CN114891120B - 一种二价禽腺病毒特异性抗原融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种二价禽腺病毒特异性抗原融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，本发明所提供的抗原融合蛋白可用于制备二价禽腺病毒亚单位疫苗。本发明将Ⅰ群禽腺病毒特异性中和抗原表位蛋白串联融合表达，所选抗原决定簇能够特异性识别宿主细胞表面特异性受体，通过序列优化改造，将两种血清型抗原通过linker连接肽串联，不但保证其空间免疫构象互不干扰，能获得抵御多种禽腺病毒的多功能蛋白质，还可以简化纯化流程，降低生产成本，具备发展为二价疫苗的潜力。

Description

一种二价禽腺病毒特异性抗原融合蛋白

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种二价禽腺病毒特异性抗原融合蛋白。

背景技术

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科、禽腺病毒属，根据抗原性分为3个群:Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群。根据血清中和试验，Ⅰ群禽腺病毒可分为12个血清型(1～7，8a，8b，9～11)。目前，我国鸡群感染流行病毒株主要有FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-10及FAdV-11等血清型，其中血清4型(FAdV-4)和血清8b型(FAdV-8b)，分别引起心包积液综合征(Hydropericardium syndrome，HPS)和鸡包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis，IBH)等疾病，给养禽业造成严重的经济损失。其中FAdV-4可通过接触水平传播及垂直传播，对雏鸡的致病力最强，致死率高。从最开始爆发至今已造成不可估量的损失；而动物及动物产品的全球化贸易更加速了FAdV的传播。

禽腺病毒FAdV是一种双链DNA病毒，该病毒的衣壳蛋白主要由六邻体(Hexon)、五邻体(Penton)和纤突蛋白(Fiber)组成。纤突蛋白Fiber和五邻体Penton在病毒感染周期中分别负责病毒吸附和侵入两个过程，血清4型Fiber蛋白具有两个独立的Fiber编码基因FiberⅠ和FiberⅡ。Penton和FiberⅡ具有抗原性，能诱导产生病毒中和抗体。

目前国内对禽腺病毒防控主要是依靠接种疫苗和定点捕杀，通过国内兽药临床注册数据发现商业化的疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗。传统灭活疫苗、减毒疫苗存在疫苗质量良莠不齐、免疫保护期短、需要的接种量大、且会引发不良反应、疫苗存储时间短、需要低温设备运输，或者存在活病毒逃逸等诸多问题。因而开发新型疫苗来弥补这些不足显得极为迫切。

新型疫苗的研发主要是集中于基因工程疫苗，包括亚单位疫苗、病毒活载体疫苗以及DNA疫苗，目前国内王增幅等人报道的“一种Ⅰ群血清4型-血清8型禽腺病毒二价亚单位疫苗及其制备方法”公开的疫苗中4型禽腺病毒纤维蛋白和8型禽腺病毒纤维蛋白分别于大肠杆菌PET系列宿主实现了高表达量与可溶性，但还需要将以4型禽腺病毒纤维蛋白和8型禽腺病毒纤维蛋白分别纯化后摸索其混匀质量比，增加了后续的工作量，且不适合用于多种疾病共同防治所需联苗的开发。另外新型疫苗往往所选抗原决定簇缺乏对当下流行株的针对性，导致其有限的免疫保护性，以及较高的生产成本限制了新型疫苗的发展。

发明内容

本发明的目的是提供一种二价禽腺病毒特异性抗原融合蛋白，是将禽腺病毒毒株ZZ株和CH/GDLZ/201801毒株的特异性抗原表位通过linker进行串联获得的，所提供的抗原融合蛋白具有良好的免疫原性，琼脂扩散试验发现所提供的抗原融合蛋白保存有天然活性，通过动物性保护实验发现机体能够产生有效的禽腺病毒特异性免疫应答。

本发明首先提供一种特异性抗原融合蛋白，包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的融合蛋白：

2)在1)中经过取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，具有1)中抗原活性的蛋白：

编码上述抗原融合蛋白的基因，其一种具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

本发明还提供一种重组表达载体，其中包含有上述的编码基因；

本发明还提供一种重组工程菌株，所述的重组工程菌株中携带有编码上述抗原融合蛋白的重组表达载体；

作为实施例的一种具体记载，所述的重组工程菌株为枯草芽孢杆菌工程菌；

本发明所提供的抗原融合蛋白可用于制备二价禽腺病毒亚单位疫苗。

本发明还提供一种亚单位疫苗，其中抗原中包含有上述的融合蛋白。

本发明的抗原融合蛋白的优点在于：

1、将Ⅰ群禽腺病毒特异性中和抗原表位蛋白串联融合表达，所选抗原决定簇能够特异性识别宿主细胞表面特异性受体。

2、所选目的基因序列来源于毒株ZZ和毒株CH/GDLZ/201801等不同血清型的当下流行株，其致病性与危害性更大，其所编码的蛋白对疾病防控有更强的针对性。

3、通过序列优化改造，将两种血清型抗原通过linker连接肽串联，不但保证其空间免疫构象互不干扰，能获得抵御多种禽腺病毒的多功能蛋白质，还可以简化纯化流程，降低生产成本，具备发展为二价疫苗的潜力。

4、选择的特异性中和抗原表位可通过免疫诱导家禽产生高水平的特异性抗体体，琼扩效价可达到2⁶以上，显著提高其抗原天然免疫活性，满足疫苗制备需求；保护家禽免受相关禽腺病毒的感染。

5、本发明通过一步串联表达法获得二价亚单位疫苗，免疫剂量小，更方便于后期多联疫苗的开发。

附图说明

图1为本发明实施例1中毒株ZZ和毒株CH/GDLZ/201801系统进化树分析结果图；

图2为本发明实施例2中pHT304-F2C4F8(WB800)菌落PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例2中pHT304-F2C4F8质粒双酶切鉴定结果图；

图4为本发明实施例1中Western-blot验证pHT304-FADV8B2018F(L2)与pHT304-FADV4CZZF(L3)及实施例2中pHT304-F2C4F8(L1)表达产物的电泳图；

图5为实施例2pHT304-F2C4F8(A)及实施例1pHT304-FADV8B2018(B)与pHT304-FADV4CZZF(C)中抗原琼扩效价检测图；

图6为本发明实施例3中禽腺病毒亚单位疫苗的免疫效力检验图。

具体实施方

本发明将流行株血清4型毒株ZZ-fiberⅡ的第229-479位之间氨基酸特异序列和血清4型毒株CH/GDLZ/201801-fiber的第272-522位之间氨基酸特异序列进行拼接，形成的融合蛋白抗原能够特异性识别相应中和抗体，并能够诱导机体产生有效的禽腺病毒特异性免疫应答，保护家禽免受禽腺病毒的感染。

所提供的抗原融合蛋白能特异性识别禽腺病毒中和抗体，具有良好免疫原性，通过动物性保护实验发现机体能够产生有效的禽腺病毒特异性免疫应答。

本发明所提供的融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的融合蛋白。但本领域技术人员可以在SEQ ID NO:1的融合蛋白的基础上，通过取代、缺失、添加一个或几个氨基酸来获得衍生蛋白，该衍生蛋白也具有氨基酸序列为SEQ ID NO:1的融合蛋白的抗原活性。

编码上述融合蛋白的基因，其一种具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；但本领域技术人员可以针对用于表达融合蛋白的宿主情况对上述的核苷酸序列进行调整，从而在宿主体内获得较好的表达效率。

本发明又一方面是提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有用于编码上述融合蛋白的基因核酸片段。

所述重组表达载体的一种制备方法，是采用，根据重叠区基因扩增拼接法(SOE－PCR)的技术要求，将选取的两株流行株抗原表位进行串联，并对串联目的基因上下游各添加限制性核酸内切酶HindⅢ、BamH1位点，将所述串联基因与大肠杆菌及枯草芽孢杆菌穿梭表达质粒pHT304进行双酶切连接而得到。

其另一种制备方法，是采用限制性核酸内切酶HindⅢ、BamH1同时将编码抗原融合蛋白的基因及大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的穿梭表达质粒pHT304进行酶切连接，将重组质粒采用电转化法导入枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800获得重组枯草芽孢杆菌转化子；利用红霉素的MRS固体培养基筛选所述重组枯草芽孢杆菌转化子，即能在红霉素的MRS抗性平板上正常生长的菌为阳性转化子，将挑取重组枯草芽孢杆菌转化子，对转化子提取基因组，对目的片段进行双酶切反应及测序比对验证；

确定有目的片段后，再次活化转化子，进行发酵诱导培养，得到含融合抗原的蛋白液；

对上述融合抗原蛋白液进行免疫原性验证，利用Western-blot方法确认融合蛋白的表达情况与分子量大小。

上述Western-blot方法参照梁国栋主编的《最新分子生物学实验技术》中蛋白印记实验操作技术完成。

进一步，对融合抗原蛋白液进行纯化浓缩得到融合抗原；

本发明中利用得到的抗原蛋白制备禽腺病毒亚单位疫苗的方法包括如下步骤：

(1)油相制备：取白油、硬脂酸铝，80℃加热混匀后加入司本80，130℃加热混匀，冷却后得到油相；

(2)水相制备：将血清Ⅳ型禽腺病毒毒株的纤突蛋白融合抗原与灭菌的吐温80充分混匀；

(3)乳化制备：将油相和水相乳化后得到二价亚单位疫苗。

本实施例中基因合成、所有PCR引物片段均由生工生物工程上海(股份)有限公司提供；所有PCR试剂、限制性内切酶ECORⅠ和HindⅢ、T4 DNA ligase为T4 DNA连接酶购自TaKaRa-宝生物工程(大连)有限公司；禽腺病毒I群(FAdV-I)单克隆抗体购自中国兽医药品监察所；禽腺病毒I群琼脂扩散试验抗原购自中国兽医药品监察所；显色底物DAB购自天根的增强型HRP-DAB底物显色试剂盒。

主要试剂配置方法如下：

10mLGMI(枯草芽孢杆菌感受态制备用培养基)：1mL10×Spizizen salts，10％酵母粉，20％葡萄糖，1％水解酪蛋白，0.25％所需氨基酸，补充无菌双蒸水至总体积10mL；

10mLGMII(枯草芽孢杆菌感受态制备用培养基)：1mL10×Spizizen salts，10％酵母粉溶液，20％葡萄糖，1％水解酪蛋白，0.25％所需氨基酸，0.1mol/L CaCl₂,25mmol/LMgCl₂，补充无菌双蒸水至总体积10mL；

MRS液体培养基：称取蛋白胨10g；牛肉膏10g；酵母提取物5g；K₂HPO₄ 2g；乙酸钠5g；C₆H₁₄N₂O₇ 2g；葡萄糖20g；吐温-80 1mL；MgSO₄·7H₂O 0.58g；MnSO₄·4H₂O 0.25g，加入900mL双蒸水磁力搅拌，加热溶解，冷却至50℃调节pH6.0～6.5，而后加双蒸水定容至1L，高压蒸汽灭菌，4℃贮存；

MRS固体培养基：在1L MRS液体培养基中加入15g琼脂或琼脂糖，高压蒸汽灭菌，待冷却至50℃左右时，超净工作台中，倒入培养皿中，室温凝固，封口膜封严置4℃冰箱保存备用。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：I群禽腺病毒的纤突蛋白重组表达

纤突蛋白在禽腺病毒表面形似火柴，从N端到C端分别是尾区、柄区和头节区，C端头结构域可识别与吸附宿主细胞表面的特异性受体，启动病毒的感染，根据蛋白数据库对禽腺病毒纤突蛋白所作的空间结构预测可知该区域理论上会以三聚体的形态存在，作为纤突蛋白上诱导中和抗体产生的主力，能够很好的保护机体做出免疫应答反应，因此本发明选择流行株Ⅳ型毒株ZZ-fiberⅡ和流行株8b型毒株CH/GDLZ/201801的纤突蛋白(图1)来构建重组菌株并进行免疫原性分析，具体构建方法如下：

1)对流行株Ⅳ型毒株ZZ-fiberⅡ的纤突蛋白FADV4CZZF和流行株8b型毒株CH/GDLZ/201801的纤突蛋白FADV8B2018F的编码基因进行优化；

其中FADV4CZZF的氨基酸序列如下：

MLRAPKRRHSENGKPETEAGPSPAPIKRAKRMVRASQLDLVYPFDYVADPVGGLNPPFLGGSGPLVDQGGQLTLNVTDPIIIKNRSVDLAHDPSLDVNAQGQLAVAVDPEGALDITPDGLDVKVDGVTVMVNDDWELAVKVDPSGGLDSTAGGLGVSVDDTLLVDQGELGVHLNQQGPITADSSGIDLEINPNMFTVNTSTGSGVLELNLKAQGGIQADSSGVGVSVDESLQIVNNTLEVKPDPSGPLTVSANGLGLKYDTNTLAVTAGALTVVGGGSVSTPIATFVSGSPSLNTYNATTVNSSANAFSCAYYLQQWNIQGLLVTSLYLKLDSATMGNRPGDLNSANAKWFTFWVSAYLQQCNPSGIQAGTVSPSTATLTDFEPMANRSVTSPWTYSANGYYEPSIGEFQVFSPVVTGAWNPGNIGIRVLPVPVSASGERYTLLCYSLQCTNASIFNPNNSGTMIVGPVLYSCPAASLP；

参考枯草芽孢杆菌系统表达偏好性进行优化，优化后基因序列添加HindⅢ酶切位点、BamH1酶切位点；具体的核苷酸序列如下：

ATGCTTCGGGCTCCAAAACGTCGTCACTCAGAAAATGGTAAGCCTGAAACAGAAGCTGGTCCTTCGCCAGCACCAATTAAAAGAGCTAAACGAATGGTTCGAGCTTCACAGCTTGATCTTGTTTATCCATTTGACTATGTTGCTGACCCAGTCGGAGGTCTGAATCCTCCATTCCTCGGGGGTTCAGGACCTCTTGTCGACCAAGGCGGTCAATTGACGCTTAATGTTACTGATCCCATTATTATCAAAAATCGTTCAGTAGACCTTGCTCATGATCCCAGTCTCGATGTGAATGCACAAGGACAATTAGCCGTTGCCGTTGACCCAGAAGGAGCATTGGATATTACTCCAGATGGATTAGATGTTAAAGTAGATGGTGTGACAGTGATGGTTAATGATGATTGGGAATTAGCGGTGAAGGTTGACCCTTCAGGTGGACTTGACAGTACCGCGGGAGGGCTCGGAGTATCCGTCGACGATACGCTTCTGGTTGATCAAGGTGAACTTGGTGTTCATTTAAATCAACAAGGGCCGATTACAGCAGATTCATCTGGTATTGATTTAGAAATCAATCCTAACATGTTTACAGTAAATACTTCGACAGGTTCTGGCGTTTTAGAGTTAAATTTAAAAGCTCAAGGAGGAATCCAAGCAGATAGTAGTGGTGTGGGCGTGAGTGTTGATGAATCATTACAAATTGTTAATAACACACTTGAAGTTAAACCAGATCCTAGTGGGCCTTTAACTGTTTCAGCAAATGGACTAGGATTGAAATATGATACAAATACACTAGCGGTAACTGCAGGTGCATTGACTGTTGTTGGTGGAGGGTCTGTATCAACTCCAATTGCAACATTTGTCAGCGGTAGCCCATCACTGAATACTTATAATGCCACAACAGTCAATAGTTCAGCTAATGCTTTTTCATGCGCTTACTACTTACAGCAATGGAACATACAAGGCCTATTGGTTACATCTTTATATTTAAAATTAGATTCTGCAACCATGGGAAATAGACCTGGAGATTTGAACTCAGCCAATGCAAAATGGTTTACTTTTTGGGTTTCTGCTTATTTACAACAATGTAATCCGTCGGGAATACAAGCTGGAACGGTCTCTCCGTCAACCGCCACTTTGACAGATTTTGAACCAATGGCAAACCGCAGTGTGACGTCCCCTTGGACTTACTCTGCAAATGGCTATTATGAACCTAGTATTGGCGAATTTCAAGTTTTCAGTCCTGTTGTAACTGGTGCTTGGAATCCAGGTAACATTGGCATTCGTGTTTTGCCAGTTCCTGTCTCTGCTTCTGGAGAGCGTTATACTCTACTTTGTTATTCATTGCAGTGTACTAATGCTTCAATTTTCAATCCAAATAATTCTGGTACAATGATTGTAGGTCCAGTACTTTATTCCTGTCCAGCGGCTTCATTACCCTAA。

纤突蛋白FADV8B2018F的氨基酸序列如下：

MATSTPHAFSFGQIGSRKRPAGGDGERDASKVPKMQTPAPSATANGNDELDLVYPFWLQNGSTGGGGGGGSGGNPSLNPPFLDPNGPLAVQNNLLKVNTAAPITVANKALTLAYEPDSLELTNQQQLAVKIDPEGPLKATTEGIQLSVDPTTLEVDDVDWELTVKLDPDGPLDSSATGITVRVDETLLIEDDGSGQRKELGVNLNPTGPITADDQGLDLEIDNQTLKVNSVTGGGVLAVQLKSQGGLTAQTDGIQVNTQNSITVTNGALDVKVAANGPLESTATGLTLNYDPGDFTVNAGTLSIIRDPALVANAYLTSGASTLQQFTAKSENSSQFSFPCAYYLQQWLSDGLVLSSLYLKLDRAQFTNMPTGANYQNARYFTFWVGAGTSFNLSALSEPTITPNTTQWNAFAPALDYSGAPPFIYDASSVVTIYFEPTSGRLESYLPVLTDNWSQTYNPGTVTLCVKTVRVQLRSQGTFSTLVCYNFRCQNTGIFNSNATAGTMTLGPIFFSCPALSTANAP；

参考枯草芽孢杆菌系统表达偏好性进行优化，优化后基因序列添加HindⅢ酶切位点、BamH1酶切位点；优化后的FADV8B2018F编码基因的具体的核苷酸序列如下：

ATGGCAACTTCTACACCTCATGCTTTCTCTTTTGGTCAAATTGGTTCTCGGAAACGTCCAGCTGGTGGTGATGGTGAACGTGACGCATCTAAAGTTCCAAAAATGCAAACTCCCGCACCATCGGCGACGGCTAATGGAAATGATGAACTTGATTTAGTTTATCCCTTCTGGTTGCAAAATGGATCAACTGGCGGAGGGGGCGGTGGGGGTTCAGGAGGCAATCCTAGCTTAAATCCACCATTTCTAGATCCTAATGGTCCATTAGCTGTTCAGAATAATTTATTAAAGGTAAATACAGCTGCTCCAATCACTGTTGCGAATAAAGCACTCACTTTAGCATATGAACCAGATTCATTAGAGTTGACAAATCAACAACAGCTTGCAGTGAAAATTGACCCAGAAGGACCATTGAAAGCTACAACAGAAGGTATTCAATTATCAGTTGACCCAACAACTTTAGAAGTTGATGATGTTGATTGGGAATTAACAGTTAAGCTCGACCCTGATGGTCCTCTTGATTCCAGTGCCACCGGTATCACCGTCAGAGTAGATGAAACTTTATTGATTGAAGATGATGGTAGCGGACAAAGAAAAGAACTTGGTGTTAATTTAAATCCCACAGGACCGATTACCGCTGATGACCAAGGTTTGGACCTTGAAATTGATAACCAAACACTTAAAGTCAACAGTGTCACGGGTGGAGGAGTTTTGGCAGTTCAACTTAAAAGCCAAGGGGGACTTACGGCTCAAACTGACGGAATTCAAGTTAACACGCAAAATTCTATCACGGTGACCAATGGCGCATTAGATGTCAAAGTTGCTGCCAACGGACCTTTAGAGTCAACAGCGACAGGTTTAACATTGAATTACGATCCAGGAGATTTTACCGTCAATGCGGGGACCCTGTCAATTATACGTGATCCTGCGCTTGTGGCCAATGCTTACCTCACTAGCGGTGCTTCTACACTTCAACAATTTACAGCAAAATCAGAAAATTCAAGTCAATTTAGTTTTCCTTGTGCTTATTATCTCCAACAATGGCTTTCAGACGGACTTGTATTAAGTTCGCTTTATCTGAAACTTGACCGAGCTCAGTTTACTAATATGCCAACTGGGGCGAATTATCAGAACGCACGTTATTTCACATTTTGGGTTGGTGCCGGCACCTCTTTCAACCTCTCCGCTCTAAGTGAGCCAACAATTACTCCAAATACAACTCAGTGGAATGCCTTTGCTCCTGCTTTGGATTATAGTGGAGCACCGCCTTTTATTTATGATGCTTCATCAGTTGTTACAATATATTTTGAACCTACAAGTGGACGCTTGGAATCTTATTTACCAGTACTGACAGATAATTGGTCACAAACTTACAATCCAGGTACAGTGACTCTCTGCGTAAAAACAGTAAGAGTACAACTGCGAAGTCAAGGAACTTTTTCTACTTTGGTTTGTTATAATTTTCGTTGTCAAAATACTGGAATTTTTAACTCAAATGCCACTGCTGGAACAATGACTTTGGGCCCTATTTTCTTTTCTTGTCCAGCATTGTCAACCGCAAATGCACCTTAA。

2)合成FADV8B2018F与FADV4CZZF密码子优化后基因序列，将上述目的基因同时采用限制性核酸内切酶HindⅢ、BamH1对进行双酶切克隆入穿梭质粒pHT304，并将重组质粒转化入转化枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800得到的重组菌株分别命名为pHT304-FADV8B2018F(B.subtilisWB800)与pHT304-FADV4CZZF(B.subtilisWB800)，并送生物公司测序确认。

3)把测序正确的重组菌株菌种pHT304-FADV8B2018F(B.subtilisWB800)与pHT304-FADV4CZZF(B.subtilisWB800)接种于MRS液体培养液(含红霉素100μg/m L)中，次日按照1％的接种量接种入新鲜的MRS培养液(含红霉素100μg/m L)中，37℃，250r/min振荡培养至OD₆₀₀≈0.4时，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.4mM，37℃，250r/min诱导24h。

4)收集的发酵液离心收集菌体，并对发酵液上清经10％SDS-PAGE结束后，将未染色的聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白经半干转2h(1-2mA/m²)转移NC膜上，5％脱脂奶粉封闭，以禽腺病毒I群(FAdV-I)单克隆抗体作为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗，依次与之反应，最后用显色底物DAB显色；实验结果显示重组蛋白能被禽腺病毒I群(FAdV-I)单克隆抗体所识别，在大小约为55.1KD、49.9KD左右出现目的蛋白(图4)，符合理论值。

7)取发酵液上清，按照倍比稀释法进行2倍梯度稀释，于1％的琼脂平板的中心孔加入禽腺病毒琼扩用抗血清标准品，周边孔分别加入倍比稀释(2⁰、2¹、2²、2³、2⁴、2⁵……2¹¹)抗原，37℃恒温免疫反应，以中心孔与待检孔之间出现免疫沉淀线的最高稀释倍数确定待检血清的抗体效价，经48h-72h观察记录，经重组得到的FADV8B2018F(图5B)和FADV4CZZF(图5C)纤维蛋白均未出现明显的沉淀线，结果表明制备的两个重组纤突蛋白天然活性较低。

实施例2：禽腺病毒纤突蛋白特异性融合蛋白重组菌株的构建与表达

经过序列分析后，设计引物F2full、R2C4从pHT304-FADV4CZZF(B.subtilisWB800)中扩增流行株Ⅳ型毒株ZZ-fiberⅡ蛋白从氨基酸229位到氨基酸479位所对应的核苷酸序列，使用引物F38b、R3full从pHT304-FADV8B2018F(B.subtilisWB800)扩增流行株8b型毒株CH/GDLZ/201801-fiber蛋白从氨基酸272位到氨基酸522位所对应的核苷酸序列，利用引物F1Linker、R1Linker扩增特异性连接肽(linker)，使用引物F2full、R3full扩增出pF2C4F8串联基因，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳并使用胶回收试剂盒回收目的基因片段，上述所获得的融合蛋白的氨基酸序列如下：

ESLQIVNNTLEVKPDPSGPLTVSANGLGLKYDTNTLAVTAGALTVVGGGSVSTPIATFVSGSPSLNTYNATTVNSSANAFSCAYYLQQWNIQGLLVTSLYLKLDSATMGNRPGDLNSANAKWFTFWVSAYLQQCNPSGIQAGTVSPSTATLTDFEPMANRSVTSPWTYSANGYYEPSIGEFQVFSPVVTGAWNPGNIGIRVLPVPVSASGERYTLLCYSLQCTNASIFNPNNSGTMIVGPVLYSCPAASLPGGGGSGGGGSGGGGSGAAALKVAANGPLESTATGLTLNYDPGDFTVNAGTLSIIRDPALVANAYLTSGASTLQQFTAKSENSSQFSFPCAYYLQQWLSDGLVLSSLYLKLDRAQFTNMPTGANYQNARYFTFWVGAGTSFNLSALSEPTITPNTTQWNAFAPALDYSGAPPFIYDASSVVTIYFEPTSGRLESYLPVLTDNWSQTYNPGTVTLCVKTVRVQLRSQGTFSTLVCYNFRCQNTGIFNSNATAGTMTLGPIFFSCPALSTANAP(SEQ ID NO:1)；

上述带下划线部分：GGGGSGGGGSGGGGSGAAAL为linker。

参考枯草芽孢杆菌系统密码子表达偏好性进行优化，编码产品氨基酸序列保持不变，优化后基因序列，编码上述融合蛋白的基因(pF2C4F8)，其核苷酸序列如下：

GAATCATTACAAATTGTTAATAACACACTTGAAGTTAAACCAGATCCTAGTGGGCCTTTAACTGTTTCAGCAAATGGACTAGGATTGAAATATGATACAAATACACTAGCGGTAACTGCAGGTGCATTGACTGTTGTTGGTGGAGGGTCTGTATCAACTCCAATTGCAACATTTGTCAGCGGTAGCCCATCACTGAATACTTATAATGCCACAACAGTCAATAGTTCAGCTAATGCTTTTTCATGCGCTTACTACTTACAGCAATGGAACATACAAGGCCTATTGGTTACATCTTTATATTTAAAATTAGATTCTGCAACCATGGGAAATAGACCTGGAGATTTGAACTCAGCCAATGCAAAATGGTTTACTTTTTGGGTTTCTGCTTATTTACAACAATGTAATCCGTCGGGAATACAAGCTGGAACGGTCTCTCCGTCAACCGCCACTTTGACAGATTTTGAACCAATGGCAAACCGCAGTGTGACGTCCCCTTGGACTTACTCTGCAAATGGCTATTATGAACCTAGTATTGGCGAATTTCAAGTTTTCAGTCCTGTTGTAACTGGTGCTTGGAATCCAGGTAACATTGGCATTCGTGTTTTGCCAGTTCCTGTCTCTGCTTCTGGAGAGCGTTATACTCTACTTTGTTATTCATTGCAGTGTACTAATGCTTCAATTTTCAATCCAAATAATTCTGGTACAATGATTGTAGGTCCAGTACTTTATTCCTGTCCAGCGGCTTCATTACCCGGTGGCGGAGGGAGTGGTGGCGGAGGGAGTGGTGGCGGAGGGAGTGGTGCCGCAGCGCTTAAAGTTGCTGCCAACGGACCTTTAGAGTCAACAGCGACAGGTTTAACATTGAATTACGATCCAGGAGATTTTACCGTCAATGCGGGGACCCTGTCAATTATACGTGATCCTGCGCTTGTGGCCAATGCTTACCTCACTAGCGGTGCTTCTACACTTCAACAATTTACAGCAAAATCAGAAAATTCAAGTCAATTTAGTTTTCCTTGTGCTTATTATCTCCAACAATGGCTTTCAGACGGACTTGTATTAAGTTCGCTTTATCTGAAACTTGACCGAGCTCAGTTTACTAATATGCCAACTGGGGCGAATTATCAGAACGCACGTTATTTCACATTTTGGGTTGGTGCCGGCACCTCTTTCAACCTCTCCGCTCTAAGTGAGCCAACAATTACTCCAAATACAACTCAGTGGAATGCCTTTGCTCCTGCTTTGGATTATAGTGGAGCACCGCCTTTTATTTATGATGCTTCATCAGTTGTTACAATATATTTTGAACCTACAAGTGGACGCTTGGAATCTTATTTACCAGTACTGACAGATAATTGGTCACAAACTTACAATCCAGGTACAGTGACTCTCTGCGTAAAAACAGTAAGAGTACAACTGCGAAGTCAAGGAACTTTTTCTACTTTGGTTTGTTATAATTTTCGTTGTCAAAATACTGGAATTTTTAACTCAAATGCCACTGCTGGAACAATGACTTTGGGCCCTATTTTCTTTTCTTGTCCAGCATTGTCAACCGCAAATGCACCTTAA(SEQ ID NO:2)。

制备氨基酸序列为SEQ ID NO:1的抗原融合蛋白的具体步骤如下：

1)以所示引物进行PCR扩增，添加HindⅢ酶切位点、BamHI酶切位点及同源序列，依靠重叠延伸PCR技术进行串联。

重组所用设计引物(下划线表示酶切位点)如下：

F1Linker5'-GCGGCTTCATTACCCGGTGGCGGAGGGAGTGGTGGCGGAGGGAGTGGTGGCGGA-3'

R1Linker5'-GTTGGCAGCAACTTTAAGCGCTGCGGCACCACTCCCTCCGCCACCACTCCC-3'

F2full5'-ggatcttccagagataagcttATGGAATCATTACAAATTGTTAATAACACACTTG-3'

R2C45'-ctgccgttcgacgatACTCCCTCCGCCACCGGG-3'

F38b5'-ggatcttccagagatGGTGCCGCAGCGCTTAAA-3'

R3full5'-ctgccgttcgacgatggatccTTAAGGTGCATTTGCGGTTGA-3'

2)将上述重组目的基因pF2C4F8采用限制性核酸内切酶HindⅢ、BamHI37℃进行双酶切3h，经琼脂糖凝胶DNA胶回收试剂盒进行切胶回收得到1572bp大小片段，同时采用限制性核酸内切酶HindⅢ、BamHI对穿梭表达质粒pHT304进行双酶切，将双酶切回收产物于4℃用T4 DNAligase进行连接12h，将连接产物(命名pHT304-F2C4F8)转化JM109感受态细胞，挑取单克隆进行菌落PCR验证，提取质粒进行质粒双酶切鉴定与测序比对分析。

菌落PCR引物如下：

F2full：

5'-ggatcttccagagataagcttATGGAATCATTACAAATTGTTAATAACACACTTG-3'

R3full：5'-ctgccgttcgacgatggatccTTAAGGTGCATTTGCGGTTGA-3'

测序引物如下：

M13rev:5'-CAGGAAACAGCTATGA；

M13fwd:5'-GTAAAACGACGGCCAGT；

菌落PCR扩增按照如下程序进行：98℃预变性2min；30个Cycle(98℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸2min)；72℃延伸10min

3)将新鲜的枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800单菌落接种于2.5mL GMI培养基中，135r/min，37℃过夜培养；吸取过夜培养物，按1:10比例接种于2.5mL新鲜的GMI中，210r/min 37℃振荡培养3.5h；再吸取0.5mL的培养物按1:10比例转接GMII培养基中，210r/min，37℃振荡培养1.5h；4000r/min离心5min收集菌体，用500μl上清液重新悬浮细菌沉淀，即为枯草芽孢杆菌感受态细胞。将感受态细胞加入灭菌甘油至终浓度为10％，混匀后按照500ul/管分装，-60℃保存，转化时取出放于45℃水浴中溶化，即用即取。

提取测序成功的整合质粒pHT304-F2C4F8转化枯草芽孢杆菌WB800感受态细胞悬液至终浓度1μg/mL，质粒的体积不应超过感受态细胞悬液体积的1/20，轻轻翻转几次，混匀。37℃水浴，保温50min，恒温振荡摇床37℃，200r/min培养5h，以10μg/mL红霉素的MRS固体培养基筛选转化子。挑取转化子于液体培养基中培养6h，转化子通过通用PCR(图2)及质粒双酶切(图3)鉴定，鉴定后阳性转化子命名为pHT304-F2C4F8(WB800)。

4)再次活化阳性转化子，重组菌株菌种pHT304-F2C4F8(B.subtilisWB800)接种于MRS液体培养液(含红霉素100μg/mL)中，次日按照1％的接种量接种入新鲜的MRS培养液(含红霉素100μg/mL)中，37℃，250r/min振荡培养至OD₆₀₀≈0.4时，加入IPTG37℃诱导24h。

5)收集的发酵液离心收集菌体，并对发酵液上清经10％SDS-PAGE结束后，将未染色的聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白经半干转2h(1-2mA/m²)转移到NC膜上，5％脱脂奶粉封闭，以鼠源抗禽腺病毒fiberⅡ单抗作为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗，依次与之反应，最后用显色底物DAB显色；实验结果显示重组蛋白能被鼠源抗禽腺病毒fiberⅡ单克隆抗体识别，在大小约为55KD左右出现目的蛋白(图4)，符合理论值。

6)将发酵液离心收集菌体，将发酵上清液装入排阻20KD透析袋中进行PEG5000浓缩，将浓缩蛋白液上以2mL/min速度上样DEAE-Sepharose层析柱，经NaCl线性梯度洗脱收集峰，进行PEG20000浓缩得到融合抗原，得到抗原蛋白浓度为1mg/ml。

7)于1％的琼脂平板，中心孔加入禽腺病毒琼扩用抗血清标准品，取上述抗原蛋白(1mg/ml)依次做倍比稀释,将稀释梯度为2⁰、2¹、2²、2³、2⁴、2⁵……2¹¹抗原蛋白加入到周边孔，37℃恒温免疫反应，经中心孔与待检孔之间出现免疫沉淀线的最高稀释倍数确定待检抗原琼扩效价，经48h-72h观察记录结果，当融合蛋白抗原与抗血清之间出现沉淀线时判定为阳性反应。

结果表明，经序列改造重组后的目的蛋白表达出其天然的免疫反应原性，其琼扩效价为2⁶以上(图5A)。

实施例3：二价禽腺病毒基因工程亚单位疫苗的制备

包括如下步骤：

(1)油相制备：将Marcol-52白油94重量份与硬脂酸铝2重量份混合加热至80℃，再加入司本-80 6份，经121℃加热灭菌30min，冷至室温备用。

(2)水相制备：取实施例2制备的融合抗原稀释成为96重量份，使疫苗中融合抗原的含量为75μg/ml，加入灭菌冷却后的吐温-80 4重量份，充分搅拌至完全溶解；另取PBS96份，加入灭菌冷却后的吐温-80 4重量份，充分搅拌至完全溶解作为不含抗原蛋白有效成分的阴性对照组。

(3)乳化：按照抗原和油佐剂体积比为1:2的比例，取油相4份全部倒入适合的容器内，低转速下徐徐加入2份水相，8000转慢速搅拌1min，充分搅拌混匀后，停机1min。20000r/min高转速下充分搅拌90s，出现小气泡后再搅拌10min，在终止搅拌前加入1％硫酸汞溶液，使其终浓度为0.01％，乳化完成。

(4)分装：无菌定量分装，加盖密封，2-8℃保存。

本实施例分别采用AGP方法及免疫攻毒法同时进行实施例3中禽腺病毒亚单位疫苗的免疫效力检验；具体操作如下：

用21日龄SPF鸡40只，其中20只颈部皮下注射腺病毒二价基因工程亚单位疫苗0.2ml，另20只作为阴性对照，只免疫不含抗原蛋白有效成分的乳化液。

(1)AGP方法

接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，按照倍比稀释法，依次稀释至2¹¹。配置1％的高盐琼脂,加热溶解待琼脂完全融化后，取90mm培养皿，每个平皿中加入20ml，待平皿凝固后，用3mm梅花打孔器打孔，中心孔加入1群禽腺病毒琼扩抗原，周边依次加入倍比稀释各梯度血清，37℃恒温反应，以中心孔与待检孔之间出现免疫沉淀线的最高稀释倍数确定待检血清的抗体效价，经24h-72h观察记录结果，免疫组的鸡至少8只琼扩抗体不低于2⁷，对照组鸡应全部阴性。

(2)免疫攻毒法

用21日龄SPF鸡40只，其中20只颈部皮下注射本实施例制备的禽腺病毒二联基因工程亚单位疫苗0.2ml(免疫组)，对照组1的10只使用禽腺病毒4型攻毒、对照组2的10只用禽腺病毒8b型攻毒。

接种后第21天攻毒，将免疫组平均分成2组，免疫组1和对照组1胸肌肌肉注射禽腺病毒4型毒株，免疫组2和对照组2胸肌肌肉注射禽腺病毒8b型毒株，每只鸡胸肌注射0.2ml病毒液(约含10⁶TCID₅₀/0.1ml)，攻毒后观察记录鸡临床症状。

免疫后试验鸡血清抗体(AGP)效价结果如表1所示，免疫后21天，I群禽腺病毒FAdV琼扩抗体效价大于1：128倍，对照组鸡抗体效价均为阴性，经血清抗体检测能够产生符合规程标准的血清抗体，实验鸡攻毒检验结果见表2。

表1：免疫后鸡血清抗体(AGP)效价表

表2：实验鸡攻毒检验结果表

结果表明免疫组1的10只鸡能够抵御禽腺病毒4C的攻毒，免疫组2的10只鸡能够抵御禽腺病毒8b的攻击，相对保护率为100％，而对照组的保护率均为0/10。

经攻毒保护实验可以看出，经免疫本发明所制备疫苗的实验鸡可以抵抗禽腺病毒强毒攻击。

序列表

<110> 青岛海华生物技术有限公司

<120> 一种二价禽腺病毒特异性抗原融合蛋白

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 522

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Ser Leu Gln Ile Val Asn Asn Thr Leu Glu Val Lys Pro Asp Pro

1 5 10 15

Ser Gly Pro Leu Thr Val Ser Ala Asn Gly Leu Gly Leu Lys Tyr Asp

20 25 30

Thr Asn Thr Leu Ala Val Thr Ala Gly Ala Leu Thr Val Val Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Val Ser Thr Pro Ile Ala Thr Phe Val Ser Gly Ser Pro Ser

50 55 60

Leu Asn Thr Tyr Asn Ala Thr Thr Val Asn Ser Ser Ala Asn Ala Phe

65 70 75 80

Ser Cys Ala Tyr Tyr Leu Gln Gln Trp Asn Ile Gln Gly Leu Leu Val

85 90 95

Thr Ser Leu Tyr Leu Lys Leu Asp Ser Ala Thr Met Gly Asn Arg Pro

100 105 110

Gly Asp Leu Asn Ser Ala Asn Ala Lys Trp Phe Thr Phe Trp Val Ser

115 120 125

Ala Tyr Leu Gln Gln Cys Asn Pro Ser Gly Ile Gln Ala Gly Thr Val

130 135 140

Ser Pro Ser Thr Ala Thr Leu Thr Asp Phe Glu Pro Met Ala Asn Arg

145 150 155 160

Ser Val Thr Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Ala Asn Gly Tyr Tyr Glu Pro

165 170 175

Ser Ile Gly Glu Phe Gln Val Phe Ser Pro Val Val Thr Gly Ala Trp

180 185 190

Asn Pro Gly Asn Ile Gly Ile Arg Val Leu Pro Val Pro Val Ser Ala

195 200 205

Ser Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Leu Cys Tyr Ser Leu Gln Cys Thr Asn

210 215 220

Ala Ser Ile Phe Asn Pro Asn Asn Ser Gly Thr Met Ile Val Gly Pro

225 230 235 240

Val Leu Tyr Ser Cys Pro Ala Ala Ser Leu Pro Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Ala Ala Leu Lys

260 265 270

Val Ala Ala Asn Gly Pro Leu Glu Ser Thr Ala Thr Gly Leu Thr Leu

275 280 285

Asn Tyr Asp Pro Gly Asp Phe Thr Val Asn Ala Gly Thr Leu Ser Ile

290 295 300

Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val Ala Asn Ala Tyr Leu Thr Ser Gly Ala

305 310 315 320

Ser Thr Leu Gln Gln Phe Thr Ala Lys Ser Glu Asn Ser Ser Gln Phe

325 330 335

Ser Phe Pro Cys Ala Tyr Tyr Leu Gln Gln Trp Leu Ser Asp Gly Leu

340 345 350

Val Leu Ser Ser Leu Tyr Leu Lys Leu Asp Arg Ala Gln Phe Thr Asn

355 360 365

Met Pro Thr Gly Ala Asn Tyr Gln Asn Ala Arg Tyr Phe Thr Phe Trp

370 375 380

Val Gly Ala Gly Thr Ser Phe Asn Leu Ser Ala Leu Ser Glu Pro Thr

385 390 395 400

Ile Thr Pro Asn Thr Thr Gln Trp Asn Ala Phe Ala Pro Ala Leu Asp

405 410 415

Tyr Ser Gly Ala Pro Pro Phe Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Val Val Thr

420 425 430

Ile Tyr Phe Glu Pro Thr Ser Gly Arg Leu Glu Ser Tyr Leu Pro Val

435 440 445

Leu Thr Asp Asn Trp Ser Gln Thr Tyr Asn Pro Gly Thr Val Thr Leu

450 455 460

Cys Val Lys Thr Val Arg Val Gln Leu Arg Ser Gln Gly Thr Phe Ser

465 470 475 480

Thr Leu Val Cys Tyr Asn Phe Arg Cys Gln Asn Thr Gly Ile Phe Asn

485 490 495

Ser Asn Ala Thr Ala Gly Thr Met Thr Leu Gly Pro Ile Phe Phe Ser

500 505 510

Cys Pro Ala Leu Ser Thr Ala Asn Ala Pro

515 520

<210> 2

<211> 1569

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaatcattac aaattgttaa taacacactt gaagttaaac cagatcctag tgggccttta 60

actgtttcag caaatggact aggattgaaa tatgatacaa atacactagc ggtaactgca 120

ggtgcattga ctgttgttgg tggagggtct gtatcaactc caattgcaac atttgtcagc 180

ggtagcccat cactgaatac ttataatgcc acaacagtca atagttcagc taatgctttt 240

tcatgcgctt actacttaca gcaatggaac atacaaggcc tattggttac atctttatat 300

ttaaaattag attctgcaac catgggaaat agacctggag atttgaactc agccaatgca 360

aaatggttta ctttttgggt ttctgcttat ttacaacaat gtaatccgtc gggaatacaa 420

gctggaacgg tctctccgtc aaccgccact ttgacagatt ttgaaccaat ggcaaaccgc 480

agtgtgacgt ccccttggac ttactctgca aatggctatt atgaacctag tattggcgaa 540

tttcaagttt tcagtcctgt tgtaactggt gcttggaatc caggtaacat tggcattcgt 600

gttttgccag ttcctgtctc tgcttctgga gagcgttata ctctactttg ttattcattg 660

cagtgtacta atgcttcaat tttcaatcca aataattctg gtacaatgat tgtaggtcca 720

gtactttatt cctgtccagc ggcttcatta cccggtggcg gagggagtgg tggcggaggg 780

agtggtggcg gagggagtgg tgccgcagcg cttaaagttg ctgccaacgg acctttagag 840

tcaacagcga caggtttaac attgaattac gatccaggag attttaccgt caatgcgggg 900

accctgtcaa ttatacgtga tcctgcgctt gtggccaatg cttacctcac tagcggtgct 960

tctacacttc aacaatttac agcaaaatca gaaaattcaa gtcaatttag ttttccttgt 1020

gcttattatc tccaacaatg gctttcagac ggacttgtat taagttcgct ttatctgaaa 1080

cttgaccgag ctcagtttac taatatgcca actggggcga attatcagaa cgcacgttat 1140

ttcacatttt gggttggtgc cggcacctct ttcaacctct ccgctctaag tgagccaaca 1200

attactccaa atacaactca gtggaatgcc tttgctcctg ctttggatta tagtggagca 1260

ccgcctttta tttatgatgc ttcatcagtt gttacaatat attttgaacc tacaagtgga 1320

cgcttggaat cttatttacc agtactgaca gataattggt cacaaactta caatccaggt 1380

acagtgactc tctgcgtaaa aacagtaaga gtacaactgc gaagtcaagg aactttttct 1440

actttggttt gttataattt tcgttgtcaa aatactggaa tttttaactc aaatgccact 1500

gctggaacaa tgactttggg ccctattttc ttttcttgtc cagcattgtc aaccgcaaat 1560

gcaccttaa 1569

Claims (10)

1.一种抗原融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的抗原融合蛋白。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体中插入有权利要求2所述的基因。

5.一种重组工程菌株，其特征在于，所述的重组工程菌株中携带有权利要求4所述的重组表达载体。

6.如权利要求5所述的重组工程菌株，其特征在于，所述的重组工程菌株为枯草芽孢杆菌工程菌。

7.一种制备权利要求1所述的抗原融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求5所述的重组工程菌株发酵制备权利要求1所述的抗原融合蛋白。

8.权利要求1所述的抗原融合蛋白在制备用于预防禽腺病毒感染的制品中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的制品为亚单位疫苗。

10.一种亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗中的抗原包含有权利要求1所述的抗原融合蛋白。

Images