CN111303255B - 一种covid-19-s-rbd病毒样颗粒、疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种covid-19-s-rbd病毒样颗粒、疫苗及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111303255B
CN111303255B CN202010170188.XA CN202010170188A CN111303255B CN 111303255 B CN111303255 B CN 111303255B CN 202010170188 A CN202010170188 A CN 202010170188A CN 111303255 B CN111303255 B CN 111303255B
Authority
CN
China
Prior art keywords
covid
rbd
plasmid
virus
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010170188.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN111303255A (zh
Inventor
查丽莎
马丁·巴赫曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Hertz Life Science Technology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Hertz Life Science Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Hertz Life Science Technology Co ltd filed Critical Shenzhen Hertz Life Science Technology Co ltd
Priority to CN202010170188.XA priority Critical patent/CN111303255B/zh
Publication of CN111303255A publication Critical patent/CN111303255A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111303255B publication Critical patent/CN111303255B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

一种COVID‑19‑S‑RBD病毒样颗粒、疫苗及其制备方法，用CuMVTT基因与pET28a质粒连接后构建pET28a‑CuMVTT重组质粒，用COVID‑19‑S‑RBD基因与pFUSE质粒构建pFUSE‑COVID‑19‑S‑RBD重组质粒；重组质粒分别转入大肠杆菌表达菌株和293F细胞表达细胞株，培养大肠杆菌表达株，离心分离生物质，获得病毒样颗粒，培养293F细胞重组表达细胞株获得COVID‑19‑S‑RBD蛋白；病毒样颗粒与COVID‑19‑S‑RBD通过化学偶联试剂SMPH偶联。本发明易于通过菌体培养获得，比嵌合表达产量高，便于工业生产，免疫快。

Description

一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒、疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒、疫苗及其制备方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
2019新型冠状病毒(COVID-19)的症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。该病毒已确认存在人传人现象，且潜伏期具有传染性，所致疾病没有特异治疗方法。但是不同形式的疫苗正在研发，新闻报道的比如2020年2月25日，专注于mRNA药物和疫苗研发的临床阶段的生物技术公司Moderna宣布，已经生产了第一批供人体试验使用的新型冠状病毒的疫苗mRNA-1273。还有2020年2月25日天津大生命科学学院黄金海教授团队宣布已经研发出新型冠状病毒口服疫苗，该疫苗以食品级安全酿酒酵母为载体，以新型冠状病毒S蛋白为靶点产生抗体。目前科研团队正在寻求合作方，希望能推动疫苗早日走向临床，为疫情防控发挥作用。
病毒样颗粒(Virus Like Particle，VLP)疫苗的发展为如何研发既保持构象表位并且无毒力回复风险的疫苗提供了一种新的研究策略。VLP疫苗是通过分子生物学技术，表达病毒一个或多个结构蛋白，这些结构蛋白天然的自装配能力，可形成与真正病毒颗粒相同或相似的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，没有感染性，不存在灭活不完全或毒力回复的风险，并且表面有高密度的病毒抗原，保持了构象表位，可通过和全病毒疫苗一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。
cVLP通过基因融合表达或以VLP为载体通过化学偶联的方法将外源抗原与其偶联制备而成，后一种方法制备的重组VLP也常被称作偶联VLP。
融合表达的方法如下，在制备无包膜VLP的基础上，将外源抗原DNA与具有自我组装能力的多肽基因融合，进一步制备无包膜cVLP；类似于有包膜VLP的制备方法，将不同种(型)的病毒蛋白或嵌合蛋白组合，形成cVLP(包膜型或无包膜型)。但是嵌合疫苗产量比较低，生产成本比较高，且在大规模生产时，易导致产品结构和组分上不相容，限制了其在疫苗中的发展。
化学偶联方法是依靠模块化系统，分别合成VLP和靶抗原，在体外以共价键或非共价键结合的形式，将抗原与预装配的VLP相连。其优势在于靶抗原的大小和结构不受VLP单体折叠和颗粒组装等条件的限制，可以在VLP表面展示短线性肽、肽环和全长蛋白，甚至多糖和半抗原等非蛋白形式的抗原。瑞士Cytos生物制药公司将尼古丁共价偶联与噬菌体QβVLP表面，制备戒烟疫苗，Ⅰ/Ⅱ期临床评估结果表明，尼古丁-QβcVLP可以诱导高滴度尼古丁特异性抗体。并且单独的病毒样颗粒可以在大肠杆菌中稳定表达，提高了产量的同时降低了成本。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒、疫苗及其制备方法，易于通过菌体培养获得，连接效率高，比嵌合表达产量高，便于工业化生产,免疫反应快。
本发明的第一个目的在于提供一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连接后形成的pET28a-CuMVTT重组质粒通过表达菌株表达获得。
作为COVID-19-S-RBD病毒样颗粒的优选方案，所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒均采用HindⅢ内切酶和BamHⅠ内切酶双酶切后，再用T4DNA连接酶将CuMVTT和pET28a质粒双酶切产物连接得到pET28a-CuMVTT重组质粒。
作为COVID-19-S-RBD病毒样颗粒的优选方案，所述表达菌株采用大肠杆菌T7Shuffle表达菌株。用50ug/ml浓度的卡那霉素筛选得到pET28a-CuMVTT T7 Shuffle重组表达菌株。
本发明通过构建并培养能够表达CuMVTT病毒样颗粒的大肠杆菌重组表达菌株，成功的获得了一种易于通过菌体培养获得，适合工业化生产，且便于纯化的CuMVTT病毒样颗粒。
作为COVID-19-S-RBD病毒样颗粒的优选方案，所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因以CuMVTT病毒核苷酸序列反推为密码子序列获得。
本发明的第二个目的在于提供一种COVID-19-S-RBD疫苗，包括上述的CuMVTT病毒样颗粒，还包括由COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接后形成的pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒通过表达细胞株表达的COVID-19-S-RBD蛋白。
所述CuMVTT病毒样颗粒和所述COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试剂SMPH偶联后混合弗氏完全佐剂获得COVID-19-S-RBD疫苗。
本发明通过一定浓度的CuMVTT病毒样颗粒与一定量的COVID-2019-S-RBD蛋白在特定条件下通过化学偶联试剂SMPH偶联成COVID-2019-S-RBD-CuMVTT，适合工业化生产，且便于纯化。
作为COVID-19-S-RBD疫苗的优选方案，所述表达细胞株采用293F表达细胞株，所述pFUSE-COVID-2019-S-RBD重组质粒转入293F表达细胞株后获得pFUSE-COVID-2019-S-RBD重组表达细胞株。本发明通过构建并培养能够表达COVID-2019-S-RBD蛋白的293F细胞重组表达细胞株，成功的获得了一种易于通过哺乳细胞培养获得，适合工业化生产，且便于纯化COVID-2019-S-RBD蛋白。
作为COVID-19-S-RBD疫苗的优选方案，所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒是将COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒均用EcoRⅠ内切酶和BgⅢ内切酶分步双酶切后，用T4DNA连接酶将COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒双酶切产物连接得到。
本发明的第三个目的在于提供一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒制备方法，包括以下步骤：
(11)重组质粒的构建：用黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连接后构建pET28a-CuMVTT重组质粒；
(12)重组质粒转入表达菌株：将所述pET28a-CuMVTT重组质粒转入大肠杆菌T7Shuffle表达菌株，得到pET28a-CuMVTT重组表达菌株；
(13)菌体培养及CuMVTT病毒样颗粒纯化：培养所述pET28a-CuMVTT重组表达菌株，离心分离生物质获得CuMVTT病毒样颗粒。
作为COVID-19-S-RBD病毒样颗粒制备方法的优选方案，CuMVTT病毒样颗粒纯化是将大肠杆菌重组表达菌株培养菌液离心10min，取沉淀，然后向沉淀物中加入适量的裂解液，再离心12min，取上清，上清液经1％Triton X-100、4％PEG8000沉淀、30％蔗糖，超速离心获得CuMVTT病毒样颗粒。
本发明的第四个目的在于提供一种COVID-19-S-RBD疫苗制备方法，包括以下步骤：
(21)重组质粒的构建：采用COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接后构建pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒；
(22)重组质粒转入表达细胞株：将所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转入293F表达细胞株，得到pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株；
(23)细胞培养及COVID-19-S-RBD蛋白纯化：培养所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株，离心分离上清液，所述上清液经镍柱纯化后，获得COVID-19-S-RBD蛋白；
(24)制备疫苗：将CuMVTT病毒样颗粒与COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试剂SMPH偶联制备为COVID-19-S-RBD-CuMVTT，将所述COVID-19-S-RBD-CuMVTT经过脱盐柱纯化后再与等体积弗氏完全佐剂相混合制成COVID-19-S-RBD疫苗。
作为COVID-19-S-RBD疫苗制备方法的优选方案，步骤(2)中，将所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转化到细菌DH5α感受态细胞中，然后使用PEI将提取的质粒转染到293F细胞中，再用博来霉素筛选得到pFUSE-COVID-19-S-RBD 293F重组表达细胞株。
作为COVID-19-S-RBD疫苗制备方法的优选方案，使用PEI(Invitrogen)将提取的质粒以3×106细胞/ml的密度转染到293F细胞中。用100ug/ml的博来霉素筛选得到pFUSE-COVID-19-S-RBD 293F重组表达细胞株。
作为COVID-19-S-RBD疫苗制备方法的优选方案，将所述COVID-19-S-RBD蛋白采用ACE2蛋白包被进行活性检测。
作为COVID-19-S-RBD疫苗制备方法的优选方案，COVID-19-S-RBD蛋白纯化是将重组表达293F细胞株5％CO2、37℃培养96小时后，4500rpm/min离心10分钟，收集含有分泌的COVID-19-S-RBD蛋白的细胞培养物的上清液，采用镍柱进行纯化即PBS洗涤20个柱体积，35nM咪唑洗涤10个柱体积，50mM咪唑洗涤10个柱体积，100mM咪唑洗脱10个柱体积，250mM咪唑洗脱10个柱体积，获得高纯度的COVID-19-S-RBD蛋白。
本发明的有益效果如下：
第一、黄瓜花叶病毒(CMV，家族，Bromoviridae，属，Cucumovirus)是一种线性正等径等径植物病毒，具有广泛的宿主范围，且是申请人的VLP筛选平台独有的技术。
第二、使用在这些VLP上展示的抗原，可以在小鼠，大鼠，猫，狗和马中诱导高水平的特异性抗体，免疫反应快。
第三、表达本发明CMV病毒样颗粒的大肠杆菌重组表达菌株易于筛选得到：重组转化子具有卡那霉素抗性标记基因，可以直接直接用卡那霉素进行筛选，大大简化了重组转化大肠杆菌的筛选过程。
第四、本发明的COVID-19-S-RBD蛋白适于制备疫苗：本发明选择的293F细胞重组表达细胞株具有真核表达的环境，能克服大肠杆菌表达蛋白因为没有特殊辅助因子、分子伴侣和翻译后修饰可能会使蛋白丧失功能，引起蛋白错误折叠的问题，而这些因素都会破坏真核系统多亚基复合物，表面受体和分泌蛋白的蛋白与蛋白之间的相互作用。293F细胞是从HEK293细胞中分离出的一种适应于悬浮细胞培养的细胞。用价格便宜的分支型PEI配制的试剂瞬时转染细胞通过胞吞作用进行表达。这种方法适用于小规模30ml和大规模300ml的细胞转染，可以获得高产量的纯化蛋白。
第五、适用于产业化：本发明选择的大肠杆菌重组表达菌株具有生长快、易于培养、遗传操作简单、繁殖速度快，对培养条件要求低，培养基廉价，能进行高密度培养，且能耐受较高的液体静压，便于工业化生产等特点。
第六、CuMVTT病毒样颗粒与COVID-19-S-RBD蛋白体外连接，条件便于控制，连接效率高，比嵌合表达产量高，易于操作，便于工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例中提供的COVID-19-S-RBD蛋白与CuMVTT病毒样颗粒(VLP)的偶联示意图；
图2为本发明实施例中提供的COVID-19-S-RBD蛋白与ACE2的活性检测图；
图3为本发明实施例中提供的小鼠免疫血清总IgG含量；
图4为本发明实施例中提供的COVID-19-S-RBD疫苗免疫接种诱导阻断COVID-19-S-RBD蛋白与ACE2结合的抗体；
图5为本发明实施例中提供的血清中和试验示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例中所采用的酶切、连接等分子生物学实验方法可参考《分子克隆》第二版。制备本发明CuMVTT病毒样颗粒的基础材料包括：CuMVTT蛋白核苷酸序列、pET28a质粒、T7Shuffle大肠杆菌菌株和天根质粒小提中量试剂盒。将核苷酸序列发到基因公司合成pET28a-CuMVTT重组质粒。
实施例1
提供一种COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连接后形成的pET28a-CuMVTT重组质粒通过表达菌株表达获得。
具体的，所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒均采用HindⅢ内切酶和BamHⅠ内切酶双酶切后，再用T4 DNA连接酶将CuMVTT和pET28a质粒双酶切产物连接得到pET28a-CuMVTT重组质粒。所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因以CuMVTT病毒核苷酸序列反推为密码子序列获得。所述表达菌株采用大肠杆菌T7 Shuffle表达菌株。用50ug/ml浓度的卡那霉素筛选得到pET28a-CuMVTT T7 Shuffle重组表达菌株。
上述COVID-19-S-RBD病毒样颗粒制备方法，包括以下步骤：
(11)重组质粒的构建：用黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连接后构建pET28a-CuMVTT重组质粒；
(12)重组质粒转入表达菌株：将所述pET28a-CuMVTT重组质粒转入大肠杆菌T7Shuffle表达菌株，得到pET28a-CuMVTT重组表达菌株；
(13)菌体培养及CMV病毒样颗粒纯化：培养所述pET28a-CuMVTT重组表达菌株，离心分离生物质获得CuMVTT病毒样颗粒。
具体的，质粒测序与提取的步骤如下：
(a1)将含有质粒的甘油菌用移液枪吸取5ul接种到5mL的2YT培养基(含50ug/ml卡那霉素)，37℃震荡培养14-16小时，做一个平行(平行送去测序公司进行测序)；
(a2)其中一支室温下10000xg离心1min，收集菌体，并尽可能的吸去上清；
(a3)加入250μl Buffer A1(确保已加入Rnase A)，用移液枪或涡流震荡充分悬浮细菌细胞；
(a4)加入250μl Buffer B1,轻轻地反转5-10次以混合均匀，然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清；
(a5)加入350μl Buffer N1,立即反转多次，至溶液充分混匀，此时出现白色絮状沉淀；
(a6)将离心管转至高速离心机，在室温下13000rpm离心10min(若上清中有白色沉淀，可再次离心)；
(a7)向离心柱中加入500ulDNA Wash Buffer(确保已加入无水乙醇)，室温下，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将离心柱重新放回到收集管中；
(a8)将离心柱放回高速离心机中，13000rpm室温下开盖离心2min，以彻底去除残留的乙醇；
(a9)将离心柱转至一个新的1.5ml离心管中，向DNA柱的正中间加入50～100μl(体积>50μl)的ddH2O(pH在7.0-8.5之间)或Elution Buffer，室温放置2min，13000rpm离心1min，洗脱质粒DNA。
测序反馈结果是正确的。
具体的，大肠杆菌感受态T7Shuffle的制备步骤如下：
(b1)将冰箱的菌株融化后在2YT固体培养基生划线培养一晚上；
(b2)挑取生长良好的单菌落接种到含有5ml 2YT液体培养基的三角瓶内培养过夜；
(b3)将1ml菌液接种到含100ml 2YT液体培养基的三角瓶内摇床培养(37℃、225rpm/min)，通常此时菌液的浓度大约是OD＝0.1，半个小时后测下OD值，此后每隔20min测下OD值，当OD值在0.6～0.8时最好；
(b4)将摇好的菌放入盛有冰的盆里，并将盆放在4℃冰箱30min(至少15min以上)；
(b5)将50ml离心管提前放在冰里预冷，将菌液在4℃冰箱内倒入离心管，之后在提前预冷的超低温离心机里离心，条件是4500rpm/min离心5min；
(b6)将提前预冷的CaCl2溶液没管倒入30-40ml，用移液枪轻轻吹起菌体再离心，条件是4500rpm/min离心5min，弃掉上清；
(b7)步骤同(b6)再洗涤一次，过程中将菌体合并成1管；
(b8)加入20％甘油3-4ml，轻轻将菌体吹散，分装到提前预冷的1.5ml离心管中，每管100ul，放入-80℃冰箱保存。
具体的，转化T7Shuffle感受态细胞的步骤如下：
(c1)取出4管T7Shuffle感受态放冰上融化5min；
(c2)将提取的质粒各取5ul加入到感受态细胞中冰浴30min；
(c3)42℃水浴锅内热击1min；
(c4)拿出放冰上冰浴5min；
(c5)加入900ul2YT液体培养基培养1h(37℃、225rpm/min)；
(c6)分别取100μl涂板(含卡那抗性)。
具体的，2YT培养基配制步骤如下：
(d1)添加16g Bacto胰蛋白；
(d2)添加10g Bacto酵母提取物；
(d3)添加5g NaCl；
(d4)用5M NaOH将pH调节至7.0；
(d5)用蒸馏水调节至1L；
(d6)或使用预混合的粉末,通过高压灭菌；
具体的，pET28a-CuMVTT重组表达菌株诱导表达的步骤如下：
(e1)挑选单菌落放入50ml培养基(卡那霉素50mg/L)，培养4h；
(e2)将50ml菌液加入到800ml培养基(卡那霉素50mg/L)，在30℃，200rpm振荡下培养，直到OD(600)＝0.8；
(e3)添加0.2mM IPTG,培养25℃，24h，200rpm/min摇动；
(e4)收集生物质10min，4500rpm/min。
具体的，CuMVTT病毒样颗粒纯化的步骤如下：
(f1)将获得的生物质放在冰上解冻；
(f2)向解冻的沉淀物中加入10ml裂解液含50mM柠檬酸盐，，5mM EDTA(100mM储备液)，5mM ME，pH 9.0，超声处理16min；
(f3)离心12min，11000rpm/min；
(f4)配制10ml裂解液：50mM柠檬酸盐，5mM EDTA，5mM Et-SH，pH 9.0；
(f5)将(f4)中溶液稀释至40ml：加入1％Triton X-100；0.5M氯化钠；
(f6)离心12min(15000xg)取上清液中的VLP；
(f7)将VLP溶于1％TritonX-100，0.5M NaCl，5mM硼酸钠缓冲液，2mM EDTA，pH9.0；
(f8)向VLP中添加4％PEG 8000；在4℃的旋转器上孵育2小时，离心取VLP沉淀；
(f9)通过离心(12min，15000xg)收集沉淀物
(f10)将沉淀溶于10ml裂解液中，让沉淀在4℃下在旋转器上溶解；；
(f11)加入3体积的硫酸铵，在旋转器上于4℃孵育3小时；
(f12)离心12min，20000xg，沉淀中含有VLP，将沉淀溶解在10ml NaP缓冲液；
(f13)在8000MWCO中以2000ml 5mM NaP，2mM EDTA，pH7.5进行透析，在4℃下过夜透析；
(f14)24小时再置换缓冲液在4℃下进行另一轮3-4小时的透析；
(f15)从透析中收集；
(f16)离心(12min，15000xg)，收集含有上清液的VLP；
(f17)用Amicon浓缩至3mg/ml使用0.2μm过滤器过滤；
(f18)取装有无菌缓冲液的超速离心管：30％蔗糖，1xPBS，1％Tx-100轻轻移液，将样品小心地覆盖在蔗糖垫上。将VLP放在冰上,将试管超速离心：50000rpm/min，4小时；
(f19)弃清液将每管沉淀重悬于15ml无菌硼酸盐缓冲液中；
(f20)步骤同(f18)；
(f21)弃上清液向每管沉淀添加3ml无菌缓冲液：5mM NaP，2mM EDTA，pH7.5。
实施例2
提供一种COVID-19-S-RBD疫苗，包括上述的COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，还包括由COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接后形成的pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒通过表达细胞株表达的COVID-19-S-RBD蛋白；所述CuMVTT病毒样颗粒和所述COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试剂SMPH偶联成COVID-19-S-RBD-CuMVTT后混合弗氏完全佐剂获得COVID-19-S-RBD疫苗。
具体的，所述表达细胞株采用293F表达细胞株，所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转入293F表达细胞株后获得pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株。
上述COVID-19-S-RBD疫苗制备方法，包括以下步骤：
(21)重组质粒的构建：采用COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接后构建pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒；
(22)重组质粒转入表达细胞株：将所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转入293F表达细胞株，得到pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株；
(23)细胞培养及COVID-19-S-RBD蛋白纯化：培养所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株，离心分离上清液，所述上清液经镍柱纯化后，获得COVID-19-S-RBD蛋白；
(24)制备疫苗：将CuMVTT病毒样颗粒与COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试剂SMPH偶联制备为COVID-19-S-RBD-CuMVTT，将所述COVID-19-S-RBD-CuMVTT经过脱盐柱纯化后再与等体积弗氏完全佐剂相混合制成COVID-19-S-RBD疫苗。
具体的，步骤(22)中，将所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转化到细菌DH5α感受态细胞中，然后使用PEI将提取的质粒转染到293F细胞中，再用博来霉素筛选得到pFUSE-COVID-19-S-RBD 293F重组表达细胞株。将所述COVID-19-S-RBD蛋白采用ACE2蛋白包被进行活性检测。
本发明实施例中制备COVID-19-S-RBD蛋白的基础材料包括：
COVID-19-S-RBD蛋白CDS序列、pFUSE质粒、PEI转染试剂、天根质粒小提中量试剂盒和293F细胞。将COVID-19-S-RBD蛋白CDS序列发到基因公司合成pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒。质粒测序与提取的步骤同上。
具体的，对处于对数生长期的293F细胞进行取样计数，确定细胞量足够以及活率高于95％以上进行瞬转，将提取的质粒转染到293F细胞中步骤如下：
(g1)在瞬时转染前一天对细胞进行全离心换液；
(g2)根据实验需求收集一定量的细胞悬液，1000rpm室温离心5min；
(g3)用含0.1％F68的RPMI1640轻轻重悬细胞至一定细胞密度；
(g4)取1.5ml无菌EP管，根据需要添加一定浓度的质粒，待其充分混合后，加入到一定量的PEI中，混匀静置5min；
(g5)将DNA/PEI复合物加入细胞悬液中，使DNA/PEI复合物和细胞充分混匀；
(g6)放入摇床中37℃，180rpm/min悬浮培养3h后，加入EX-CELL293无血清培养基继续培养；
(g7)每天收样，检测细胞密度及活率，待细胞活率低于50％停止收样。
具体的，收集的细胞培养液1000rpm/min室温离心5min，收集上清，用ELISA法检测COVID-19-S-RBD浓度，COVID-19-S-RBD蛋白浓度测定步骤如下：
(h1)包被：将包被液用ACE2蛋白按1:1000比例稀释，100μl/孔，4℃冰箱包被过夜；
(h2)扣干包被液，PBST每次300μl，每次3min，洗1次；
(h3)加样：用样品稀释液将ACE2标准品稀释至浓度梯度：6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5625ng/ml、0.78125ng/ml、0.39063ng/ml、0.19531ng/ml、0.09766ng/ml。用样品稀释液将样品稀释到适宜浓度。每孔加样100μl，设置3复孔，37℃孵育1h；
(h4)洗板：扣干样品液，PBST每次300μl，每次3min，洗3次；
(h5)用二抗稀释液将抗His标签抗体按1:1000比例稀释，100μl/孔，37℃放置1h；
(h6)洗板：扣干二抗，PBST每次300μl，每次3min，洗5次；
(h7)显色：显色液100μl/孔加入板中，37℃避光显色15min；
(h8)终止：3mol/l NaOH 100μl/孔加入板中，终止显色；
(h9)用酶标仪进行405nm波长检测；
(h10)结果计算与分析：
用OD405nm的吸光值对标准品浓度做曲线，得到曲线方程：y＝ax+b(y为IgG浓度，x为OD405时的吸光值)，根据标准曲线，拟合求出a和b的值，将待测样品的吸光值代入公式中，再乘以稀释倍数，得到COVID-19-S-RBD浓度。
具体的，COVID-19-S-RBD蛋白纯化步骤如下：
(i1)将收获的细胞培养液4000rpm/min室温离心20min，取上清，用0.45μm滤膜过滤；
(i2)用10个柱体积超纯水冲洗柱子，然后用20个柱体积的PBS平衡柱子；
(i3)上样(可重复两次)；
(i4)35nM咪唑洗涤10个柱体积；
(i5)50mM咪唑洗涤10个柱体积；
(i6)100mM咪唑洗脱10个柱体积；
(i7)250mM咪唑洗脱10个柱体积；
将上述(i4)至(i7)步骤流传液各取10ul，跑SDS-PAGE蛋白胶，用于检测蛋白大小及纯度如图2；
浓缩含有蛋白的咪唑溶液获得高纯度的COVID-19-S-RBD蛋白。
具体的，将CuMVTT病毒样颗粒与COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试剂SMPH偶联制备为COVID-19-S-RBD-CuMVTT，步骤如下：
(j1)偶联物质用量计算
CuMVTT用量：分子量24.5kD，即24.5mg/ml＝1mM；
SMPH用量：分子量378.4g/mol，配制10mg/ml，；
COVID-19-S-RBD用量：分子量58kD，即58mg/ml＝1mM；
TCEP用量：分子量286.65g/mol；
(j2)将CuMVTT与SMPH混合，置于25℃摇床，200rpm，孵育25min，反应结束后使用除盐柱脱去副反应产物，取样10μl用于SDS-PAGE鉴定；
(j3)将COVID-19-S-RBD与TCEP混合，置于25℃摇床，200rpm/min，孵育25min，反应结束后使用除盐柱脱去副反应产物，取样10μl用于SDS-PAGE鉴定；
(j4)将除盐后的CuMVTT+SMPH与COVID-19-S-RBD+TCEP进行混合，置于25℃，200rpm/min，孵育3小时，取样10μl用于SDS-PAGE鉴定，将待鉴定的样品点入SDS-PAGE电泳胶，检查偶联效果。
参见图1，a1示意是疫苗设计策略概述；b1为通过ELISA证实了COVID-19-S-RBD与ACE2的重组表达和结合；c1和d1为COVID-19-S-RBD通过SATA和SMPH化学交联剂显示在VLP的表面上，产生了一条偶联带(150kd)，如c1中的SDS-PAGE和d1中的蛋白质印迹。
实施例3
1.1免疫原制备
将上述COVID-19-S-RBD-CuMVTT按照50ug/只小鼠的注射量与弗氏完全佐剂1:1乳化成疫苗，对照组有两组分别是注射COVID-19-S-RBD、PBS，都是跟弗氏完全佐剂1:1乳化成疫苗。
1.2小鼠免疫
6周龄的BALB/c小鼠购自北京生命河实验动物技术有限公司，并保存在安徽农业大学的动物设施中。所有动物实验均按照国家动物保护指南进行，并得到中国实验动物科学协会的批准。
通过皮下注射50μgCOVID-19-S-RBD-CuMVTT或COVID-19-S-RBD(PBS作为对照)免疫六周大的新生BALB/c小鼠(每组3只)。在第2周和第3周加强免疫接种。每次接种后1周收集血清用于ELISA分析。参见图3，为小鼠免疫血清总IgG含量。具体情况如表1。
表1BALB/c小鼠分组处理情况
Figure GDA0002466722540000161
1.3免疫应答结果检测(EL1SA)
ELISA实验用于检测免疫动物血清总IgG抗体及鉴定IgG抗体亚型。具体操作如下:
(k1)包被:96孔EL1SA平板预先包被重组蛋白COVID-19-S-RBD,100ng/孔,体积为100μl,置于4℃过夜；
(k2)封闭:弃去包被撤用含有0.05％吐温20的PBS(PBST)洗板3次,2min/次。加入封闭液(10％小牛血清),200μl/孔,置于37℃静止2h；
(k3)一抗:弃去封闭液,用PBST洗板3次,2min/次。加入系列稀释的待检血清,同时设正常动物血清对照和空白对照,100μl/孔,置于37℃静止1小时；
(k4)二抗:弃去血清,用PBST洗板5次,2min/次。分别加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:5000，Sigma)，置于37℃静止1h；
(k5)显色:弃去酶标二抗,用PBST洗板5次,2min/次。加入底物3,3＇，5,5＇-四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine,TMB)显色5min后,用2M H2SO4终止反应；
(k6)分析:酶标仪测量450nm处吸光值(optical density,OD)。当待捡血清OD值大于或等于正常小鼠血清OD值的2.1倍定义为阳性。
参见图2，A)为ACE2包板子，S-RBD结合，抗人Fc二抗显色；B)为S-RBD包板子，ACE2结合，抗His二抗显色。
1.4伪病毒的产生
表达COVID-19-S蛋白的伪病毒是由慢病毒第二代包装系统产生的。使用Sinfection(Sino Biological)将含有COVID-19-S基因的pwpx1-luc，HIV-1PSD和pCMV3质粒共转染到7x105 293F细胞中。过夜孵育后，将培养基换成含有10％FBS的新鲜DMEM。转染后48h和72h小时收集含有假病毒的上清液，并使用0.45μm滤器进行过滤。收集所有过滤的上清液，并保存在-80℃下直至使用。
1.5滴定假病毒
通过使用慢病毒系统将ACE2基因转染到293T细胞中来制备在细胞膜上稳定表达ACE2受体的293T-ACE2细胞。将上面制备的伪病毒与100μl聚乙烯(16μg/ml)加入293T-ACE2细胞(3×104细胞/孔)。48小时后，使用荧光素酶测定系统(Promega)监测感染。滴度是根据假病毒的系列稀释度计算的。
1.6中和抗体测定
将小鼠血清样品(2μl)分别稀释至1：10、1：40、1：160、1：640和1：2560，然后与等体积的假病毒原液混合。在37℃下孵育1小时后，将混合物接种到293T-ACE2细胞上(3x 104细胞/孔)。同时，将伪病毒+DMEM培养基设置为阳性对照，仅将DMEM培养基设置为阴性对照。将细胞温育72小时后，通过感染的假病毒的荧光素酶活性测量血清中和。临界值>80％用于确定中和效价。
采用本发明的COVID-19-S-RBD-CuMVTT诱导高特异性抗体滴度。在第0、7和14天，用10μg在Montanide中配制的RBD-CuMVTT，单独的RBD或单独的CuMVTT对小鼠(每组3只)进行免疫，在第7、14和21天收获血清，并通过ELISA在重组COVID-19-S-RBD上进行测试。在用COVID-19-S-RBD-CuMVTT免疫1周后可以观察到强烈的抗体反应。
参见图4，用COVID-19-S-RBD-CuMVTT免疫接种诱导阻断COVID-19-S-RBD与ACE2结合的抗体。第三次疫苗接种后，将小鼠血清(1:40稀释度，d21)与COVID-19-S-RBD孵育，然后置于ACE2包被的板上，通过ELISA确定RBD结合。
参见图5，使用第二代慢病毒包装系统，将表达萤光素酶的HIV假颗粒质粒共转染到HEK 293T细胞中，从而产生表达COVID-19-S-RBD蛋白的假病毒。图5中a2、b2为测定原理示意图,c2为表达COVID-19-S-RBD蛋白的伪病毒可以通过ACE2受体感染细胞，COVID-19-S-RBD-CuMVTT(day21)诱导的抗体可以有效地中和该病毒。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.一种COVID-19-S-RBD疫苗，其特征在于，包括COVID-19-S-RBD病毒样颗粒，还包括由COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接后形成的pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒通过表达细胞株表达的COVID-19-S-RBD蛋白；
所述病毒样颗粒由黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒连接后形成的pET28a-CuMVTT重组质粒通过表达菌株表达获得；
所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因与pET28a质粒均采用HindⅢ内切酶和BamH Ⅰ内切酶双酶切后，再用T4 DNA连接酶将CuMVTT基因和pET28a质粒双酶切产物连接得到pET28a-CuMVTT重组质粒；
所述表达菌株采用大肠杆菌T7 Shuffle表达菌株；
所述黄瓜花叶病毒CuMVTT基因以CuMVTT病毒核苷酸序列反推为密码子序列获得；
所述CuMVTT病毒样颗粒和所述COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试剂SMPH偶联后混合弗氏完全佐剂获得COVID-19-S-RBD疫苗；
所述表达细胞株采用293F表达细胞株，所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转入293F表达细胞株后获得pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株。
2.根据权利要求1所述的一种COVID-19-S-RBD疫苗制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)重组质粒的构建：采用COVID-19-S-RBD基因与pFUSE质粒连接后构建pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒；
(2)重组质粒转入表达细胞株：将所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转入293F表达细胞株，得到pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株；
(3)细胞培养及COVID-19-S-RBD蛋白纯化：培养所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组表达细胞株，离心分离上清液，所述上清液经镍柱纯化后，获得COVID-19-S-RBD蛋白；
(4)制备疫苗：将CuMVTT病毒样颗粒与COVID-19-S-RBD蛋白通过化学偶联试剂SMPH偶联制备为COVID-19-S-RBD-CuMVTT，将所述COVID-19-S-RBD-CuMVTT经过脱盐柱纯化后再与等体积弗氏完全佐剂相混合制成COVID-19-S-RBD疫苗；
步骤(2)中，将所述pFUSE-COVID-19-S-RBD重组质粒转化到细菌DH5α感受态细胞中，然后使用PEI将提取的质粒转染到293F细胞中，再用博来霉素筛选得到pFUSE-COVID-19-S-RBD 293F重组表达细胞株；
将所述COVID-19-S-RBD蛋白采用ACE2蛋白包被进行活性检测。
CN202010170188.XA 2020-03-12 2020-03-12 一种covid-19-s-rbd病毒样颗粒、疫苗及其制备方法 Active CN111303255B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010170188.XA CN111303255B (zh) 2020-03-12 2020-03-12 一种covid-19-s-rbd病毒样颗粒、疫苗及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010170188.XA CN111303255B (zh) 2020-03-12 2020-03-12 一种covid-19-s-rbd病毒样颗粒、疫苗及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111303255A CN111303255A (zh) 2020-06-19
CN111303255B true CN111303255B (zh) 2023-05-12

Family

ID=71159127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010170188.XA Active CN111303255B (zh) 2020-03-12 2020-03-12 一种covid-19-s-rbd病毒样颗粒、疫苗及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111303255B (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021243417A1 (en) * 2020-06-05 2021-12-09 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Immunogenic formulations
CN113322271A (zh) * 2020-06-24 2021-08-31 西南交通大学 基于酵母表面展示系统的covid-19亚单位疫苗
WO2021260131A1 (en) * 2020-06-25 2021-12-30 Saiba AG Virus-like particles of cmv modified by fusion
CN111676248A (zh) * 2020-07-02 2020-09-18 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 表达新型冠状病毒S基因与流感M1基因嵌合SARS-CoV-2 VLP的构建
CN113945714B (zh) * 2020-07-16 2023-01-31 南京蓬勃生物科技有限公司 新型冠状病毒中和抗体类药物中和能力的检测方法
CN111978395B (zh) * 2020-07-20 2022-06-10 四川大学 抗新型冠状病毒rbd结构域抗原的单克隆抗体
CN113975299B (zh) * 2020-07-27 2024-06-28 上海市公共卫生临床中心 利用呼吸道上皮细胞膜防治呼吸道传染病的方法及应用
US20230416309A1 (en) * 2020-10-23 2023-12-28 Jiangsu Provincial Center For Disease Control And Prevention (Public Health Research Institute Of Ji Fusion protein and application thereof
CN112724204B (zh) * 2020-12-15 2023-12-19 深圳赫兹生命科学技术有限公司 一种用于生产vlp重组疫苗的cmv病毒样颗粒及其制备方法
CN113444838A (zh) * 2021-06-23 2021-09-28 华中科技大学同济医学院附属同济医院 用于检测covid-19易感性的分子标记、试剂盒及应用
CN113502294B (zh) * 2021-07-15 2023-03-17 四川大学华西医院 新型冠状病毒rbd蛋白的制备方法以及新型冠状病毒疫苗
CN113637055B (zh) * 2021-08-15 2023-05-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原及应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003227380A1 (en) * 2003-01-05 2004-07-29 Obschestvo S Ogranichennoi Otvetstvennostiju "Genno-Inzhenernye Tekhnologii 2000" Complementation method for producing rna-containing virus-like particles of hepatotropic viruses
US20050002953A1 (en) * 2003-05-06 2005-01-06 Jens Herold SARS-coronavirus virus-like particles and methods of use
TWI607083B (zh) * 2013-01-15 2017-12-01 國立中興大學 利用假性狂犬病毒生產豬環狀病毒二型類病毒顆粒
WO2019023920A1 (zh) * 2017-08-01 2019-02-07 金普诺安生物科技（苏州）有限公司 一种口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Immunization of cats to induce neutralizingantibodies against Fel d 1, the major felineallergen in human subjects;Biologics and immunotherapy;《Biologics and immunotherapy》;20190502;第144卷(第1期);第193-203页 *
The SARS-CoV-2 Vaccine Pipeline: an Overview;Wen-Hsiang Chen等;《Current Tropical Medicine Reports》;20200303;第7卷(第2期);第61-64页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111303255A (zh) 2020-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111303255B (zh) 一种covid-19-s-rbd病毒样颗粒、疫苗及其制备方法
Krebs et al. Longitudinal analysis reveals early development of three MPER-directed neutralizing antibody lineages from an HIV-1-infected individual
CA2809780C (en) Influenza virus neutralizing antibody and method for screening same
Gray et al. Broad neutralization of human immunodeficiency virus type 1 mediated by plasma antibodies against the gp41 membrane proximal external region
CN112386684B (zh) 一种covid-19疫苗及其制备方法和应用
CN110759973B (zh) 一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用
CN108371710A (zh) 猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗及制备方法
Hicar et al. Pseudovirion particles bearing native HIV envelope trimers facilitate a novel method for generating human neutralizing monoclonal antibodies against HIV
CN110776564B (zh) 两株抗新城疫病毒纳米抗体及其表达制备方法和应用
WO2021076009A1 (en) Expression vector against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2
CN108892723B (zh) 用于检测猪流行性腹泻病毒的单域重链抗体、制备方法及应用
CN110981968A (zh) 含有狂犬病病毒g蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
CN107794244A (zh) Vero‑pAPN细胞系及其制备方法
Rubio et al. A derivative of the D5 monoclonal antibody that targets the gp41 N-heptad repeat of HIV-1 with broad tier-2-neutralizing activity
CN110257339A (zh) 表达抗新城疫病毒融合蛋白的细胞系及其构建方法和应用
CN113604507A (zh) 靶向胃癌细胞特异性高表达蛋白msln的car载体及其构建方法和应用
Boliar et al. An efficiently cleaved HIV-1 clade C Env selectively binds to neutralizing antibodies
EP4010018A1 (en) Expression vector against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2
US11767356B1 (en) Canine parvovirus nanobody CPV-VHH-E3 and application thereof
CN114478755B (zh) 抗新型冠状病毒的全人源抗体及其组合物与应用
NO885658L (no) Retrovirusekspresjonsvektorer og fremgangsmaater for fremstilling av hbv-antigener.
Nishiyama et al. CD4 binding determinant mimicry for HIV vaccine design
CN110951695A (zh) 通用型car-t细胞、其制备方法及其应用
CN112080520A (zh) 表达ccr5和car的表达载体及免疫细胞
CN110655572A (zh) 一种抗丝状病毒gp蛋白的单克隆抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210105

Address after: 450000 unit 101, West, building 3, Xingfu community, Jinque Road, Yicheng District, Zhumadian City, Henan Province

Applicant after: Zha Lisha

Address before: 264006 room 247, No.3 workshop, No.32 Zhujiang Road, Yantai Economic and Technological Development Zone, Shandong Province

Applicant before: Shandong Hertz Biotechnology Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220311

Address after: 518000 b314, building 1, Yinxing Zhijie phase II, No. 1301-76, sightseeing Road, Xinlan community, Guanlan street, Longhua District, Shenzhen, Guangdong

Applicant after: Shenzhen Hertz Life Science Technology Co.,Ltd.

Address before: 450000 unit 101, West, building 3, Xingfu community, Jinque Road, Yicheng District, Zhumadian City, Henan Province

Applicant before: Zha Lisha

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant