CN106591245A - 一株猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株，为PEDV/CH/NB/2014传代致弱得到的弱毒疫苗株NB120,保藏编号CGMCC No. 13299。本发明还公开了弱毒疫苗株NB120在预防猪流行性腹泻疾病中的应用，属于生物技术领域。本发明弱毒疫苗株NB120可以制备成单苗或者联苗等，可有效预防猪流行性腹泻疾病。本发明弱毒疫苗株NB120具有安全性好、免疫原性好的优点，免疫母猪或者仔猪后可以产生针对猪流行性腹泻病毒流行毒株的保护性免疫反应，表明本发明可以有效预防猪流行性腹泻病毒流行株的感染，降低疾病损失，应用前景良好。

Description

一株猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株及其培养方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是一种急性高度接触性肠道传染病，由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起，其临床特征为水样腹泻、呕吐和脱水。各日龄的猪均易感，尤其是哺乳仔猪。PED 在世界范围内广泛分布，英国、比利时、法国、匈牙利、加拿大等国相继报道了本病的发生。据报道，PED 近几年在亚洲国家发生相当严重，日本、韩国、泰国均出现过大流行，并且死亡率高，危害严重，对养猪业造成了巨大的经济损失。

目前还没有治疗猪流行性腹泻的特效药物，常规治疗效果不佳，因此现在仍以疫苗预防为主，虽然目前已有猪流行性腹泻的商业疫苗用于猪群，但是该病毒还是出现在了免疫猪群中，给该病的预防带来了极大的困难，根据国内外专家大量研究，初步判断和毒株变异有关，野毒株的不断变异造成了免疫原性变差，因此开发一个新的具有较高免疫原性和安全性高的流行毒株疫苗株对于猪流行性腹泻预防措施具有重大的意义。

发明内容

本发明的目的是针对现在猪流行性腹泻疾病防控中的问题，提供一株最新的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株，该疫苗株具有免疫原性、遗传稳定性和安全性好的特点。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株，名称为NB120，分类命名：猪流行性腹泻病毒，于2016年12月02日保藏于中国科学院 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏编号为CGMCC No. 13299。

上述猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株，其病毒纤突蛋白S基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示；ORF3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；囊膜蛋白M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；核衣壳蛋白N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

上述猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株NB120的培养方法，其特征在于，步骤为：

1）用细胞培养液培养Vero细胞使之形成细胞单层；

2）将单层的Vero细胞的生长液弃掉，用PBS洗涤细胞3次，加入1~5%猪流行性腹泻病毒液，37℃和5%浓度CO₂条件下感作0.5~1.5h，每隔20min摇动一次，吸附完毕后弃掉吸附液，加入含有浓度为1~5μg/mL胰蛋白酶的无血清DMEM作为维持液，37℃条件下继续培养；

3）连续培养至第48h或者出现70~85%细胞病变时收毒，将细胞培养物冻融3次，取细胞培养物做种毒进行下一轮传代。

上述培养方法中，所述细胞培养液为培养Vero细胞系的常用培养液。

上述猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株NB120获得说明：

从浙江省宁波市某猪场送检的腹泻仔猪小肠病料中成功分离到了一株猪流行性腹泻病毒。将分离到的猪流行性腹泻病毒在Vero 细胞上连续传代120代，此过程中连续克隆纯化3次。将第120代病毒进行RT-PCR 检测，扩增S 基因1全长4161bp。从第120代开始S基因突然出现15个核苷酸的插入，第120代和150代保持稳定插入15个核苷酸。

致弱性试验结果表明，从第120代开始，PEDV 对仔猪失去致病性；将PEDV 120代种毒在猪体内连传5 代，毒力稳定，没有任何返强现象。

本发明还提供了一种含有猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株NB120的活疫苗。

本发明所述的活疫苗中，猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株NB120的含量为≥10^6.0TCID₅₀/ml。

本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒弱毒活疫苗在预防猪流行性腹泻病中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株NB120可在Vero细胞中高效增殖，病毒滴度可以达到10^8.0TCID₅₀/mL，无外源病毒污染；

2、本发明的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株NB120，可以通过口服给药，使机体产生局部粘膜免疫，有效防止猪流行性腹泻病毒的感染。

3、本发明的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株NB120来自于最新流行株的传代致弱，免疫母猪和仔猪可以产生抵抗猪流行性腹泻病毒最新流行株的保护性免疫反应，有效预防猪流行性腹泻病的发生。

4、本发明弱毒株还可应用于制备成单苗或联苗等。

附图说明

图1：RT-PCR检测不同代次的NB120病毒培养物ORF3基因，1-6：0代、30代、50代、80代、120代和150代病毒培养物。

图2：RT-PCR检测不同代次的NB120病毒培养物S1基因片段，1-6：0代、30代、50代、80代、120代和150代病毒培养物。

图3：RT-PCR检测不同代次的NB120病毒培养物S2基因片段，1-6：0代、30代、50代、80代、120代和150代病毒培养物。

图4：RT-PCR检测不同代次的NB120病毒培养物S3基因片段，1-6：0代、30代、50代、80代、120代和150代病毒培养物。

图5：RT-PCR检测不同代次的病毒培养物S4基因片段，1-6：0代、30代、50代、80代、120代和150代病毒培养物。

图6：PEDV NB株第0代、30代、50代、80代、120代和150代S基因比对。

图7：NB120稳定性评价试验不同代分离病毒的ORF3基因序列同源性分析结果

图8：NB120稳定性评价试验不同代分离病毒的ORF3基因系统进化分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。

实施例1 猪流行性腹泻病毒致弱

一、猪流行性腹泻病毒的致弱培育

将分离到的猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上连续传代120代，此过程中连续克隆纯化3次，然后继续在Vero细胞上传代至150代。将0代、30代、50代、80代、120代和150代病毒进行RT-PCR检测，分别扩增S基因和ORF3基因序列进行分析。扩增ORF3基因序列的引物为：ORF3F5’CTAGACTTCAACCTTACGAA 3’，ORF3R 5’TACTAGACCATTATCATTCACT 3’，扩增的ORF3基因的片段大小为734 bp（图7）。扩增S基因序列分为4段进行扩增，引物分别为：引物S1F 5’TAGTGATGTTGTGTTAG 3’，见SEQ ID No:2；S1R 5’ CGCTGCACAGCAGCTC 3’，SEQ ID No:3；S2F5’ CATACCAGAAGGTTTTAG 3’ ，见SEQ ID No:4； S2R 5’ GTAATCAACTCACCCTT 3’，见SEQ IDNo:5； S3F 5’TTACCCTGAGTTTGGTAGTG 3’，见SEQ ID No:6； S3R 5’ TCCGTCTGTAGAGCAAGAT3’，见SEQ ID No:7；S4F 5’CTTCACATGTATAGTGCGTCT3’，见SEQ ID No:8；S4R 5’CAGACTTTGAGACATCTTTGAC3’，扩增的S基因的片段大小分别为1040bp、1147bp、1154bp、1356bp（图1-图5）

PEDV ORF3基因序列在第0代、30代、50代、80代处于比较稳定的状态。第120代开始ORF3基因开始出现一个氨基酸的突变位点，传至第150代序列仍然保持稳定；PEDV S基因序列在第0代、30代、50代、80代处于比较稳定的状态。从第120代开始S基因突然出现15个核苷酸的插入，第120代和150代保持稳定插入15个核苷酸（见图6）。

将第10代、20代、30代、40代、50代、60代、70代、80代、90代、100代、110代、120代、130代、140代及150代病毒分别用DMEM培养液作10倍系列稀释，各代次取适当稀释度，每个稀释度分别接种长满Vero细胞单层的96孔细胞板6孔，100ul/孔，同时设阴性对照细胞6孔，37℃5% CO₂培养箱培养72～120小时，观察细胞病变，同时阴性对照组细胞孔应不出现细胞病变。采用Reed-Muench法，计算TCID₅₀。具体结果详见表1。

表1 PEDV NB株 不同代次病毒含量测定结果

将第5代、50代、80代及120代病毒按现行《中国兽药典》附录进行无菌、支原体及外源病毒检验，结果各代次病毒无细菌，霉菌，支原体及外源病毒CSFV、PRRSV、PCV和 BVDV污染。详见表2。

表2 PEDV NB株不同代次纯净性检验结果

二、猪流行性腹泻病毒的致弱评价

将5日龄健康仔猪30头，分成6组，每组5头。其中1组为对照组，其他5组为试验组。分别将第5代、50代、80代、及120代150代病毒稀释为10^6.0TCID₅₀/ml，每头仔猪口服2ml，对照组口服相同剂量的DMEM。攻毒后观察7日，每日观察，统计接种猪的发病情况。采用RT-PCR 方法检测接种前及接种后1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日粪便中的排毒情况。

结果表明，从第80代开始毒力有所降低，第120代开始完全致弱，对仔猪已经无致病性，证明该病毒已成功致弱，结果详见表3。接种前及接种后1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日粪便中的排毒情况，见表4。表中显示从第120代开始，在粪便中已经检测不到PEDV。

表3 PEDV NB株不同代次病毒对猪的致病性结果

表4 PEDV NB株不同代次攻毒猪粪便不同时间病毒检测结果

三、猪流行性腹泻病毒弱毒株NB120稳定性评价

将猪流行性腹泻病毒NBF120种毒以10^6.0TCID₅₀/头的剂量接种5日龄健康仔猪3头，观察7日后剖杀，刮取肠绒毛及内容物，用5倍（重量: 体积）无菌生理盐水制备悬液，再以口服的方式接种健康仔猪。按此方法连传5代（第5代接种后21日剖杀），结果表明，在5代中，接种仔猪均未出现腹泻症状，剖检未见病理变化。表明猪流行性腹泻病毒在5代以内未出现毒力返强现象，在猪体内具有很好的稳定性（见表5）。PEDV NBF120在猪体内连传5代后，基因序列保持稳定。见图7和图8。

表5 猪流行性腹泻弱毒株NB120 5代接种仔猪后发病及排毒情况

实施例2 猪流行性腹泻病毒弱毒株NB120安全性评价

将NBF120病毒稀释为10^6.0TCID₅₀/ml（10头份），5日龄10头，随机分成两组，接种组仔猪5头，每头口服2ml，对照组5头注射相同剂量的DMEM，观察14天；另外，选产前一个月的怀孕母猪5头，每头口服4ml，对照组母猪5 头，注射相同剂量的DMEM；观察母猪的采食、精神、呕吐、腹泻、流产及母猪产仔数等指标。

结果证明大剂量口服接种该弱毒株对仔猪和母猪均无任何影响，没有出现呕吐和腹泻等发病情况。母猪未发生流产、死胎等繁殖障碍性症状，试验组和对照组产仔数差异不显著。

安全性评价表明本发明弱毒株对妊娠母猪和仔猪均安全。

实施例3 猪流行性腹泻病毒弱毒株NB120免疫效力评价

一 主动免疫试验

选用5日龄仔猪40头，PEDV中和抗体小于1:8，平均分成ABC三组，AB为免疫组，C组为对照组。A组口服PEDV NBF120 1ml（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml）； B组肌肉注射PEDV 弱毒疫苗株CV777 1ml（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml）；C组口服相同剂量的DMEM。接种14 日后，免疫组及对照组同时口服猪流行性腹泻病毒强毒（10^5.0TCID₅₀/ml）1ml，观察7天，统计各组发病情况。

接种病毒后14日，试验猪均正常，各组攻毒保护结果见表7，从表中可以看出，本发明获得的PEDV NB120株弱毒株免疫保护率高于PEDV 弱毒疫苗株CV777。

表6 主动免疫效力试验结果

二 被动免疫试验

选用12头PEDV中和抗体小于1:8的妊娠母猪，平均分成ABCD四组，于产前一个月进行病毒接种，其中A组3头母猪肌肉注射PEDV NBF120病毒4ml（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml）；B组三头母猪肌肉注射PEDV弱毒疫苗株CV7774ml（病毒含量10^5.0TCID₅₀/ml）；C组口服相同剂量的DMEM。仔猪出生后5日龄时，每组随机挑取10头，进行攻毒试验，免疫组及对照组同时口服猪流行性腹泻病毒强毒（10^2.0TCID₅₀/ml）1ml，观察7天，统计各组发病情况。

结果见表7，本发明获得的PEDV NBF120弱毒株免疫保护率高于PEDV弱毒疫苗株CV777保护率。

表7 被动免疫效力试验结果

组别	腹泻率	死亡率	保护率
				A	0/10（0）	0/10（0）	10/10（100%）
B	2/10（20%）	1/10（10%）	8/10（80%）
				C	10/10（100%）	9/10（90%）	0/10（0）

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大伟嘉生物技术股份有限公司

<120> 一株猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株及其培养方法和应用

<130> 1

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4176

<212> DNA

<213> NBF120

<400> 1

atgaagtctt taacctactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact tagcctacca 60

caagatgtca ccaggtgctc agctaacact aattttaggc ggttcttttc aaaatttaat 120

gttcaggcgc ctgcagttgt tgtactgggc ggttatctac ctattggtga aaaccagggt 180

gtcaattcaa cttggtactg tgctggccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggtatc 240

tttgttagcc atattagagg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300

gaccctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta acggtaacac taatgctact 360

gcgcgactgc gcatttgcca gtttcctagc attaaaacat tgggccccac tgctaataat 420

gatgttacaa caggtcgtaa ttgcctattt aacaaagcca tcccagctca tatgagtgaa 480

catagtgttg tcggcataac atgggataat gatcgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 540

tattattttt attttaaaaa tgattggtcc cgtgttgcga caaagtgtta caacagtgga 600

ggttgtgcta tgcaatatgt ttacgaaccc acctattaca ttcttaatgt tactagtgct 660

ggtgaggatg gtatttctta tcaaccctgt acagctaatt gcattggtta tgctgccaat 720

gtatttgcta ctgagcccaa tggccacata ccagaaggtt ttagttttaa taattggttt 780

cttttgtcca atgattccac tttggtgcat ggtaaggtgg tttccaacca accattgttg 840

gtcaattgtc ttttggccat tcctaagatt tatggactag gccaattttt ctcctttaat 900

caaacgatcg atggtgtttg taatggagct gctgtgcagc gtgcaccaga ggctctgagg 960

tttaatatta atgacacctc tgtcattctt gctgaaggct caattgtact tcatactgct 1020

ttaggaacaa atttttcttt tgtttgcagt aattcctcaa atcctcactt agccaccttc 1080

gccatacctc tgggtgctat ccaagtaccc tattattgtt ttcttaaagt ggatacttac 1140

aactccactg tttataaatt cttggctgtt ttacctccta ccgtcaggga agttgtcatc 1200

accaagtatg gtgatgttta tgtcaatggg tttggctatt tgcatctcgg tttgttggac 1260

gctgtcacaa ttaatttcac tggtcatggc actgacgatg acgtttcagg tttctggacc 1320

atagcatcga ctaattttgt tgatgcactt atcgaagttc aaggaaccgc cattcagcgt 1380

attctttatt gtgatgatcc tgttagccaa ctcaagtgtt ctcaggttgc ttttgacctt 1440

gacgatggtt tctaccctat ttcttctaga aaccttctga ctcatgaaca gccaatttct 1500

tttgttactt tgccatcatt taatgatcat tcttttgtta acattactgt ctctgcgtcc 1560

tttggtggtc ctagtggtgc caaccttatt gcatctgaca ctactatcaa tgggtttagt 1620

tctttctgtg ttgacactag acaatttacc atttcactgt tttataacgt tacaaacagt 1680

tatggttatg tgcctaaatc acaggacagt aattgccctt tcaccttgca atctgttaat 1740

gattacctgt cttttagtaa attttgtgtt tccaccagcc ttttggctag tgcctgtacc 1800

atagatcttt ttggttaccc tgagtttggt agtgttgtta agtttacgtc cctttacttt 1860

caattcacaa atggtgagtt gattactggc acgcctaaac cacttgaagg tgtcacggac 1920

gtttctttta tgactctgga tgtgtgtacc aagtatacta tccatggctt taaaggtgag 1980

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attagtcaaa cttccaaggg tttgaacact gtggctcatg cgcttactaa ggttcaagag 3120

gttgttaact cgcagggtgc agctttgact caacttaccg tacagctgca acacaacttc 3180

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actggtgttg ccttgactct acgtgagcct ggcttagtct tgtttacgca tgaacttcaa 3600

aatcatactg cgacggaata ttttgtttca tcgcgacgta tgtttgaacc tagaaaacct 3660

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acacttattg gcaggctttg tttagtctgc ttttactcct ggcgctataa aaatgcgctc 360

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ggcaaatcca ttgtgatttt agaaggtggt gaccattaca tcacttttgg caactctttt 480

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actacctctg tgatgggccg acaggtctgc attccagtgc ttggagcacc aactggtgta 420

acgctaacac tccttagtgg tacattgctt gtagagggct ataaggttgc tactggcgta 480

caggtaagtc aattacctaa tttcgtcaca gtcgccaagg ccactacaac aattgtctac 540

ggacgtgttg gtcgttcagt caatgcttca tctggcactg gttgggcttt ctatgtccgg 600

tctaaacacg gcgactactc agctgtgagt aatccgagtt cggttctcac agatagtgag 660

a 661

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

actgttattg acgtataaac g 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgaagcact ttctcactat c 21

<210> 16

<211> 1326

<212> DNA

<213> NBF120

<400> 16

atggcttctg tcagttttca ggatcgtggc cgcaaacggg tgccattatc cctctatgcc 60

cctcttaggg ttactaatga caaacccctt tctaaggtac ttgcaaataa tgctgtaccc 120

actaataaag gaaataagga ccagcaaatt ggatactgga atgagcaaat tcgctggcgc 180

atgcgccgtg gtgagcgaat tgaacaacct tccaattggc acttctacta cctcggaaca 240

ggacctcacg ccgacctccg ctataggact cgtactgagg gtgttttctg ggttgctaaa 300

gaaggcgcaa agactgaacc cactaacctg ggtgtcagaa aggcgtctgc aaagccaatt 360

attccaaatt tctctcaaca gcttcccagc gtagttgaga ttgttgaacc taacacacct 420

cctacttcac gtgcaaattc acgtagcagg agtcgtggta atggcaacaa caggtccaga 480

tctccaagta acaacagagg caataaccag tcccgcggta attcacagaa tcgtggaaat 540

aaccagggtc gtggagcttc tcagaacaga ggaggcaata ataacaacaa taacaagtct 600

cgtaaccagt ccaagaacag aaaccagtca aatgaccgtg gtggtgtaac atcacgcgat 660

gatctggtgg ctgctgtcaa ggatgccctt aaatctttgg gtattggcga aaaccctgac 720

aagcttaagc aacagcagaa gcccaaacag gaaaggtctg acagcagcgg caaaaataca 780

cctaagaaga acaaatccag agccacttcg aaagaacgtg acctcaaaga catcccagag 840

tggaggagaa ttcccaaggg cgaaaatagc gtagcagctt gcttcggacc caggggaggc 900

ttcaaaaatt ttggagatgc ggaatttgtc gaaaaaggtg ttgatgcctc aggctatgct 960

cagatcgcca gtttagcacc aaatgttgca gcattgctct ttggtggtaa tgtggctgtt 1020

cgtgagctag cggactctta cgagattaca tacaattata aaatgactgt gccaaagtct 1080

gatccaaatg tagagcttct tgtttcacag gtggatgcat ttaaaactgg gaatgcaaaa 1140

ccccagagaa agaaggaaaa gaagaacaag cgtgaaacca cgcagcagct gaatgaagat 1200

gccatctacg atgatgtggg tgtgccatct gatgtgactc atgccaattt ggaatgggac 1260

acagctgttg atggtggtga cacggccgtt gaaattatca acgagatctt tgacacagca 1320

aattaa 1326

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cggttctcac agatagtgag a 21

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cgctagaaaa acactcagta at 22

Claims (6)

1.一株猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株，命名为NB120，保藏于中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 13299。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述病毒弱毒疫苗株是由猪流行性腹泻病毒强毒株PEDV/CH/NB/2014在5ug/ml胰酶条件下，在Vero细胞上连续传120代致弱得到。

3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述病毒弱毒疫苗株的毒价为≥ 10^7.5 TCID₅₀/ml。

4.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述病毒弱毒疫苗株的病毒纤突蛋白S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；ORF3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；囊膜蛋白M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；核衣壳蛋白N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

5.一种猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株的培养方法，其特征在于，步骤为：

1）用细胞培养液培养Vero细胞使之形成细胞单层；

2）将单层的Vero细胞的生长液弃掉，用PBS洗涤细胞3次，加入1~5%猪流行性腹泻病毒液，37℃和5%浓度CO₂条件下感作0.5~1.5h，每隔20min摇动一次，吸附完毕后弃掉吸附液，加入含有浓度为1~5μg/mL胰蛋白酶的无血清DMEM作为维持液，37℃条件下继续培养；

3）连续培养至第48h或者出现70~85%细胞病变时收毒，将细胞培养物冻融3次，取细胞培养物做种毒进行下一轮传代。

6.一种猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株在预防新型猪流行性腹泻中的应用。