后在我国上海、辽宁、吉林等地分离到PEDV。PEDV可在猪群中持续存在，各种年龄猪均易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100%，尤以哺乳仔猪严重，病死率达100%。目前，还没有特效药物抵抗猪流行性腹泻病毒，由于该病发病急，流行快，猪群一旦感染，就会给养殖户带来巨大的经济损失。

目前，免疫接种是防制该病的重要手段，国内外有使用疫苗的报道，但是效果不尽人意。尤其近几年，原来的疫苗对猪腹泻病的保护效果越发有限，临床上不断出现腹泻病例，在有的地区，猪流行性腹泻抗原阳性率可高达70%多，这表明研制出一种能够有效防制猪流行性腹泻的疫苗迫在眉睫。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一株猪流行性腹泻病毒及其应用。该弱毒株遗传稳定、安全性好，用其制备的疫苗对于猪流行性腹泻具有良好的保护效力。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

从浙江某猪场送检猪流行性腹泻抗原阳性的病料中分离到PEDV。将分离到的猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上连续传代100代，并在此过程进行了克隆纯化，然后继续在Vero细胞上传代至145代。将第145代病毒进行RT-PCR检测，扩增S基因片段为484bp。从第105代开始ORF3基因突然出现49个核苷酸的缺失，第105代、125代、145代保持稳定缺失49个核苷酸。

致弱性试验结果表明，从第105代开始，PEDV 对仔猪失去致病性；将PEDV 125代种毒在猪体连传5代，毒力依然很稳定，没有任何返强现象。

经鉴定，分离到的病毒株为猪流行性腹泻病毒新病毒株，将105~145代致弱毒株种毒命名为猪流行性腹泻病毒ZJ08株，并于2013年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.7806。

本发明还提供含有猪流行性腹泻病毒ZJ08株的活疫苗。

在本发明一个实施方案中，所述的活疫苗中，猪流行性腹泻病毒弱毒株ZJ08株的含量为≥10^5.0 TCID₅₀/ml。

本发明还提供所述毒株在制备治疗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用。

本发明弱毒株的安全性好，安全试验结果表明，该毒株对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪均安全。

本发明对3日龄仔猪的主动保护率达100%，被动保护率达94.7%以上，而对照组的发病率达100%，表明本发明对于猪流行性腹泻具有良好的免疫保护效果，该效果已高于国内PEDV 弱毒疫苗株CV777的免疫效果。

本发明弱毒株还可应用于制备成单苗或联苗等。

附图说明

图1  PEDV（ZJ08株）CPE图片（400×）。

图2  PEDV（ZJ08株）分离毒S基因PCR检测结果。图中，M：DNA Marker DL2000；1：样品；2: 阴性对照。

图3  PEDV（ZJ08株）分离毒M基因PCR检测结果。图中，1: 样品；2: 阴性对照；M: DNA Marker DL2000。

图4  PEDV（ZJ08株）分离毒M基因系统进化分析结果。

图5  不同代次PEDV（ZJ08株）ORF3序列比对。

图6  PEDV（ZJ08株）分离毒ORF3基因PCR扩结果。图中，1: 样品；2: 阴性对照；M: DNA Marker DL2000。

图7  PEDV（ZJ08株）猪体传代前与猪体连传五代后ORF3 序列比对。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 猪流行性腹泻病毒的分离鉴定

一、猪流行性腹泻病毒的分离

浙江某猪场送检腹泻猪小肠，取其内容物，用RT-PCR 方法进行检测，结果为猪流行性腹泻抗原阳性。

取送检小肠适量，刮取肠粘膜和内容物，按照1:5的比例（重量:体积）加入PBS，反复冻融3次，离心取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液中加入终浓度为20μg/ml的胰酶，37℃处理1.5小时。

按常规方法接种长满单层的Vero细胞（接种前用pH7.4的PBS洗三次），按照10%的比例接种病毒，37℃吸附1小时，补足细胞维持液（含10μg/ml的胰酶），37℃温箱培养。如此操作盲传至第10代，观察是否产生CPE。同时设置空白细胞作为对照。

盲传传至第6代时细胞出现轻微的CPE变化，传至第24代时则出现明显、稳定的CPE变化，细胞圆缩，颗粒增加，聚堆呈葡萄串样，细胞出现损伤和脱落。（图1）。

二、将第24代病毒进行RT-PCR检测

根据S基因设计检测引物对：正向引物为5’-GGATACTTTGGCCTCTTGTG-3’；反向引物为5’-CGCACTCGGATTACTCACAGC -3’， 95℃预变性5min，95℃ 45s 、50℃ 1min、72℃ 2min进行32个循环后，72℃5min延伸。PEDV扩增片段为484bp。结果见图2。

根据GenBank中PEDV的基因序列设计扩增M基因序列的引物：

PEDV-M-F: GTCTTACATGCGAATTGACC

PEDV-M-R: GGCATAGAGAGATAATGGCA

扩增的M基因片段的大小为：808 bp，结果见图3。将扩增的M基因RT-PCR产物送英骏公司进行测序，对测序结果进行序列分析（序列见SEQ ID No.5）。结果表明，PEDV（ZJ08株）与中国早期分离野毒株JS-2004-2构成了一个独立分枝；与经典参考株如英国CV777株、比利时Brl/87株、韩国KPD-9F株和日本JMe2株等相比，不在一个进化分支上，已经发生了明显的变异。表明当前国内新出现的PEDV流行株已经发生了明显的变异。结果见图4。

三、病毒含量测定

将第24代毒用细胞维持液进行10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7 四个稀释度，每个稀释度分别接种长满Vero细胞单层的96孔细胞板6孔，100μl/孔，同时设阴性对照细胞6孔，37℃ 5% CO₂培养箱培养72～120小时，观察细胞病变，细胞颗粒增多，圆缩，细胞破损，脱落判为感染。同时阴性对照组细胞孔应不出现细胞病变。采用Reed-Muench法，计算TCID₅₀。经测定，病毒含量为10^4.5TCID₅₀/ml。

四、动物实验

取TGEV、PEDV中和抗体均小于1:8的母猪所产的3～5日龄仔猪5头，每头口服2ml第24代病毒，观察7日，统计接种猪的发病情况，对试验猪进行剖检，观察病理变化。刮取发病猪肠粘膜和内容物，提取RNA，按实施例1第二步提到的检测S 基因设计的引物，进行RT-PCR 检测，并将PCR 产物进行序列测定。结果仔猪3/5发病，发病猪表现为腹泻，个别猪出现呕吐，剖检观察发现胃和小肠出现典型的病理变化。从发病猪的肠粘膜及内容物中可扩增出484bp 的片段，经序列分析为PEDV S 基因。

经实验室分离鉴定，已成功的从浙江某猪场腹泻猪小肠内容物中分离到猪流行性腹泻病毒。

实施例2  猪流行性腹泻病毒致弱

一、猪流行性腹泻病毒的致弱培育

将分离到的猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上连续传代100代，并在此过程进行了克隆纯化，然后继续在Vero细胞上传代至145代。将第145代病毒进行RT-PCR检测，扩增S基因片段为484bp。

PEDV ORF3基因序列在第30代、50代、70代、90代处于比较稳定的状态。有个别碱基的变化，但没有对氨基酸造成影响；而第105代开始ORF3基因突然出现49个核苷酸的缺失，第105代、125代、145代保持稳定缺失49个核苷酸（序列见SEQ ID No.6）。结果如图5。扩增ORF3序列的引物为：

ORF3-F: TCCTAGACTTCAACCTTACG

ORF3-R: GGTGACAAGTGAAGCACAGA

扩增的ORF3的片段的大小为：833 bp（图6）。

将第30代、50代、70代、90代、105代、115代、125代、135代及145代病毒分别用DMEM培养液作10倍系列稀释，各代次取适当稀释度，每个稀释度分别接种长满Vero细胞单层的96孔细胞板6孔，100μl/孔，同时设阴性对照细胞6孔，37℃ 5% CO2培养箱培养72～120小时，观察细胞病变，同时阴性对照组细胞孔应不出现细胞病变。采用Reed-Muench法，计算TCID₅₀。结果115～145代毒价较高，均达到10^6.0TCID₅₀/ml以上，详见表1。

表1  PEDV不同代次病毒含量测定结果

代次	病毒含量（TCID50/ml）
		30	105.5
50	105.8
		70	105.8
90	106.0
		105	106.3
115	106.5
		125	106.5
135	106.6
		145	106.5

将第50代、115代及145代病毒分别用DMEM液稀释至10^3.0TCID₅₀/ml，与等量的PEDV特异性血清混合，置37℃中和1小时，接种长满Vero细胞单层的96孔细胞板6孔，同时设不中和的病毒阳性对照细胞6孔和仅接种细胞维持液的阴性对照细胞6孔，37℃ 5% CO₂培养箱培养72～120小时，观察细胞病变，中和组和阴性对照组均应不出现细胞病变，而病毒对照组应出现细胞病变。

结果：将第50代、115代及145代病毒稀释后与等剂量特异性的阳性血清中和，结果试验组细胞无病变，而病毒对照组出现典型CPE变化。

将第50代、115代及145代病毒按现行《中国兽药典》附录进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果各代次病毒无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。详见表2。

表2  PEDV不同代次纯净性检验结果

代次	细菌	霉菌	支原体	外源病毒
					50	无	无	无	无
125	无	无	无	无
					165	无	无	无	无

二、猪流行性腹泻病毒的致弱评价

将3日龄健康仔猪50头，分成10组，每组5头。其中1组为对照组，其他9组为试验组。分别将第30代、50代、70代、90代、105代、115代、125代、135代及145代病毒稀释为10^5.0TCID₅₀/ml，每头仔猪口服2ml，对照组口服相同剂量的生理盐水。自接种之日起，观察7日，每日观察，统计接种猪的发病情况。采用RT-PCR 方法检测接种前及接种后3日、5日、7日、10日、14日血液及粪便中的病毒存在情况。S基因引物如实施例1中所述。

结果表明，从第105代开始，病毒对仔猪已经无致病性，证明该病毒已成功致弱，结果详见表3。接种前及接种后3日、5日、7日、10日、14日检测猪血液及粪便中的病毒存在情况，见表4。表中显示从第105代开始，在血液和粪便中已经检测不到TGEV。

表3  PEDV不同代次病毒对猪的致病性结果

注：++++代表发病猪出现典型症状，粪便水样呈喷射状，伴有呕吐；+++代表发病猪症状不够典型，粪便细软，但不呈喷射状；++代表发病猪排便次数增多，但粪便不是很稀；+代表发病猪出现一过性腹泻，或排一两次较稀粪便，症状即消失；－代表没出现任何腹泻症状。

表4 PEDV不同代次接种猪血液及粪便不同时间病毒检测结果

注：斜体分数分母代表发生传染性胃肠炎后剩余的猪只

三、猪流行性腹泻弱毒株稳定性评价

将猪流行性腹泻病毒第125代种毒以10^7.0TCID₅₀/头的剂量接种3日龄健康仔猪3头，观察10日后剖杀，刮取肠绒毛及内容物，用5倍（重量:体积）无菌生理盐水制备悬液，再以口服的方式接种健康仔猪。同时选取3头相同条件的仔猪，不做任何接种，与接种悬液的3头猪同圈饲养，在同圈后3日、7日、10日、14日、21日检测同居感染情况（RT-PCR方法与实施例2中提到的方法相同），并于同居后7日、14日、21日检测TGEV 中和抗体水平。按此方法连传5代，结果表明，在5代中，接种仔猪均未出现腹泻症状，剖检未见病理变化。表明猪流行性腹泻病毒在5代以内未出现毒力返强现象，不能发生同居感染，在猪体内具有很好的稳定性（见表5-6）。PEDV由第125代在猪体内连传5代后，基因序列保持稳定，个别的碱基突变不对编码的氨基酸造成改变，也有可能是测序过程中造成的误差，见图7。

表5  5代接种猪及其同居感染试验猪粪便中不同时间PEDV 检测结果

注：/表示没有进行该项检测

表6 与不同代次接种猪同居的试验猪PEDV中和抗体检测结果

将105~145代致弱毒株种毒命名为猪流行性腹泻病毒ZJ08株，并于2013年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.7806。

实施例3 猪流行性腹泻病毒ZJ08株安全性评价

将第125代病毒稀释为10^6.0TCID₅₀/ml（10头份），选用3日龄仔猪10头，经肌肉注射，每头1ml，观察14天，对照组5头注射相同剂量的生理盐水；另外，选产前一个半月的怀孕母猪10头，每头肌肉注射20头份，对照组母猪5头，注射相同剂量的生理盐水；观察母猪的采食、体温、腹泻及流产等指标，并统计母猪的产仔数。

结果证明大剂量注射该病毒对仔猪和母猪均无任何影响，没有出现发烧、腹泻和局部炎症等情况，母猪未发生流产、死胎等繁殖障碍，试验组与对照组无明显差异，母猪产仔数在9-14头，属于正常范围。

安全性试验表明本发明弱毒株对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪均安全。

实施例4 猪流行性腹泻病毒ZJ08株免疫效力评价

一 主动免疫试验

选用3日龄PEDV 抗体阴性仔猪30头，平均分成ABC三组，A组肌肉注射PEDV 第125代病毒1ml（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml），B组肌肉注射PEDV 第145代病毒1ml（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml）；C组肌肉注射PEDV 弱毒疫苗株CV777 1ml（哈尔滨兽医研究所赠送，病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml。该毒株是哈尔滨兽医研究所将CV777强毒在Vero上致弱获得的，CV777强毒为比利时毒株）；再选相同条件仔猪10头做对照（D组），注射相同剂量的生理盐水。接种14日后，免疫组及对照组同时口服1000×MID/ml的猪流行性腹泻病毒p55株（福建省农科院提供第4代组织强毒）组织强毒1ml，观察7天，统计各组发病情况。

接种病毒后14日，试验猪均正常，各免疫组攻毒保护结果见表7，从表中可以看出，本发明获得的PEDV ZJ08株弱毒株免疫保护率高于PEDV 弱毒疫苗株CV777。

表7  主动免疫效力试验结果

组别	PEDV 毒株	试验仔猪数	发病数	保护数
					A	ZJ08弱毒株125代	10	0	100%
B	ZJ08弱毒株145代	10	0	100%
					C	弱毒疫苗株CV777	10	2	80%
D	对照	10	10	0

二 被动免疫试验

选9头母猪，均分为ABC三组，于产前一个月进行病毒接种，其中A组3头母猪肌肉注射PEDV 第125代病毒1.5ml（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml），B组3头母猪肌肉注射PEDV 第145代病毒1.5ml（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml）；C组三头母猪肌肉注射PEDV 弱毒疫苗株CV777 1.5ml（哈尔滨兽医研究所赠送，病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml）；另选条件相同的母猪2头，接种相同剂量的生理盐水作为对照组（D组）。仔猪出生后3日龄时进行攻毒试验，免疫组及对照组同时口服1000×MID/ml的猪流行性腹泻病毒p55株（福建省农科院提供第4代组织强毒）组织强毒1ml，观察7天，统计各组发病情况。

结果见表8，本发明获得的PEDV（ZJ08株）弱毒株免疫保护率达94.7%以上，高于PEDV 弱毒疫苗株CV777保护率（87.9%）近7个百分点。

表8  被动免疫效力试验结果

组别	PEDV 毒株	试验仔猪数	发病数	保护数
					A	ZJ08弱毒株125代	38	2	94.7%
B	ZJ08弱毒株145代	33	0	100%
					C	弱毒疫苗株CV777	33	4	87.9%
D	对照	21	21	0

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>  北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心

       北京科牧丰生物制药有限公司

       福州大北农生物技术有限公司

北京大北农科技集团股份有限公司

<120>  一株猪流行性腹泻病毒及其应用

<130> 

<160>  6    

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

gtcttacatg cgaattgacc                                                 20

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

ggcatagaga gataatggca                                                 20

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

tcctagactt caaccttacg                                                 20

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

ggtgacaagt gaagcacaga                                                 20

 

<210>  5

<211>  681

<212>  DNA

<213>  PEDV M基因

<400>  5

atgtctaacg gttttattcc cgttgatgag gtgattgaac accttagaaa ctggaatttc     60

acatggaata tcatactgac gatactactt gtagtgcttc agtatggcca ttacaagtac    120

tctgtgttct tgtatggtgt caagatggct attctatgga tactttggcc tcttgtgttg    180

gcactgtcac tttttgatgc atgggctagc ttccaggtca actgggtctt tttcgctttc    240

agcatcctta tggcttgcat cactcttatg ctgtggataa tgtattttgt caatagcatt    300

cggttgtggc gcaggacaca ttcttggtgg tctttcaatc ctgaaactga cgcgcttctc    360

actacttctg tgatgggccg acaggtctgc attccagtgc ttggagcacc aactggtgta    420

acgctaacac tccttagtgg tacattgttt gtagagggct ataaggttgc tactggcgta    480

caggtaagtc aattgcctga tttcgtcaca gtcgccaagg ccactacaac aattgtctat    540

ggacgtgttg gtcgttcagt caatgcttca tctggcactg gttgggcttt ctatgtccgg    600

tcaaaacacg gcgactactc agctgtgagt aatccgagtg cggttctcac agatagtgag    660

aaagtgcttc atttagtcta a                                              681

 

<210>  6

<211>  626

<212>  DNA

<213>  pedv ZJ08 ORF3

<400>  6

atgtttcttg gactttttca atacacgatt gacacagttg tcaaagatgt ctcaaagtct     60

gctaacttgt ctttggatgc tgtccaagag ttggagctca atgtagttcc aattagacaa    120

gcttcaaatg tgacgggttt tcttttcacc agtgttttta tctacttctt tgcactgttt    180

aaagcgtctt ctttgaggcg caattatatt atgttggcag cgcgttttgc tgtcattgtt    240

ctttttgttg cacacttatt ggcaggcttt gtttagtctg cttttactcc tggcgctata    300

aaaatgcgct ctttattatc tttaatacta cgacactttc tttcctcaat ggtaaagcag    360

cttattatga cggcaaatcc attgtgattt tagaaggtgg tgaccattac atcacttttg    420

gcaactcttt tgttgctttc gttagtagca ttgacttgta tctagctata cgtgggcggc    480

aagaagccga cctacagctg ttgcgaactg ttgagcttct tgatggcaag aagctttatg    540

tcttttcgca acatcaaatt gttggcatta ctaatgctgc atttgactca attcaactag    600

acgagtatgc tacaattagt gaatga                                         626

 

 

Claims (4)

1.一株猪流行性腹泻病毒弱毒株ZJ08株，其保藏号为CGMCC No.7806。

2.含有权利要求1所述毒株的猪流行性腹泻病毒活疫苗。

3.如权利要求2所述的活疫苗，其特征在于，猪流行性腹泻病毒弱毒株ZJ08株的含量为≥10^5.0 TCID₅₀/ml。

4.权利要求1所述毒株在制备治疗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用。

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