CN111840543B - 猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂及制备工艺和应用 - Google Patents

猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂及制备工艺和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及动物疫苗技术领域，尤其是一种猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂及制备工艺和应用，所述免疫增强剂为三价融合型蛋白质，由产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素组成，其基因核酸序列如SEQ ID No：1所示。该三价融合蛋白与佐剂乳化制备免疫原疫苗免疫动物，能刺激机体产生高滴度的抗体，免疫原性良好，克服了单个ST分子免疫原性差的弱点和不足。三价融合蛋白与猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株联合使用，能够显著增强猪流行性腹泻病毒特异性sIgA抗体水平、延长其抗体持续期、降低哺乳仔猪的腹泻率和死亡率，是一种理想的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗佐剂。

Description

猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂及制备工艺和 应用
技术领域
本发明涉及动物疫苗技术领域，具体领域为一种猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂。
背景技术
产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）是引起幼畜腹泻的主要病原菌。ETEC具有两类致病因子：一类为肠毒素，另一类为粘着素（或称定居因子），已知的粘着素有K88，K99，F14和987P等。ETEC产生两种肠毒素：一种为不耐热性肠毒素（LT），另一种为耐热性肠毒素（ST），其中ST和LT是导致幼龄动物腹泻的直接致病因子。由于ST与LT相比，它是一种生物学活性更强，而免疫原性较弱的小分子多肽，因此而成为国内外许多学者研究的热点之一。由于ETEC产生的ST在ETEC性腹泻中扮演重要角色，对人类和家畜健康有很大威胁，因此对大肠杆菌ST毒素体外表达的优化研究具有重要意义。
ST编码的基因位于质粒上，根据产物特性产物又可分为STⅠ和STⅡ，二者核苷酸和氨基酸序列同源性极低。ST毒素为分子量不足5000Da的多肽，通常无免疫原性。STⅠ为甲醇可溶性，且耐热，可用乳鼠、乳猪和家兔等测出；STⅡ仅在猪源ETEC中产生，为甲醇非溶解性，对断奶仔猪可导致肠积液。霍乱弧菌也产生ST毒素（vibrio cholerae heat-stableenterotoxin，vibrio cholerae ST），引起人和动物的腹泻性疾病。
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以水样腹泻、呕吐及脱水为主要特征的急性肠道传染病。经典PEDV毒株感染以地方性流行为主要特点，而自2010年以来，我国陆续出现新的PEDV流行毒株，其表现出传播快、流行范围广、发病率和死亡率高等特点。2013年PED疫情在欧美等多个国家爆发并迅速传播，给其养猪业造成巨大的损失。我国新毒株无论是在致病性还是流行特点方面都与以往的毒株有所不同，基因差异程度较大，美国新流行毒株与我国2011-2012间流行的部分毒株基因同源性达99%以上，韩国也分离到基因型与美国流行株同源性高度相似的毒株。尽管不同国家和地区分离的PEDV新毒株的基因序列有所差异，但它们都处在同一个遗传分支上，而以往的PEDV毒株处在另外一个遗传分支上；相对经典毒株，新流行毒株的主要抗原基因出现较大范围的插入、缺失和点突变，这表明，新流行毒发生较大变异，给PEDV的防治提出了新的挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂及制备工艺和应用，关键在于解决ST毒素的免疫原性问题。本发明采用基因工程方法制备产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白（即猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂），增强了其免疫原性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
1．产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白基因的改造与多表位融合设计
本发明将产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素进行融合，通过表位优化，在一个表达系统中同时表达三个基因型的毒素，制备相应的抗体，用于仔猪大肠杆菌疾病的预防和治疗。本发明所优化的产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白基因开放阅读框（ORF）核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。其中包括3个核心抗原表位：表位1：LSPIAQDAKPVESPKEKIPLES，表位2：PAAKGCMKNLFIALMLIFSSIALSPTVENDT，表位3：DENGNLIDCCEICCHPAGSGVL。
2．产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白的原核表达
（1）将产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白开放阅读框（ORF）与pGEX4T-1载体连接，构建重组表达载体pGEX-LTB，转化BL21(DE3)感受态，筛选获得重组表达菌株BL21(DE3)-pGEX-LTB；
（2）重组表达菌BL21(DE3)-pGEX-LTB，LB培养基培养，在37℃，经IPTG诱导，超声波破碎，12000r/min，4℃，离心15min，收集沉淀蛋白；
（3）往沉淀蛋白中加入PBS缓冲液，漩涡振荡制备得到纯化的产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白重组蛋白悬液。
3．产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白抗体的制备：
（1）将三价融合蛋白采用0.02%甲醛灭活36小时，用硫代硫酸钠中和1小时，与疫苗佐剂以1:1的体积比例混合，混合顺序为：将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为0.1mg/mL，同时以14000r/min的转速搅拌乳化0.5h。
其中，所述疫苗佐剂为GEL01、ISA71VG、PET01、氢氧化铝、矿物油中的一种或几种。
（2）蛋鸡的免疫：对蛋鸡进行胸部肌肉注射，剂量为1mL/只。依次于初次免疫后第14天和40天，进行第2次和第3次加强免疫。抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用westernblot方法检测LTB特异性卵黄抗体效价，当抗体效价达到16000倍以上时，采用PEG6000从鸡蛋中提取收集卵黄抗体。
产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白与佐剂乳化制备免疫原疫苗免疫动物，能刺激机体产生高滴度的抗体，所制备的毒素特异性抗体对产肠毒素大肠杆菌（ETEC）的防治效果显著。
4．产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白与猪流行性腹泻病毒疫苗毒株联合制备二联疫苗
sIgA是反应粘膜免疫的免疫力的一个重要指标，对于诸多肠道感染病毒，需要机体激发有效的粘膜免疫、产生高水平的sIgA才能有效清除病毒。为了提高该毒株刺激机体产生sIgA的水平及延长其持续分泌时间、延长保护期、提高现有PED活疫苗产品的品质，本发明还将产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白与猪流行性腹泻病毒疫苗毒株联合使用，能够显著增强猪流行性腹泻病毒疫苗毒株特异性sIgA抗体水平，而且能够显著降低哺乳仔猪的腹泻率。
将三价融合蛋白5～20μg与猪流行性腹泻病毒疫苗毒株1头份（106.0TCID50）混合均匀，冻干。
使用时，采用肌肉注射免疫接种，免疫剂量为1-5头份/次，间隔21d进行二次免疫。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明设计了猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂，即产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白，适用范围更广。
（2）本发明的三价融合蛋白制备工艺相对简单，制备成本低，且得到的蛋白具有良好的免疫原性和反应原性；
（3）本发明所制备的三价融合蛋白特异性抗体对产肠毒素大肠杆菌（ETEC）的防治效果显著，安全高效无残留，可有效减少抗生素的用量，减少抗生素使用带来的危害。
（4）三价融合型蛋白质经甲醛灭活后与猪流行性腹泻病毒疫苗毒株联合使用，安全性好，能够显著增强猪流行性腹泻病毒疫苗毒株特异性sIgA抗体水平，延长抗体持续期，延长保护期，高效预防哺乳仔猪腹泻。能够显著提高猪流行性腹泻弱毒疫苗的效果与品质，拓展该疫苗的功能。
（5）与猪流行性腹泻病毒疫苗毒株联合制备成二联疫苗，免疫母猪，可以同时防治仔猪流行性腹泻、产肠毒素猪致病性大肠杆菌疾病和霍乱弧菌，做到“一针三防”，更高效、更经济、安全，有效降低了抗生素在治疗方面的应用，减少了抗生素过量使用所带来的一系列问题。
附图说明
图1为产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价抗原的融合表达设计；
图2为基因工程菌株的质粒提取后的电泳检测；其中，M：DL2000MarKer；1：DH5α-PMD-19T-simple-ST；2：DH5α-pGEX4T-1；
图3为基因工程菌株的酶切鉴定；其中，M：DL5000MarKer；1：DH5α-PMD-19T-simple–ST；
图4为基因工程菌株切胶回收、纯化后的浓度测定；其中，M：DL5000MarKer；1-4：ST；
图5为空载体pGEX-4T-1纯化后的浓度检测；其中，M：DL5000MarKer；1-4：pGEX4T-1；
图6为重组表达菌株Top10 pGEX4T-ST质粒提取后的电泳检测；其中，M：DL5000MarKer；1：Rosetta(DE3) pGEX4T-ST；
图7为重组表达菌株Top10 PGEX4T-ST的酶切鉴定；其中，M：DL5000MarKer；1：Rosetta(DE3)pGEX4T-ST；
图8为重组表达菌株Rosetta(DE3)pGEX4T-ST的酶切鉴定；其中，M：DL5000MarKer；1：Rosetta(DE3)pGEX4T-ST；
图9为诱导1h的ST蛋白的SDS-PAGE检测；其中，M．蛋白MarKer；1.诱导-ST-S；2.诱导-ST-IB；3.未诱导-ST-S；4.未诱导-ST-IB；5.诱导-PGEX4T-S；6.诱导-PGEX-4T-IB；7.未诱导-PGEX4T-S；8.未诱导PGEXX-4T-IB（上清蛋白液标记为“S”；管底沉淀即为包涵体蛋白标记为“IB”）；
图10为诱导2h的ST蛋白的SDS-PAGE检测；其中，M．蛋白MarKer；1.诱导-ST-S；2.诱导-ST-IB；3.未诱导-ST-S；4.未诱导-ST-IB；5.诱导-PGEX4T-S；6.诱导-PGEX-4T-IB；7.未诱导-PGEX4T-S；8.未诱导PGEXX-4T-IB（上清蛋白液标记为“S”；管底沉淀即为包涵体蛋白标记为“IB”）；
图11为诱导3h的ST蛋白的SDS-PAGE检测；其中，M．蛋白MarKer；1.诱导-ST-S；2.诱导-ST-IB；3.未诱导-ST-S；4.未诱导-ST-IB；5.诱导-PGEX4T-S；6.诱导-PGEX-4T-IB；7.未诱导-PGEX4T-S；8.未诱导PGEXX-4T-IB（上清蛋白液标记为“S”；管底沉淀即为包涵体蛋白标记为“IB”）；
图12为诱导4h的ST蛋白的SDS-PAGE检测；其中，M．蛋白MarKer；1.诱导-ST-S；2.诱导-ST-IB；3.未诱导-ST-S；4.未诱导-ST-IB；5.诱导-PGEX4T-S ；6.诱导-PGEX-4T-IB ；7.未诱导-PGEX4T-S；8.未诱导PGEXX-4T-IB（上清蛋白液标记为“S”；管底沉淀即为包涵体蛋白标记为“IB”）；
图13为ST蛋白的Western Blot检测；其中，M．蛋白MarKer；1.Rosetta pGEX4T-ST未诱导包涵体；2.Rosetta pGEX4T-ST诱导全包涵体.（转膜设置：12V，16min；一抗：GST多克隆抗体1:5000稀释；二抗：HRP-SPA 1：3000稀释）；
图14为ST蛋白的Western Blot检测；其中，M．蛋白MarKer；1.未诱导0.5h；2.诱导0.5h；3.未诱导1h；4.诱导1h；5.未诱导1.5h；6.诱导1.5h；7.未诱导3h；8.诱导3h（转膜设置：10V，11min；一抗：GST多克隆抗体1:5000稀释；二抗：HRP-SPA 1：8000稀释）；
图15为不同IPTG浓度对重组蛋白Rosetta(DE3) pGEX4T-ST表达的影响；其中，M：蛋白MarKer；1：Rosetta(DE3) pGEX4T-ST 未诱导全包涵体；2-9：Rosetta(DE3) pGEX4T-ST诱导全包涵体（2．0.01mmol.L-1 IPTG；3. 0.05 mmol.L-1 IPTG；4. 0.1 mmol.L-1 IPTG；5.0.2 mmol.L-1 IPTG；6. 0.4 mmol.L-1 IPTG；7. 0.6 mmol.L-1 IPTG；8. 0.8 mmol.L-1IPTG；9. 1.0 mmol.L-1 IPTG）；
图16为不同诱导时间对重组蛋白Rosetta(DE3)pGEX4T-ST表达的影响；其中，M．蛋白Marker；1.未诱导0.5h；2.诱导0.5h；3.未诱导1h；4.诱导1h；5.未诱导1.5h；6.诱导1.5h；7.未诱导3h；8.诱导3h（注：0.8mmol/l IPTG）；
图17为20℃诱导的ST蛋白的SDS-PAGE电泳检测；其中，M．蛋白MarKer；1-7：Rosetta(DE3) pGEX4T-ST全包涵体（1.未诱导30min（对照）；2.诱导10min；3.诱导20min；4.诱导30min；5.诱导60min；6.诱导120min；7.诱导180min）；
图18为25℃诱导的ST蛋白的SDS-PAGE电泳检测；其中，M．蛋白MarKer；1-7：Rosetta(DE3) pGEX4T-ST全包涵体（1.未诱导30min（对照）；2.诱导10min；3.诱导20min；4.诱导30min；5.诱导60min；6.诱导120min；7.诱导180min）；
图19为30℃诱导的ST蛋白的SDS-PAGE电泳检测；其中，M．蛋白MarKer；1-7：Rosetta(DE3) pGEX4T-ST全包涵体（1.未诱导30min（对照）；2.诱导10min；3.诱导20min；4.诱导30min；5.诱导60min；6.诱导120min；7.诱导180min）；
图20为37℃诱导的ST蛋白的SDS-PAGE电泳检测；其中，M．蛋白MarKer；1-7：Rosetta(DE3) pGEX4T-ST全包涵体（1.未诱导30min（对照）；2.诱导10min；3.诱导20min；4.诱导30min；5.诱导60min；6.诱导120min；7.诱导180min）；
图21为诱导时间对蛋白表达影响的Western blot鉴定；其中，M,蛋白质Maker；1,0.5h诱导包涵体蛋白；2, 1h诱导包涵体蛋白；3, 2h诱导包涵体蛋白；4, 4h诱导包涵体蛋白；5, 0.5h未诱导包涵体蛋白；6, 1h未诱导包涵体蛋白；7, 2h未诱导包涵体蛋白；8, 4h未诱导包涵体蛋白；
图22为哺乳期母乳中PEDV特异性sIgA效价。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 三价融合蛋白的表达设计
将产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素进行融合表达，其具体融合设计如图1所示。
三价融合蛋白开放阅读框（ORF）核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。其中包括3个核心抗原表位：表位1：LSPIAQDAKPVESPKEKIPLES，表位2：PAAKGCMKNLFIALMLIFSSIALSPTVENDT，表位3：DENGNLIDCCEICCHPAGSGVL。
实施例2 重组表达菌株的构建与蛋白表达
1、重组表达菌株Rosetta(DE3) pGEX4T-ST的鉴定
（1）DH5α-PMD-19T-simple-ST、DH5α-pGEX4T-1基因工程菌株的质粒提取
PMD-T-simple-ST和 pGEX4T-1经1.2%琼脂糖凝胶电泳，在对应位置有条带且没有杂带，表明质粒提取成功（如图2）。（2）DH5α-PMD-19T-simple-ST基因工程菌株的酶切鉴定
质粒pMD-T-simple-ST经SalⅠ和BamHⅠ双酶切，1.2%琼脂糖凝胶电泳，目的质粒分子量大小分别为2700bp和648bp，在对应位置有条带且没有杂带，表明，重组载体已经完全切开，可以进行后续切胶回收操作（如图3）。
（3）DH5α-PMD-T-simple-ST基因工程菌株切胶回收、纯化后的浓度测定
采用电泳后切胶、凝胶回收试剂盒回收纯化后ST(648bp）浓度约为50ng/μL（如图4）。
（4）空载体pGEX-4T-1纯化后的电泳检测
采用PCR清洁试剂盒纯化pGEX4T-1，浓度为30-40ng/μL（如图5）。
（5）重组质粒pGEX4T-ST提取后的电泳检测
重组质粒pGEX4T-ST经1.2%琼脂糖凝胶电泳，可见分子量大小为5000bp左右的条带，且没有杂带，表明质粒提取成功（如图6）。
（6）重组表达菌株Top10 PGEX4T-ST的Bam HI和Sal I酶切鉴定
提取的pGEX4T-ST质粒经Bam HI和Sal I酶切，目的产物分子量大小分别为5000bp和648 bp。图中可见5000bp的载体带和700左右目的基因带，可判断为阳性重组菌株（如图7）。
（7）重组表达菌株Rosetta(DE3)- PGEX4T-ST的Bam HI和Sal I酶切鉴定
提取的pGEX4T-ST质粒经Bam HI和Sal I酶切，目的产物分子量大小分别为5000bp和648 bp。图中可见5000bp的载体带，700bp左右目的基因带，同时可见4800bp、800bp左右的杂带，为目的基因（如图8）。
2、重组Rosetta(DE3) pGEX4T-ST蛋白的诱导表达与鉴定
（1）重组菌种Rostta(DE3)-pGEX4T-ST经IPTG诱导1h后，与未经诱导的对比，分子量大小50kDa左右处条带较深。疑似目的蛋白ST在PGEX4T-ST包涵体中有所表达，分子量大小约为50kDa（如图9）。
重组菌种Rostta(DE3)-pGEX4T-ST经IPTG诱导2h后，与未经诱导的对比，未见到目的条带（如图10）。
重组菌种Rostta(DE3)-pGEX4T-ST经IPTG诱导3h后，与未经诱导的对比，未见到目的条带（如图11）。
重组菌种Rostta(DE3)-pGEX4T-ST经IPTG诱导4h后，与未经诱导的对比，未见到目的条带（如图12）。
（2）重组Rosetta(DE3) pGEX-4T-ST蛋白的Western blot鉴定
将pGEX4T-ST重组蛋白进行Western blot检测，结果显示，阳性重组菌种Rostta(DE3)-pGEX-4T-ST经1.0mmol/L IPTG诱导4h后，与未经IPTG诱导的对比，可见在30 KDa处含有大量降解蛋白，未发现目的蛋白（如图13）。
将重组蛋白pGEX4T-ST进行Western blot检测，结果显示，在50KDa处IPTG诱导0.5h和1h有目的条带，说明蛋白ST能与一抗Anti-GST mAb、二抗HRP-SPA反应。34Kb左右处有大量降解蛋白，可看出随着诱导时间延长，目的蛋白降解越加严重（如图14）。
3、重组Rosetta(DE3) pGEX4T-ST蛋白表达条件的优化
（1）最佳IPTG诱导浓度
诱导温度为37 ℃，IPTG浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol.L-1，诱导4h，220r.min-1诱导4h，同时设置空载体诱导对照，进行SDS-PAGE电泳，结果显示，阳性重组菌种Rostta(DE3)-pGEX4T-ST经IPTG诱导后，与未经诱导的对比，疑似在分子量50KDa左右含有目的条带；不同浓度的IPTG诱导表达效果差异不大（如图15）。
（2）最佳诱导时间
室温下，向试管内加入终浓度为0.8mmol.L-1 的IPTG，剩余的不加诱导剂IPTG作为对照组。分别在诱导0.5h、1h和2h时取样一次，每次1mL/管， 220r.min-1诱导2h，进行SDS-PAGE电泳，结果显示，阳性重组菌种Rosetta(DE3)-pGEX-4T-ST经IPTG诱导后，与未经诱导的对比，虽差异不太明显，但分子量在55KDa左右处略有不同，蛋白含量高于未诱导的，可能在蛋白分子量大小约50 kDa处含有目的蛋白，但含量较少且相近分子量也有条带不易区别（如图16），诱导时间较长，蛋白表达量略高，但不明显。
（3）最佳诱导温度和时间
分别在20℃、25℃、30℃和37℃，分别加入终浓度为最佳诱导IPTG浓度——0.8mmol.L-1， 220r.min-1，诱导10min、20min、30min、60min、120min和180min，同时设置未经IPTG诱导的对照组，收集菌体后处理，进行SDS-PAGE电泳，结果显示：
重组菌种Rostta(DE3)-pGEX4T-ST经0.8mmol/l IPTG在20℃条件下诱导后，与未经诱导的对比，未发现有目的条带（如图17）。
重组菌种Rostta(DE3)-pGEX4T-ST经0.8mmol/l IPTG在25℃条件下诱导后，与未经诱导的对比，在58KDa处疑似有目的条带（如图18）。
重组菌种Rostta(DE3)-pGEX4T-ST经0.8mmol/l IPTG在30℃条件下诱导后，与未经诱导的对比，分子量54KDa处条带较深。在54KDa处有目的条带（如图19）。
重组菌种Rostta(DE3)-pGEX4T-ST经0.8mmol/l IPTG在37℃条件下诱导后，与未经诱导的对比，未发现有目的条带（如图20）。
（4）优化后诱导时间对蛋白表达影响的Western blot鉴定
用1mmol/L的IPTG不同时间段诱导BL21(DE3)- pGEX-4T-ST表达目的蛋白，蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，转印到硝酸纤维素膜上，用脱脂乳37℃封闭1小时，经PBST漂洗3次后与GST Tag Mouse McAb孵育1h，再经PBST漂洗3次后与Anti-Mouse IgG(H+L)孵育1h。结果显示，0.5h和1h诱导包涵体蛋白表达量最高，2h和4h诱导包涵体蛋白相对降低。说明1mmol/L、37℃，条件下IPTG诱导0.5h表达效果最佳。
实施例3 产肠毒素性大肠杆菌主要耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白特异性卵黄抗体制剂的制备
1、免疫原的制备
将三价融合蛋白采用0.02%甲醛灭活36小时，用硫代硫酸铵中和1小时后与疫苗佐剂ISA71VG以1:1的体积比例混合，混合顺序为：将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为0.1mg/mL，同时以14000r/min的转速搅拌乳化0.5h。
2、蛋鸡的免疫
对蛋鸡进行胸部肌肉注射，剂量为1mL/只。依次于初次免疫后第14天和40天，进行第2次和第3次加强免疫。抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用western blot方法检测LTB特异性卵黄抗体效价，当抗体效价达到16000倍以上时，采用PEG6000从鸡蛋中提取收集卵黄抗体。采用Western blotting测定抗体的效价，结果显示：三免后7d收集鸡蛋提取复合卵黄抗体IgY效价能够达到1:16000倍。
实施例4 产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白特异性卵黄抗体制剂有效防治剂量评估
提取实施例3制备的卵黄抗体制剂，开展防治效果的动物实验研究。体重25g作用Balb/c鼠30只，随机分为五个组：A、B和C组，每组10只；C组为不处理对照组；B组为不给抗体制剂的攻毒对照组；A为试验组，分别在攻毒前2h第一次口服卵黄抗体制剂混合物，随后在第12h、24、48h各口服产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价卵黄抗体制剂一次，每次用量0.2mL。在第二次给药后4h，A组和B组每只小鼠口服ETEC E.Coli 108cfu/mL，进行攻击、感染，C组为不感染健康对照，隔离饲养。连续观察7日，统计腹泻率、死亡率。
表1产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价卵黄抗体制剂效防治剂量
Figure DEST_PATH_IMAGE001
经过实验观察统计，由表1看出：C组无腹泻和死亡。B组腹泻率和死亡率均100%，且病毒攻击后第4天都全部死亡。A组的腹泻率60%，死亡率22%。由此可以看出，该抗体制剂能够有效降低死亡率和腹泻率，具有良好的防治效果。表明三价融合蛋白具有良好的免疫原性，这项发明克服了单个ST分子免疫原性差的弱点和不足。
实施例5 产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白对猪流行性腹泻疫苗免疫效果的影响
将经甲醛灭活的产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白5～20μg与猪流行性腹泻病毒疫苗毒株ZJ08株1头份（106.0TCID50）混合均匀，冻干制成二联疫苗。（注：在实际应用中，并不限于猪流行性腹泻病毒疫苗毒株ZJ08株，本实施例仅以ZJ08株为例。实验表明，采用其他毒株也可取得类似效果，在此不一一赘述）
选择怀孕80天左右的母猪60头，随机分为6组：A组、B组、C组、D组、E组、F组，每组10头。A组肌肉注射猪流行性腹泻病毒疫苗毒株ZJ08株1头份（106.0TCID50），B组肌肉注射1头份三价融合蛋白（5μg）与猪流行性腹泻病毒疫苗毒株ZJ08株1头份（106.0TCID50），C组肌肉注射1头份三价融合蛋白（10μg）与猪流行性腹泻病毒疫苗毒株ZJ08株1头份（106.0TCID50），D组肌肉注射1头份三价融合蛋白（15μg）与猪流行性腹泻病毒疫苗毒株ZJ08株1头份（106.0TCID50），E组肌肉注射1头份三价融合蛋白（20μg）与猪流行性腹泻病毒疫苗毒株ZJ08株1头份（106.0TCID50），F组不做免疫。A-E组均做两次免疫，首次免疫后21d进行二次免疫。统计哺乳期（21天）内各组哺乳仔猪的腹泻率，采用间接ELISA测定乳汁中的sIgA水平。
（1）安全性评价
经上述分组免疫后7天内，每天跟踪监测母猪的体温、食欲、腹泻情况，结果显示，所有组别母猪无发烧、无腹泻情况，母猪食欲正常，表明产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白5～20μg与猪流行性腹泻病毒疫苗毒株ZJ08株1头份（106.0TCID50）联合使用对猪体安全。
（2）腹泻率、死亡率统计
对哺乳期（21天）哺乳仔猪腹泻率、死亡率统计发现（表2），三价融合蛋白与猪流行性腹泻病毒疫苗毒株ZJ08株联合疫苗组（B组-E组）腹泻率显著低于不免疫组F和仅免疫猪流行性腹泻病毒疫苗毒株ZJ08株联合疫苗的A组，且随着三价融合蛋白计量增加腹泻率有降低趋势。从死亡率可以看出，A-E组死亡率显著低于F组，三价融合蛋白与猪流行性腹泻病毒疫苗毒株ZJ08株联合疫苗组（B组-E组）死亡率均为0。说明三价融合蛋白能够提高猪流行性腹泻病毒疫苗毒株ZJ08株疫苗效果，降低腹泻率和死亡率，提高存活率，提高生猪生产成绩。
表2 哺乳期（21天）哺乳仔猪腹泻率、死亡率统计
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（3）母乳中sIgA抗体水平
由图22可以看出，未免疫的对照组F组sIgA始终为阴性（OD值小于0.45），A-E组随着时间推移，抗体水平逐渐下降。哺乳第一天，A-E组均有较高的效价，相对而言，C-E组比A组和B组OD值要高出0.6-0.9，从的持续时间来看，A、B组在17天已经是弱阳性，在第21天为阴性，C-E组第21天仍然为阳性性。综合说明，sIgA抗体水平具有三价融合蛋白剂量依赖性，三价融合蛋白不仅能够显著提高猪流行性腹泻病毒疫苗毒株ZJ08株特异性sIgA抗体水平，而且抗体持续期更长，能够给仔猪提供更长的保护期，说明三价融合蛋白能够显著提升猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗的粘膜免疫效果，是一种理想的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗佐剂。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 兆丰华生物科技（南京）有限公司
兆丰华生物科技（福州）有限公司
<120> 猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂及制备工艺和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagaaat caatattatt tatttttctt tctgtattgt ctctttcacc aatcgctcag 60
gatgctaaac cagtagagtc tccaaaagaa aaaatcccac tagaatcaaa aaaatgtaac 120
attgcaaaaa aaagtaataa aagtggtcct gaaagcatga atagtagcaa ttactgctgt 180
gaattgtgtt gtaatcctgc ttgtaccggg tgctatatga aaaagaatat cgcatttctt 240
attgcatcta tgttcgtttt ttctattgct caaaatgcct atgcatctac acaatcaaat 300
aaacaagatc tgtgtgaaca ttatagacaa atagccaagg aaagttgtaa aaaaagtttt 360
ttaggggtta gagatggtac tgctggagca tgctttggcg cccaaataat gcctgcagca 420
aaaggatgca tgaaaaacct attcattgca ttaatgttaa tattttcttc aatcgccctt 480
agcccaacag tagaaaacga taccaaaaca gtgcagcaac cacaacaaat tgaaagcaag 540
gtaaatatta aaaaactaag tgaagatgaa gaatgcccat ttataaaaca agtcgatgaa 600
aatggaaatc tcattgactg ctgcgaaata tgttgccatc cagctggctc tggagttcta 660
aatcaccacc accaccacca ctaa 684
<210> 2
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Lys Ser Ile Leu Phe Ile Phe Leu Ser Val Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Asp Ala Lys Pro Val Glu Ser Pro Lys Glu Lys Ile
20 25 30
Pro Leu Glu Ser Lys Lys Cys Asn Ile Ala Lys Lys Ser Asn Lys Ser
35 40 45
Gly Pro Glu Ser Met Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys
50 55 60
Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu
65 70 75 80
Ile Ala Ser Met Phe Val Phe Ser Ile Ala Gln Asn Ala Tyr Ala Ser
85 90 95
Thr Gln Ser Asn Lys Gln Asp Leu Cys Glu His Tyr Arg Gln Ile Ala
100 105 110
Lys Glu Ser Cys Lys Lys Ser Phe Leu Gly Val Arg Asp Gly Thr Ala
115 120 125
Gly Ala Cys Phe Gly Ala Gln Ile Met Pro Ala Ala Lys Gly Cys Met
130 135 140
Lys Asn Leu Phe Ile Ala Leu Met Leu Ile Phe Ser Ser Ile Ala Leu
145 150 155 160
Ser Pro Thr Val Glu Asn Asp Thr Lys Thr Val Gln Gln Pro Gln Gln
165 170 175
Ile Glu Ser Lys Val Asn Ile Lys Lys Leu Ser Glu Asp Glu Glu Cys
180 185 190
Pro Phe Ile Lys Gln Val Asp Glu Asn Gly Asn Leu Ile Asp Cys Cys
195 200 205
Glu Ile Cys Cys His Pro Ala Gly Ser Gly Val Leu Asn His His His
210 215 220
His His His
225

Claims (7)

1.一种猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂，其特征在于：所述免疫增强剂为三价融合型蛋白质，由产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素组成，其基因核酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂，其特征在于：其编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示；其中包括3个核心抗原表位：表位1：LSPIAQDAKPVESPKEKIPLES，表位2：PAAKGCMKNLFIALMLIFSSIALSPTVENDT，表位3：DENGNLIDCCEICCHPAGSGVL。
3.权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白开放阅读框与pGEX4T-1载体连接，所述三价融合蛋白开放阅读框的基因核酸序列如SEQ ID No：1所示，构建重组表达载体pGEX-LTB，转化BL21(DE3)感受态，筛选获得重组表达菌株BL21(DE3)-pGEX-LTB；
（2）重组表达菌BL21(DE3)-pGEX-LTB，LB培养基培养，在37℃，经IPTG诱导，超声波破碎，12000r/min，4℃，离心15min，收集沉淀蛋白；
（3）往沉淀蛋白中加入PBS缓冲液，漩涡振荡制备得到纯化的产肠毒素性大肠杆菌耐热肠毒素的STⅠ型、STⅡ型以及霍乱弧菌ST毒素三价融合蛋白重组蛋白悬液。
4.权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂的抗体制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂采用0.02%甲醛灭活36小时，用硫代硫酸钠中和1小时，与疫苗佐剂以1:1的体积比例混合，混合顺序为：将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为0.1mg/mL，同时以14000r/min的转速搅拌乳化0.5h；
（2）蛋鸡的免疫：对蛋鸡进行胸部肌肉注射步骤（1）处理后的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂，剂量为1mL/只；依次于初次免疫后第14天和40天，进行第2次和第3次加强免疫；抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋，采用western blot方法检测LTB特异性卵黄抗体效价，当抗体效价达到16000倍以上时，采用PEG6000从鸡蛋中提取收集卵黄抗体。
5.根据权利要求4所述的抗体制备方法，其特征在于：所述疫苗佐剂为GEL01、ISA71VG、PET01、氢氧化铝、矿物油中的一种或几种。
6.权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂的应用，其特征在于：猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂经甲醛灭活后与猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗毒株制备联合使用的药剂。
7.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂的应用，其特征在于：猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂与猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗毒株的混合比例为：猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗粘膜免疫增强剂5～20μg、猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗毒株1头份，106.0TCID50。
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