CN116019906A - 新型冠状病毒免疫原性组合物、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的新型冠状病毒免疫原性组合物包含混合的、来自不同毒株S蛋白的受体结合结构域和N端结构域，能够诱导产生针对不同毒株的中和抗体，实验表明，本发明的新型冠状病毒免疫原性组合物具有较高的免疫原性，对于不同的毒株均能够表现出相比于单价抗原显著提高的免疫效果，利用其制备的二价或多价疫苗适合作为一种应对COVID‑19的候选疫苗，针对当前快速传播的Omicron突变株也具有一定的应用潜力。

Description

新型冠状病毒免疫原性组合物、其制备方法和应用
技术领域
本申请属于生物医药工程技术领域，特别涉及一种新型冠状病毒免疫原性组合物、其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染可导致冠状病毒疾病(COVID-19)，常见体征有发热、咳嗽、咽痛等，在较严重病例中，感染可导致呼吸困难、低氧血症、急性呼吸窘迫综合征，甚至死亡。新型冠状病毒可以通过呼吸道和飞沫途径在人与人之间传播，也存在通过空气和消化道传播的可能。
SARS-CoV-2病毒颗粒包含4个结构蛋白，即刺突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)。研究发现，只有针对S蛋白的抗体有中和活性，因此目前研发中的疫苗均包含S蛋白或其组分。其中，S蛋白的受体结合结构域被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。受体结合结构域作为疫苗能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。SARS-CoV-2通过其受体结合结构域与宿主细胞受体hACE2结合而进入细胞。
新型冠状病毒在传播过程中不断进化，目前已检测到多个代表性突变株，例如阿尔法(Alpha)株、贝塔(Beta)株、德尔塔(Delta)株、奥密克戎(Omicron)株等。目前已开发或开发中的新型冠状病毒大多只能针对一种毒株，无法同时有效诱导针对不同毒株的免疫效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒免疫原性组合物，其包含混合的至少两种毒株S蛋白的受体结合结构域和N端结构域，该新型冠状病毒免疫原性组合物具有更高的免疫原性，能够激发针对不同毒株的中和抗体的产生，因而能够显著提高免疫效果。
为实现本发明目的，一方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含第一组分，所述第一组分包含至少一种新型冠状病毒毒株刺突蛋白(S蛋白)的受体结合结构域(RBD)或其功能活性片段；以及第二组分，所述第二组分包含至少一种新型冠状病毒毒株刺突蛋白的N端结构域(NTD)或其功能活性片段。该免疫原型组合物中，RBD或其功能活性片段和NTD或其功能活性片段不进行融合，而是直接进行混合。
在一些实施方式中，所述新型冠状病毒毒株选自以下毒株：原型株、阿尔法(Alpha)株、贝塔(Beta)株、伽马(Gamma)株、德尔塔(Delta)株、拉姆达(Lambda)株、缪(Mu)株和奥密克戎(Omicron)株。
世界卫生组织和其他命名系统对新型冠状病毒毒株命名的对应关系如下表所示。
新发现的毒株还可参见https://cov-lineages.org/lineage_list.html。
在一些实施方式中，所述奥密克戎(Omicron)株包括BA.1、BA.2、BA.3、BA.4以及BA.5变异株。
在一些实施方式中，所述第一组分包含2～4种新型冠状病毒毒株刺突蛋白的RBD或其功能活性片段；所述第二组分包含2～4种新型冠状病毒毒株刺突蛋白的NTD或其功能活性片段。
在一些实施方式中，所述第一组分包含的每种RBD或其功能活性片段与所述第二组分包含的每种NTD或其功能活性片段源自相同的新型冠状病毒毒株，即，同时具有某几种毒株的RBD或其功能活性片段以及NTD或其功能活性片段。
例如，在一些情况下，该免疫原性组合物包含的RBD或其功能活性片段以及NTD或其功能活性片段源自两种新型冠状病毒毒株，其中在一些实施例中，第一组分包含原型株的RBD和Beta株的RBD，第二组分包含原型株的NTD和Beta株的NTD；在另一些实施例中，第一组分包含原型株的RBD和Gamma株的RBD，第二组分包含原型株的NTD和Gamma株的NTD；在另一些实施例中，第一组分包含原型株的RBD和Omicron株的RBD，第二组分包含原型株的NTD株和Omicron株的NTD；在另一些实施例中，第一组分包含Beta株的RBD和Gamma株的RBD，第二组分包含Beta株的NTD和Gamma株的NTD；在另一些实施例中，第一组分包含Delta株的RBD和Omicron株的RBD，第二组分包含Delta株的NTD和Omicron株的NTD。
在一些情况下，该免疫原性组合物包含的RBD或其功能活性片段以及NTD或其功能活性片段源自三种新型冠状病毒，其中在一些实施例中，第一组分包含原型株的RBD、Delta株的RBD以及Omicron株的RBD，第二组分包含原型株的NTD、Delta株的NTD以及Omicron株的NTD；在另一些实施例中，第一组分包含Alpha株的RBD、Beta株的RBD以及Delta株的RBD，第二组分包含Alpha株的NTD、Beta株的NTD以及Delta株的NTD；在另一些实施例中，第一组分包含Alpha株的RBD、Lambda株的RBD以及Omicron株的RBD，第二组分包含Alpha株的NTD、Lambda株的NTD以及Omicron株的NTD。
在一些情况下，该免疫原性组合物包含的RBD或其功能活性片段以及NTD或其功能活性片段源自四种新型冠状病毒，其中在一些实施例中，第一组分包含原型株的RBD、Beta株的RBD、Delta株的RBD以及Mu株的RBD，第二组分包含原型株的NTD、Beta株的NTD、Delta株的NTD以及Mu株的NTD；在另一些实施例中，第一组分包含Alpha株的RBD、Beta株的RBD、Delta株的RBD以及Omicron株的RBD，第二组分包含Alpha株的NTD、Beta株的NTD、Delta株的NTD以及Omicron株的NTD；在另一些实施例中，第一组分包含Beta株的RBD、Gamma株的RBD、Delta株的RBD以及Omicron株的RBD，第二组分包含Beta株的NTD、Gamma株的NTD、Delta株的NTD以及Omicron株的NTD。
在本发明中，第一和第二仅用于表示抗原的不同种类，并不表示各抗原之间存在任何顺序。
在一些实施方式中，原型株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，贝塔(Beta)株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，伽马(Gamma)株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，德尔塔(Delta)株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，奥密克戎(Omicron)BA.1株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，BA.2变异株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，BA.3变异株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，BA.4和BA.5变异株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。
在一些实施方式中，原型株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，贝塔(Beta)株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:10，伽马(Gamma)株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:11，德尔塔(Delta)株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:12，奥密克戎(Omicron)BA.1株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:13，BA.2变异株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:14，BA.3变异株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:15，BA.4和BA.5变异株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:16。
在一些实施方式中，所述第一组分中的RBD或其功能活性片段还连接有以下多肽中的至少一种：P2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(HBsAg)或其功能活性片段。
在一些实施方式中，所述第二组分中的NTD或其功能活性片段还连接有以下多肽中的至少一种：P2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(HBsAg)或其功能活性片段。
在一些实施方式中，所述多肽与所述RBD或其功能性片段在框内融合，所述多肽与所述NTD或其功能性片段在框内融合。
在一些实施方式中，，所述P2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。例如，在同一开放阅读框内融合表达。
在一些实施方式中，所述P2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。
在一些实施方式中，所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体T4纤维蛋白C末端的氨基酸残基。
在一些实施方式中，所述铁蛋白包含粉纹夜蛾铁蛋白或幽门螺杆菌铁蛋白。
在一些实施方式中，所述P2或其功能活性片段包含SEQ ID NO:17～19中任一项所示的氨基酸序列；所述foldon结构域或其功能活性片段包含SEQ ID NO:20～22中任一项所示的氨基酸序列；所述粉纹夜蛾铁蛋白包括重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述直接或间接相连包含通过连接子相连。
在一些实施方式中，所述连接子包含刚性接头、柔性接头或其他序列。
在一些实施方式中，所述连接子包含SEQ ID NO:27～28中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述第一组分和所述第二组分的重量比为(1-15)：(1-15)，优选为1:1。
在一些实施方式中，所述第一组分中，任意两种RBD或其功能活性片段的重量比为(1-5)：(1-5)，优选为1:1。
在一些实施方式中，所述第二组分中，任意两种NTD或其功能活性片段的重量比为(1-5)：(1-5)，优选为1:1。
本发明另一方面提供了一种药物组合物，其包含上述免疫原性组合物，及任选地药学上可接受的赋形剂。
本发明第三方面提供了上述免疫原性组合物，或上述药物组合物，在制备疫苗中的用途。
在一些实施方式中，所述疫苗用于预防和/或治疗COVID-19。
本发明第四方面提供了一种制备COVID-19亚单位疫苗的方法，其包括：
1)提供上述免疫原性组合物或药物组合物；以及
2)使1)中所述的免疫原性组合物或药物组合物与药学上可接受的佐剂混合。
本发明第五方面提供了一种根据上述方法制备的COVID-19亚单位疫苗。
在一些实施方式中，每剂疫苗包含所述新型冠状病毒免疫原性组合物10-80μg，优选20-50μg。
在一些实施方式中，所述佐剂选自铝佐剂、MF59、MPL、QS-21、GLA、CpG、AS01、AS02、AS03、AS04佐剂中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
本发明的新型冠状病毒免疫原性组合物包含混合的、来自不同毒株S蛋白的受体结合结构域和N端结构域，能够诱导产生针对不同毒株的中和抗体，实验表明，本发明的新型冠状病毒免疫原性组合物具有较高的免疫原性，对于不同的毒株均能够表现出相比于单价抗原显著提高的免疫效果，利用其制备的二价或多价疫苗适合作为一种应对COVID-19的候选疫苗，针对当前快速传播的Omicron突变株也具有一定的应用潜力。
附图说明
图1显示的是转染后的细胞系传代稳定性检测结果。
图2显示的是用SDS-PAGE电泳与WB验证NTD-RBD-Foldon(原型株)蛋白的结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，若无特殊说明，实施例中未说明具体毒株之处均可默认为是野生型毒株(原型株)，未说明具体Omicron变异株之处均可默认为是BA.1变异株。
术语定义：
在本申请中，术语“S蛋白”，也称为“Spike蛋白”或“刺突蛋白”，通常是指冠状病毒的衣壳表面糖蛋白。SARS-CoV-2通过S蛋白与ACE2受体结合并侵入细胞。原型株的S蛋白由1273个氨基酸组成，含有一个跨膜区，包含来自冠状病毒的衣壳表面糖蛋白从N端起或从第14位氨基酸起至少到1273氨基酸片段，或者来自其它SAS病毒的相应区域。S1蛋白是S蛋白的亚单位1，主要指从N端或第14位氨基酸起到第685氨基酸片段。
在本申请中，术语“RBD”是指SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合结构域。例如，在本申请中，原型株的RBD可为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)310-560氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以截短N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本申请中，原型株的RBD可为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)319-541氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以适宜地截短N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本申请中，原型株的RBD可为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)331-524氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以适宜地截短N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。在本申请中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，RBD还可以是贝塔(Beta)突变体、伽马(Gamma)突变体、德尔塔(Delta)突变体或奥密克戎(Omicron)突变体的RBD。
在本申请中，术语“NTD”即SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)N端结构域。例如，在本申请中，原型株的NTD可以为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)13-353氨基酸之间的肽段或其突变体，也可以适宜地截短N端或C端1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25或30个氨基酸。例如，原型株的NTD可以为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)13-303氨基酸之间的肽段或其突变体。在本申请中，原型株的NTD可以为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)14-304氨基酸之间的肽段或其突变体。在本申请中，原型株的NTD可以为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)18-353氨基酸之间的肽段或其突变体。在本申请中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，NTD还可以是贝塔(Beta)突变体、伽马(Gamma)突变体或德尔塔(Delta)突变体的NTD。
在本申请中，术语“Foldon结构域”通常是指在噬菌体T4纤维蛋白的C末端的残基。在本申请中，Foldon结构域可以是噬菌体T4纤维蛋白的C末端的27个残基或突变体。在本申请中，Foldon结构域可以是噬菌体T4纤维蛋白的C末端的27个残基截短或增加N端或C端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的截短体或增长体。在本申请中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。
在本申请中，术语“P2”通常是指破伤风毒素的表位肽。例如，P2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段或其突变体。例如，P2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段或其突变体。例如，P2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段或其突变体。例如，P2可以是破伤风毒素的表位肽829到844的肽段截短或增加N端或C端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，P2可以是破伤风毒素的表位肽830到845的肽段截短或增加N端或C端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。例如，P2可以是破伤风毒素的表位肽830到844的肽段截短或增加N端或C端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的肽段。在本申请中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。
在本申请中，术语“铁蛋白”、“ferritin”通常是指粉纹夜蛾铁蛋白或幽门螺旋杆菌铁蛋白。在本申请中，粉纹夜蛾铁蛋白具有重链和轻链(ferritin LC和ferritin HC)。在本申请中，幽门螺旋杆菌铁蛋白具有单链结构。在本申请中，铁蛋白可以是粉纹夜蛾或幽门螺旋杆菌铁蛋白的突变体。在本申请中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在本申请中，“粉纹夜蛾铁蛋白的轻链”、“LC”可以与“ferritin LC”互换使用。在本申请中，“粉纹夜蛾铁蛋白的重链”、“HC”可以与“ferritin HC”互换使用。
在本申请中，术语“乙肝表面抗原(HBsAg)”通常是指乙肝病毒最外层包膜中的一种外壳蛋白。例如，乙肝表面抗原的氨基酸序列可以为NCBI中的蛋白序列检索号AAA45524、ANJ76941、CAA24234或AAC34729对应的序列，也可以适宜地截短或增加N端或C端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸，或有蛋白的突变，例如缺失、置换或插入一个或多个氨基酸。
在本申请中，术语“功能活性片段”通常是指与RBD、NTD、Foldon结构域、Fc结构域、P2、铁蛋白、乙肝表面抗原HBsAg具有相似生物学活性的片段。
在本申请中，术语“融合蛋白”通常是指通过基因工程技术得到的具有生物学功能活性的蛋白分子。在本申请中，融合蛋白可以是NTD或其功能活性片段和RBD或其功能活性片段组成的融合蛋白。在本申请中，融合蛋白还可以是NTD或其功能活性片段、RBD或其功能活性片段与Foldon结构域、P2、铁蛋白、乙肝表面抗原HBsAg或人免疫球蛋白的Fc结构域组成的融合蛋白。Foldon结构域P2、铁蛋白、乙肝表面抗原HBsAg或Fc结构域与RBD或其功能活性片段直接相连或通过接头相连。接头序列可以为GSGSG等。
在本申请中，术语“免疫原性组合物”通常是指一种亚单位组合物。在本申请中，亚单位组合物是在将组分混合形成抗原性组合物之前，其中组分已经被分离并纯化到至少50％、至少60％、70％、80％、90％纯度的组合物。例如，亚单位组合物可以是水溶性蛋白的水溶液。例如，所述亚单位组合物可包含洗涤剂。例如，亚单位组合物可包含非-离子、两性离子或离子洗涤剂。例如，亚单位组合物可包含脂类。
在本申请中，术语“佐剂”是指能够增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质。本申请中的佐剂可以选自铝佐剂、MF59、MPL、QS-21、GLA、CpG、AS01、AS02、AS03、AS04佐剂中的一种或多种。
在本申请中，术语“重量比”通常是指免疫原性组合物的各组分的重量比。在本申请中，免疫原性组合物每剂量可含有如下成份：第一组分5-60μg和第二组分5-60μg。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第一组分。例如，免疫原性组合物可以包含5μg、10μg、20μg、30μg或40μg的第二组分。在本申请中，免疫原性组合物还可以包含三种或更多的组分。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“左右”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“宿主细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞，细胞系或细胞培养物。所述宿主细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的，意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的融合蛋白即可。所述宿主细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO细胞。
实施例1构建RBD-P2-6*HIS(GP101150-7)重组表达质粒
信号肽添加：MGVPAVPEASSPRWGTLLLAIFLAASRGLVAA(SEQ ID NO：56)。载体选择:pcdna3.1(+)，按照宿主CHO细胞进行密码子优化。
片段的克隆。RBD-P2-6*HIS的引物通过PCR的方法扩增得到片段PCR产物,通过多段重组的方法重组到目的载体pcdna3.1(+)(BamHI-XhoI酶切载体)中，得到RBD-P2-6*HIS(GP101150-7)重组表达质粒。反应体系如表1所示。
表1处理好的目的片段与载体连接反应体系
名称 体积
酶切后载体 5μl
纯化的PCR产物 5μl
无缝组装MIX 10μl
总体积 20μl
以上连接液在52℃恒温环境下连接30min，得到RBD-P2-6*HIS(GP101150-7)重组表达质粒。
转化的方法：(1)将浓度在100ng/μl的RBD-P2-6*HIS(GP101150-7)重组表达质粒吸取1-3μl加入到100μl的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。(2)42℃水浴90s不要摇动。(3)冰浴中放置3分钟左右。(4)每管中加入500-800μl 37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。
RBD-P2-6*HIS(GP101150-7)重组表达质粒的验证：(1)制备含相应抗性的琼脂平板。(2)取100μl菌液，然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15分钟。(3)倒置平板于37℃培养12-16小时可出现菌落。(4)平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序。
克隆质粒的鉴定方法：PCR扩增RBD-P2-6*HIS片段，鉴定引物序列由公司内部引物部合成预期扩增的片段长度为861bp，PCR反应采用20μL体系：引物0.5μL，模板菌液2μL，聚合酶缓冲液0.5μL，buffer 3μl，ddH2O 14μL。循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min。以菌液PCR方法筛选阳性克隆，获得的阳性菌液37℃摇菌提质粒，测序。测序比对正确的质粒，用BamHI-XhoI进行双酶切，获得861bp、5372bp两个片段。
RBD-P2-6*HIS(GP101150-7)重组表达质粒抽提：接1％含RBD-P2-6*HIS(GP101150-7)重组表达质粒的大肠杆菌细胞(stbl3)于2mlLB培养基，37℃振荡培养过夜。处理细胞后，使用质粒提取试剂盒提取100μg质粒。测序比对正确的质粒，用BamHI-XhoI进行双酶切，获得861bp、5372bp两个片段。
实施例2细胞转染及RBD-P2-6*HIS蛋白纯化
在所有细胞操作过程中，温和地旋转混合宿主细胞，避免剧烈的混合/移液。继代培养和扩增CHO细胞(来自Thermo公司的EXPICHO)直到细胞密度达到4×106–6×106个/mL。第-1天：细胞扩增，扩增培养细胞到3×106–4×106个/mL，并允许细胞过夜生长。第0天：转染细胞，测定活细胞密度和存活率，细胞的密度应该达7×106–10×106个/mL,存活率到95–99％进行转染，新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/mL，50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。使用OPti-PRO SFM培养基制备转染试剂和RBD-P2-6*HIS(GP101150-7)重组表达质粒复合物(4℃)，例：1ml CHO细胞准备40μlOPti-PRO SFM添加0.8μg RBD-P2-6*HIS(GP101150-7)重组表达质粒混匀放置5min；准备40μl OPti-PRO SFM添加3μl Expi Fectamine CHO试剂混匀放置5min，室温下1–5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。转染后18-22小时，添加Enhancer和ExpiCHO Feed，执行标准实验方案。例：1ml细胞添加6μl Enhancer和0.24ml ExpiCHO Feed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。转染后8天收集，进行后续纯化。
蛋白纯化。培养基离心，上清添加Ni柱，振荡孵育2h，经过重力空柱管柱进行亲和层析纯化。平衡缓冲液：“PBS”,pH7.4，清洗10CV；清洗缓冲液：“PBS”,pH7.4 with20 mMimidazole，清洗10CV；洗脱缓冲液：“PBS”,pH7.4with 500mM imidazole，洗脱1CV，重复5次，得到RBD-P2-6*HIS纯化蛋白，如表2所示。
表2蛋白纯化后的浓度和体积
P101150-7 Concentration(mg/ml) Volume(ml)
RBD-P2-6*HIS 0.05 1
SDS-PAGE电泳与WB验证。A.1.0mm PAGE胶，上样量8μl，跑胶顺序：M.Molecularweight marker.Me.Culture medium.FT.Flow through.W.Wash.E.Eluted fractions。B.电泳:将RBD-P2-6*HIS纯化蛋白与上样缓冲液混合(RBD-P2-6*HIS纯化蛋白:5×上样缓冲液＝4:1)，煮沸5min，进行点样。首先100V恒压电泳，可以看到Marker逐渐变成一条细线。待Marker进入分离胶后，将电压调到300V继续电泳，直到蓝色的溴酚蓝条带到达胶的底部(约25min)。C.转膜，撬开玻璃板，小心取出凝胶。PVDF膜用甲醇活化30s后和滤纸剪成和胶块相同大小，在转膜液中浸透。从下往上依次为：滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸。注意各层之间尤其是胶和膜之间不能有气泡。将平皿中的转膜液全部倒进转膜盒中。20V恒压转移，50KDa蛋白需20min。分子量越大需时间越长。D.抗体孵育，转膜后取出PVDF膜，可以看到Marker转移到膜上。用5％脱脂奶(1g脱脂奶粉加100ml PBST)封闭1小时，用PBST漂洗2×5min。一抗(anti-His Mab)用5％脱脂奶粉(1g脱脂奶粉，100ml TBS)稀释，放在小盒中孵育，4℃脱色摇床中反应2h。取出PVDF膜，PBST漂洗4×10min。二抗(羊抗鼠)也用5％脱脂奶粉稀释，孵育1小时。PBST漂洗4×10min。均使用摇床震动。E.显色，ECL显色:每一块PBST膜，用A液1mL和B液10μL混合后滴在膜上，5min后在化学发光成像系统中拍照记录，如图1所示。
实施例3构建NTD-P2-6*HIS(GP101150-8)重组表达质粒
信号肽添加：MFVFLVLLPLVS(SEQ ID NO：57)，载体选择:pcdna3.1(+)。按照宿主CHO细胞进行密码子优化。NTD-P2-6*HIS的引物通过PCR的方法扩增得到片段PCR产物,通过多段重组的方法重组到目的载体pcdna3.1(+)(BamHI-XhoI酶切载体)中，得到NTD-P2-6*HIS(GP101150-8)重组表达质粒。反应体系如表3所示。
表3处理好的目的片段与载体连接反应体系
名称 体积
酶切后载体 5μl
纯化的PCR产物 5μl
无缝组装MIX 10μl
总体积 20μl
转化的方法：将浓度在100ng/μl左右的NTD-P2-6*HIS(GP101150-8)重组表达质粒吸取1-3μl加入到100μl左右的感受态细胞里，轻轻晃动旋转以混匀，冰上放置3分钟。42℃水浴90s不要摇动；冰浴中放置3分钟左右；每管中加入500-800μl 37℃预温LB培养基，37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。
NTD-P2-6*HIS(GP101150-8)重组表达质粒的验证：(1)制备含相应抗性的琼脂平板。(2)取100μl菌液，然后平铺在含有相应抗性的琼脂板，用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面，将平板置于37℃培养15分钟。(3)倒置平板于37℃培养12-16小时可出现菌落。(4)平板挑菌，37℃250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液送测序。
克隆质粒的鉴定方法：PCR扩增NTD-P2-6*HIS片段，鉴定引物序列由公司内部引物部合成预期扩增的片段长度为1005bp，PCR反应采用20μL体系：引物0.5μL，模板菌液2μL，聚合酶缓冲液0.5μL，buffer 3μl，ddH2O 14μL。循环参数：96℃预变性3min；95℃15s，58℃15s，72℃20s，23个循环，72℃终延伸1min。以菌液PCR方法筛选阳性克隆，获得的阳性菌液37℃摇菌提质粒，测序。测序比对正确的质粒，用BamHI-XhoI进行双酶切，获得1005bp、5372bp两个片段。
NTD-P2-6*HIS(GP101150-8)重组表达质粒抽提。接1％含NTD-P2-6*HIS(GP101150-8)重组表达质粒的大肠杆菌细胞(stbl3)于2ml LB培养基，37℃振荡培养过夜。处理细胞后，使用质粒提取试剂盒提取100μg质粒。测序比对正确的质粒，用BamHI-XhoI进行双酶切，获得1005bp、5372bp两个片段。
实施例4细胞转染及NTD-P2-6*HIS(GP101150-8)蛋白纯化
在所有细胞操作过程中，温和地旋转混合宿主细胞；避免剧烈的混合/移液。继代培养和扩增CHO细胞直到细胞密度达到4×106–6×106个/mL。第-1天：CHO细胞扩增，扩增培养细胞到3×106–4×106个/mL，并允许细胞过夜生长。第0天：转染细胞，测定活细胞密度和存活率，细胞的密度应该达7×106–10×106个/mL,存活率到95–99％进行转染，新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为6×106个/mL，50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。使用OPti-PRO SFM培养基制备转染试剂和NTD-P2-6*HIS(GP101150-8)重组表达质粒复合物(4℃)，例：1ml细胞准备40μl OPti-PRO SFM添加0.8μg NTD-P2-6*HIS(GP101150-8)重组表达质粒混匀放置5min；准备40μl OPti-PRO SFM添加3μl ExpiFectamine CHO试剂混匀放置5min，室温下1–5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。转染后18-22小时，添加Enhancer和ExpiCHO Feed，执行标准实验方案。例：1ml细胞添加6μlEnhancer和0.24ml ExpiCHO Feed，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。转染后8天收集，进行后续纯化。
蛋白纯化，培养基离心，上清添加Ni柱，振荡孵育2h，经过重力空柱管柱进行亲和层析纯化。平衡缓冲液：“PBS”,pH7.4，清洗10CV；清洗缓冲液：“PBS”,pH7.4 with20 mMimidazole，清洗10CV；洗脱缓冲液：“PBS”,pH7.4 with 500mM imidazole，洗脱1CV，重复5次，得到NTD-P2-6*HIS(GP101150-8)纯化蛋白，结果如表4所示。
表4 NTD-P2-6*HIS(GP101150-8)纯化蛋白的浓度和体积
P101150-8 浓度(mg/ml) 体积(ml)
NTD-P2-6*HIS 0.03 1
SDS-PAGE电泳与WB验证。A.1.0mm PAGE胶，上样量8μl，跑胶顺序：M.Molecularweight marker.Me.Culture medium.FT.Flow through.W.Wash.E.Eluted fractions。B.电泳:将NTD-P2-6*HIS(GP101150-8)纯化蛋白与上样缓冲液混合(NTD-P2-6*HIS(GP101150-8)纯化蛋白:5×上样缓冲液＝4:1)，煮沸5min，进行点样。首先100V恒压电泳，可以看到Marker逐渐变成一条细线。待Marker进入分离胶后，将电压调到300V继续电泳，直到蓝色的溴酚蓝条带到达胶的底部(约25min)。C.转膜。撬开玻璃板，小心取出凝胶。PVDF膜用甲醇活化30s后和滤纸剪成和胶块相同大小，在转膜液中浸透。从下往上依次为：滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸。注意各层之间尤其是胶和膜之间不能有气泡。将平皿中的转膜液全部倒进转膜盒中。20V恒压转移，50KDa蛋白需20min。分子量越大需时间越长。D.抗体孵育。转膜后取出PVDF膜，可以看到Marker转移到膜上。用5％脱脂奶(1g脱脂奶粉加100ml PBST)封闭1小时，用PBST漂洗2×5min。一抗(anti-His Mab)用5％脱脂奶粉(1g脱脂奶粉，100mlTBS)稀释，放在小盒中孵育，4℃脱色摇床中反应2h。取出PVDF膜，PBST漂洗4×10min。二抗(羊抗鼠)也用5％脱脂奶粉稀释，孵育1小时。PBST漂洗4×10min。均使用摇床震动。E.显色。ECL显色:每一块PBST膜，用A液1mL和B液10μL混合后滴在膜上，5min后在化学发光成像系统中拍照记录，如图2所示。
实施例5构建载体和蛋白表达
参照上述实施例，构建如下需要表达的目的片段，并表达纯化蛋白，如表5所示。
表5不同的目的片段
实施例6药物组合物的制备
0.04mg/mL的RBD蛋白，0.04mg/mL的NTD蛋白；2％至15％(w/v)蔗糖；0.01％至0.05％(w/v)吐温80；和pH为5.0至7.0的5mM至25mM组氨酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。
实施例7药物组合物的制备
0.04mg/mL的RBD-P2蛋白，0.04mg/mL的NTD-P2蛋白；2％至15％(w/v)山梨糖醇；0.01％至0.05％(w/v)聚山梨酯20；和pH为5.5至7.0的5mM至20mM组氨酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。
实施例8药物组合物的制备
0.04mg/mL的RBD蛋白，0.04mg/mL的NTD-P2蛋白；2％至15％(w/v)蔗糖；0.01％至0.05％(w/v)吐温80；和pH为4.5至5.5的5mM至25mM琥珀酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。
实施例9药物组合物的制备
0.04mg/mL的RBD-P2蛋白，0.04mg/mL的NTD蛋白；2％至15％(w/v)山梨糖醇；0.01％至0.05％(w/v)聚山梨酯20；和pH为5.5至7.0的5mM至20mM组氨酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。
实施例10疫苗的制备
实施例6-9中任一项所述的药物组合物，该组合物进一步包含氢氧化铝佐剂，浓度为1mg/mL。
实施例6-9中任一项所述的药物组合物中加入CpG1018佐剂(CpG由上海生工生物公司按CpG1018序列合成)，浓度为6mg/mL。
实施例11疫苗的制备
实施例6-9中任一项所述的药物组合物，该组合物进一步包含佐剂，例如佐剂瓶为0.5ml,50μg的MPL，500μg氢氧化铝，150mM的NaCl，8mM的二水磷酸氢二钠，加注射用水至0.5ml。
实施例12疫苗的制备
实施例6-9中任一项所述的药物组合物，该组合物进一步包含佐剂，例如佐剂瓶为0.25ml,成份包括10.69mg的角鲨烯，11.86mg的α-生育酚，4.86mg的吐温80，3.53mg的NaCl，0.09mg的KCl，0.51mg的Na2HPO4，0.09mg的KH2PO4和注射用水。
实施例13疫苗的制备
实施例6-9中任一项所述的药物组合物，该组合物进一步包含佐剂，例如佐剂瓶为0.5ml，成份包括50μg的MPL，50μg的QS-21，1mg的DOPC二油酰磷脂酰胆碱，0.25mg的胆固醇，0.15mg的无水磷酸二钠，0.54mg的磷酸二氢钾，4.385mg的氯化钠，和注射用水。
实施例14疫苗的制备
实施例6-9中任一项所述的药物组合物，该组合物进一步包含佐剂，例如佐剂瓶为0.5ml，成份包括9.75mg角鲨烯、1.175mg司盘85、1.175mg吐温80、0.66mg二水合柠檬酸三钠和0.04mg一水合柠檬酸，和注射用水。
实施例15不同抗原与佐剂的小鼠免疫实验
抗原蛋白结合不同佐剂用于免疫小鼠，蛋白诱导的中和抗体水平通过ELISA测定确定。小鼠分组及免疫方案如表6所示。
表6小鼠分组表
其中的NTD蛋白序列为SEQ ID NO：9，RBD的序列为SEQ ID NO：1，Al(OH)3佐剂、CpG佐剂、CpG+Al(OH)3佐剂参照实施例10的浓度，AS01的组成参照实施例13，AS04的组成参照实施例11，小鼠免疫后28天检测结果如表7所示。结果显示，RBD+NTD诱导产生中和抗体的水平更强。
表7小鼠免疫后28天后检测结果
实施例16不同抗原与佐剂的免疫原性评价实验
抗原蛋白与MF59佐剂共同用于免疫日本大耳白兔，蛋白诱导的中和抗体水平通过ELISA检测确定。兔子分组及免疫方案如表8所示。
表8兔子分组表
NTD-P2的序列见SEQ ID NO：48，RBD-P2的序列参照SEQ ID NO：49，NTD-foldon的序列见SEQ ID NO：50，RBD-foldon的序列见SEQ ID NO：51，NTD-ferritin LC的序列见SEQID NO：52，RBD-ferritin的序列参照SEQ ID NO：53，NTD-HBsAg的序列参照SEQ ID NO：54，RBD-HBsAg的序列参照SEQ ID NO：55，佐剂MF59参照实施例14。
免疫28天后的检测结果如表9所示，各组均能产生一定水平的中和抗体，其中以NTD-P2+RBD-P2组最佳、显著高于其余各组，NTD-ferritin+RBD-ferritin/NTD-HBsAg+RBD-HBsAg两组次之，说明上述融合蛋白对新型冠状病毒具有一定的免疫原性。
表9兔子免疫28天后的检测结果
实施例17不同抗原与佐剂的免疫原性评价实验
抗原蛋白与不同佐剂共同用于免疫恒河猴，蛋白诱导的中和抗体水平通过ELISA测定确定。猴子分组及免疫方案如下，阳性对照为新冠的灭活苗(购自北京生物制品研究所有限责任公司)。猴子免疫28天后的检测结果如表10所示。
表10猴子免疫结果
结果显示，采用AS03佐剂时(参照实施例12)，产生的几何平均滴度最高、且显著高于其余各组，表明AS03佐剂对于本发明提供的新型冠状病毒疫苗而言是较为合适的佐剂。
实施例18小鼠中重组新冠疫苗候选抗原诱导中和抗体产生的效果检测
以原型株序列为基础，选择NTD和RBD作为候选抗原。检测单独NTD、单独RBD、NTD和RBD共免疫、NTD-RBD融合蛋白(以下简称NR)，以及NTD-RBD-foldon融合蛋白(以下简称NR-foldon)的免疫原性，结果如表12所示。结果显示，NR-foldon抗原和AS03佐剂联合免疫BALB/c小鼠后，能够显著有效诱导机体产生高滴度的中和抗体(基于SARS-CoV-2病毒株及VSV假病毒检测系统)和抗原特异性IgG抗体，其中，对原型株以及D614G、巴西突变株P.1(Gamma)的中和效果显著优于其他抗原。
另外，RBD+NTD组中，各抗原成分的用量均被减半后仍能产生一定水平的中和抗体和IgG抗体，可见这一组合方式本身同样具备良好的免疫潜力。
表11 BALB/c小鼠中重组新冠疫苗候选抗原实验设计概况
表12 BALB/c小鼠中重组新冠疫苗候选抗原的筛选结果
备注：1.基于SARS-CoV-2毒株的新冠病毒中和抗体检测，下同。
2.假病毒类型：原型株、主要流行毒株(D614G)；VOC变异毒株：英国Alpha突变株(Alpha，B.1.1.7)、Beta南非突变株(Beta，B.1.351)、Gamma巴西突变株(Gamma，P.1)、Delta印度突变株(Delta，B.1.617.2)；VOI变异毒株：Lambda秘鲁突变株(Lambda，C.37)，下同。
实施例19构建载体和蛋白表达
参照实施例1～4，构建如下需要表达的目的片段，并表达纯化蛋白：
RBD(Alpha)-HBsAg-6*HIS；NTD(Alpha)-HBsAg-6*HIS；RBD(Alpha)-P2-6*HIS；NTD(Alpha)-P2-6*HIS；RBD(Beta)-HBsAg-6*HIS；NTD(Beta)-HBsAg-6*HIS；RBD(Beta)-P2-6*HIS；NTD(Beta)-P2-6*HIS；RBD(Gamma)-HBsAg-6*HIS；NTD(Gamma)-HBsAg-6*HIS；RBD(Gamma)-P2-6*HIS；NTD(Gamma)-P2-6*HIS；RBD(Delta)-HBsAg-6*HIS；NTD(Delta)-HBsAg-6*HIS；RBD(Delta)-P2-6*HIS；NTD(Delta)-P2-6*HIS；RBD(Omicron)-HBsAg-6*HIS；NTD(Omicron)-HBsAg-6*HIS；RBD(Omicron)-P2-6*HIS；NTD(Omicron)-P2-6*HIS
实施例20药物组合物的制备
0.02mg/mL的RBD(原型株)蛋白，0.02mg/mL的NTD(原型株)蛋白，0.02mg/mL的RBD(Beta)蛋白，0.02mg/mL的NTD(Beta)蛋白；2％至15％(w/v)蔗糖；0.01％至0.05％(w/v)吐温80；和pH为5.0至7.0的5mM至25mM组氨酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。
实施例21疫苗的制备
实施例20所述的药物组合物中加入氢氧化铝佐剂和CpG1018佐剂，其中氢氧化铝佐剂的终浓度为1mg/mL，CpG1018佐剂的终浓度为6mg/mL。
实施例22疫苗的制备
实施例20所述的药物组合物中加入如下佐剂：每份佐剂瓶为0.25ml，包括10.69mg的角鲨烯，11.86mg的α-生育酚，4.86mg的吐温80，3.53mg的NaCl，0.09mg的KCl，0.51mg的Na2HPO4，0.09mg的KH2PO4和注射用水。
实施例23药物组合物的制备
0.02mg/mL的RBD(原型株)蛋白，0.02mg/mL的NTD(原型株)蛋白，0.02mg/mL的RBD(Omicron)蛋白，0.02mg/mL的NTD(Omicron)蛋白；2％至15％(w/v)蔗糖；0.01％至0.05％(w/v)吐温80；和pH为5.0至7.0的5mM至25mM组氨酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。
实施例24疫苗的制备
实施例23所述的药物组合物中加入氢氧化铝佐剂和CpG1018佐剂，其中氢氧化铝佐剂的终浓度为1mg/mL，CpG1018佐剂的终浓度为6mg/mL。
实施例25疫苗的制备
实施例23所述的药物组合物中加入如下佐剂：每份佐剂瓶为0.25ml,，包括10.69mg的角鲨烯，11.86mg的α-生育酚，4.86mg的吐温80，3.53mg的NaCl，0.09mg的KCl，0.51mg的Na2HPO4，0.09mg的KH2PO4和注射用水。
实施例26药物组合物的制备
0.02mg/mL的RBD(Beta)蛋白，0.02mg/mL的NTD(Beta)蛋白，0.02mg/mL的RBD(Gamma)蛋白，0.02mg/mL的NTD(Gamma)蛋白；2％至15％(w/v)蔗糖；0.01％至0.05％(w/v)吐温80；和pH为5.0至7.0的5mM至25mM组氨酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。
实施例27疫苗的制备
实施例26所述的药物组合物中加入氢氧化铝佐剂和CpG1018佐剂，其中氢氧化铝佐剂的终浓度为1mg/mL，CpG1018佐剂的终浓度为6mg/mL。
实施例28疫苗的制备
实施例26所述的药物组合物中加入如下佐剂：每份佐剂瓶为0.25ml,，包括10.69mg的角鲨烯，11.86mg的α-生育酚，4.86mg的吐温80，3.53mg的NaCl，0.09mg的KCl，0.51mg的Na2HPO4，0.09mg的KH2PO4和注射用水。
实施例29药物组合物的制备
0.02mg/mL的RBD(Delta)蛋白，0.02mg/mL的NTD(Delta)蛋白，0.02mg/mL的RBD(Omicron)蛋白，0.02mg/mL的NTD(Omicron)蛋白；2％至15％(w/v)蔗糖；0.01％至0.05％(w/v)吐温80；和pH为5.0至7.0的5mM至25mM组氨酸缓冲液，分装到2ml管制瓶，每管0.5ml，置冻干机进行冷冻干燥。
实施例30疫苗的制备
实施例29所述的药物组合物中加入氢氧化铝佐剂和CpG1018佐剂，其中氢氧化铝佐剂的终浓度为1mg/mL，CpG1018佐剂的终浓度为6mg/mL。
实施例31疫苗的制备
实施例29所述的药物组合物中加入如下佐剂：每份佐剂瓶为0.25ml,，包括10.69mg的角鲨烯，11.86mg的α-生育酚，4.86mg的吐温80，3.53mg的NaCl，0.09mg的KCl，0.51mg的Na2HPO4，0.09mg的KH2PO4和注射用水。
实施例32小鼠中重组新冠疫苗候选抗原诱导中和抗体产生的效果检测
分别以实施例12、22、25、28、31提供的疫苗作为候选疫苗，按照实施例18提供的方法对小鼠进行免疫，比较各组疫苗对不同毒株假病毒的免疫原性，结果如表14所示。
结果显示，各组疫苗对不同毒株均能产生一定水平的中和抗体和较高的抗原特异性抗体IgG，并且对抗原相应的毒株产生的中和抗体水平普遍高于其他毒株；各组二价疫苗的整体效果均好于单价疫苗，其中原型株+Omicron组(实施例25)产生的中和抗体整体上最高，表明各组疫苗对不同的毒株均能起到一定的免疫效果，以原型株+Omicron较为突出，特别是针对传染性极强的Omicron株具有一定的应用潜力。
表13 BALB/c小鼠中重组新冠疫苗候选抗原实验设计概况
表14 BALB/c小鼠中重组新冠疫苗候选抗原的筛选结果
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (26)

1.一种免疫原性组合物，其特征在于，包含第一组分，所述第一组分包含至少一种新型冠状病毒毒株刺突蛋白(S蛋白)的受体结合结构域(RBD)或其功能活性片段；以及第二组分，所述第二组分包含至少一种新型冠状病毒毒株刺突蛋白的N端结构域(NTD)或其功能活性片段。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述新型冠状病毒毒株选自以下毒株：原型株、阿尔法(Alpha)株、贝塔(Beta)株、伽马(Gamma)株、德尔塔(Delta)株、拉姆达(Lambda)株、缪(Mu)株和奥密克戎(Omicron)株。
3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述奥密克戎(Omicron)株包括BA.1、BA.2、BA.3、BA.4以及BA.5变异株。
4.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述第一组分包含2～4种新型冠状病毒毒株刺突蛋白的RBD或其功能活性片段；所述第二组分包含2～4种新型冠状病毒毒株刺突蛋白的NTD或其功能活性片段。
5.根据权利要求4所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述第一组分包含的每种RBD或其功能活性片段与所述第二组分包含的每种NTD或其功能活性片段源自相同的新型冠状病毒毒株。
6.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其特征在于，原型株RBD的氨基酸序列为SEQID NO:1，贝塔(Beta)株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，伽马(Gamma)株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，德尔塔(Delta)株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，奥密克戎(Omicron)BA.1株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，BA.2变异株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，BA.3变异株RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，BA.4和BA.5变异株RBD的氨基酸序列为SEQID NO:8。
7.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其特征在于，原型株NTD的氨基酸序列为SEQID NO:9，贝塔(Beta)株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:10，伽马(Gamma)株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:11，德尔塔(Delta)株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:12，奥密克戎(Omicron)BA.1株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:13，BA.2变异株NTD的氨基酸序列为SEQID NO:14，BA.3变异株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:15，BA.4和BA.5变异株NTD的氨基酸序列为SEQ ID NO:16。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述第一组分中的RBD或其功能活性片段还连接有以下多肽中的至少一种：P2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(HBsAg)或其功能活性片段。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述第二组分中的NTD或其功能活性片段还连接有以下多肽中的至少一种：P2或其功能活性片段，foldon结构域或其功能活性片段，铁蛋白或其功能活性片段，以及乙肝表面抗原(HBsAg)或其功能活性片段。
10.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述多肽与所述RBD或其功能性片段直接或间接地相连，所述多肽与所述NTD或其功能性片段直接或间接地相连。
11.根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述多肽与所述RBD或其功能性片段在框内融合，所述多肽与所述NTD或其功能性片段在框内融合。
12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述P2或其功能活性片段包含破伤风毒素的表位肽。
13.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述foldon结构域或其功能活性片段包含噬菌体T4纤维蛋白C末端的氨基酸残基。
14.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述铁蛋白包含粉纹夜蛾铁蛋白或幽门螺杆菌铁蛋白。
15.根据权利要求12～14中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述P2或其功能活性片段包含SEQ ID NO:17～19中任一项所示的氨基酸序列；所述foldon结构域或其功能活性片段包含SEQ ID NO:20～22中任一项所示的氨基酸序列；所述粉纹夜蛾铁蛋白包括重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；所述幽门螺杆菌铁蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；所述乙肝表面抗原或其功能活性片段包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求10～15中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述直接或间接相连包含通过连接子相连。
17.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述连接子包含刚性接头、柔性接头或其他序列。
18.根据权利要求17所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述连接子包含SEQ ID NO:27～28中任一项所示的氨基酸序列。
19.根据权利要求1～18中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述第一组分和所述第二组分的重量比为(1-15)：(1-15)，优选为1:1。
20.根据权利要求19所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述第一组分中，任意两种RBD或其功能活性片段的重量比为(1-5)：(1-5)，优选为1:1。
21.根据权利要求19所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述第二组分中，任意两种NTD或其功能活性片段的重量比为(1-5)：(1-5)，优选为1:1。
22.药物组合物，其包含权利要求1-21中任一项所述的免疫原性组合物，及任选地药学上可接受的赋形剂。
23.权利要求1-21中任一项所述的免疫原性组合物，或权利要求22所述的药物组合物，在制备疫苗中的用途。
24.根据权利要求23所述的用途，其中所述疫苗用于预防和/或治疗COVID-19。
25.一种制备COVID-19亚单位疫苗的方法，其包括：
1)提供权利要求1-21中任一项所述的免疫原性组合物或权利要求22所述的药物组合物；以及
2)使1)中所述的免疫原性组合物或药物组合物与药学上可接受的佐剂混合。
26.一种根据权利要求25所述的方法制备的COVID-19亚单位疫苗。
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