TWI607083B - 利用假性狂犬病毒生產豬環狀病毒二型類病毒顆粒 - Google Patents

Description

利用假性狂犬病毒生產豬環狀病毒二型類病毒顆粒

本發明係關於利用假性狂犬病毒(PRV)生產豬環狀病毒二型類病毒顆粒之方法，及其所製得之PVC2類病毒顆粒用於防治豬環狀病毒感染之次單位疫苗組成物。更特別地，本發明係關於構築一種具有至少gE基因缺損，並包含PCV2外殼蛋白(capsid protein,Cap)之基因片段的重組PRV病毒株，並進一步表現出豬環狀病毒二型之類病毒顆粒。

豬環狀病毒二型(porcine circovirus type 2,PCV2)為引起養豬產業嚴重經濟損失的重要致病原之一。PCV2隸屬於環狀病毒科，病毒顆粒直徑約為17±1.3 nm。PCV2具單股環狀DNA1768 bp的之基因體，由複製起始區域(Ori)和兩個主要轉錄區(open reading frame,ORF)構成，ORF1轉錄後轉譯出複製蛋白(Replication protein,Rep)，而ORF2則是轉錄後轉譯出外殼蛋白(Capsid protein,Cap)，為PCV2主要結構蛋白。PCV2的疾病控制，除倚賴良好的衛生監測與管控，另外則以疫苗的施打來減緩豬隻的排毒情形。目前市售PCV2疫苗包含不活化全病毒型式(如Circovac®)，利用昆蟲細胞表現系統所生產之PCV2 Cap蛋白的次單位疫苗，如Ingelvac® CircoFLEX^TM(Boehringer Ingelheim)與Circumvent^TM PCV疫苗(Intervet)，以及不活化之PCV1-2嵌合病毒如Fostera® PCV(Fort Dodge)疫苗等。

假性狂犬病(pseudorbies,PR)為假性狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)所引起之豬隻的重要傳染疾病。目前各國所使用的PRV疫苗株多為gE缺損的PRV病毒，若配合血清監測，其優點可與自然感染的豬隻做為區別診斷(differentiating infected from vaccinated animals；DIVA)(Jacobs et al.,The Journal of general virology 71(Pt 4),881-887,1990)。因此，進行假性狂犬病(PR)清除計畫的國家，多以施打標記疫苗(marker vaccine)為優先選擇。假性狂犬病毒之醣蛋白gE對於宿主具神經侵入性和神經毒力之功能，為PRV對宿主造成神經侵入和神經毒力的因子，而gE基因缺損病毒也被證實會影響PRV於神經細胞的順行傳輸，和減低病毒於跨突觸之傳播(Card et al.,Journal of virology 66,3032-3041,1992)，但不會影響病毒本身的複製能力和免疫原性(Mettenleiter et al.,Journal of virology 61,4030-4032,1987)，且經由野外動物實驗證明施打此基因缺損病毒亦同時具有血清學區別診斷的優點(van Oirschot et al.,Veterinary microbiology 23,85-101,1990)。疫苗免疫策略已顯示能有效預防PRV的感染，且醣蛋白E(glycoprotein E,gE)基因缺損的PRV標記疫苗已廣泛於世界各地使用。

另外PRV之胸腺核甘激酶(thymidine kinase,tk)與病毒致病性(pathogenesis)及從潛伏狀態(latency)之復發有關，但並非病毒複製所必需。將tk基因缺損所得之PRV病毒株顯示不具致病性與不會排毒等特性(Efstathiou et al.,The Journal of general virology 70(Pt 4),869-879,1989)，可發展成為安全有效之活毒疫苗(Azmi et al.,Journal of Microbiology 4 0,1-10,2002)，亦可進一步做為安全的病毒載體攜帶外來基因(Li et al.,Vaccine 26,2714-2722,2008；Yuan et al.,Vaccine 26,1314-1321,2008)。

PRV具有龐大的基因體，適合於其基因體中嵌入外來基因，並具有穩定表現外來基因之特性。以假性狂犬病毒為載體攜帶外來基因，可以穩定的表現外來基因，且經由動物試驗證實具有雙重的免疫保護效果，即可同時保留對於假性狂犬病毒以及重組表現外來基因之免疫原性(Hooft van Iddekinge et al.,Vaccine 14,6-12,1996；van Zijl et al.,Journal of virology 65,2761-2765,1991)。多價疫苗具有降低豬隻因多次免疫所造成的緊迫及注射疫苗所需的人工成本等多項優點。本實驗所開發的PRV及PCV2雙價不活化重組疫苗，可針對各年齡豬隻包括懷孕母豬進行免疫，而活減毒雙價疫苗可應用於空胎母豬，期望能藉由母豬產生高力價之移行抗體提供仔豬之保護，而於肉豬的群體免疫上亦可提供雙重的保護效力。

於是，本發明之目的即為利用假性狂犬病毒(PRV)，構築gE基因缺損並包含PCV2外殼蛋白(capsid protein,Cap)之cap基因的PRV重組病毒株，並進一步開發出豬環狀病毒二型類病毒顆粒之次單位疫苗。Song等人曾於2007年發表以重組假性狂犬病毒表現PCV2之cap蛋白(Song,Y.et al.,Veterinary Microbiology 119,97-104,2007)，但其目的是為研發雙價疫苗，而且該文獻並無揭示已利用假性狂犬病毒為表現載體，獲得豬環狀病毒二型類病毒顆粒。

與目前市售的PCV2疫苗相比較，本發明之次單位疫苗(即由重組假性狂犬病毒所表現的PCV2 Cap蛋白)，具有自行組裝為類病毒顆粒的特色。類病毒顆粒主要由一種或兩種以上的病毒外殼蛋白單元所構成，與原始病毒外貌相似但不包含基因體，因可引發宿主先天免疫反應的辨識，類病毒顆粒被認為具有做為自身佐劑的功效，而可減低免疫施打所需劑量，也同為熱門的新型疫苗開發(Vicente et al.,Journal of invertebrate pathology 107 Suppl,S42-48,2011)。若經由PRV載體表現出具有抗原性的PCV2類病 毒顆粒，其開發價值勢必提高。

於是，本發明之一方面係關於一種利用假性狂犬病毒(PRV)生產豬環狀病毒二型類病毒顆粒之方法，其包含：製備一包含編碼PCV2外殼蛋白(capsid protein,Cap)之基因片段的重組transfer質體；選擇一其病毒DNA具有至少gE基因缺損之親源病毒株，將其病毒DNA與該重組transfer質體共同轉染於宿主細胞中，產生具有至少gE基因缺損，並包含PCV2外殼蛋白(capsid protein,Cap)之基因片段的重組PRV病毒株；及增殖該重組PRV病毒株並製造出具抗原性之豬環狀病毒二型之類病毒顆粒(PCV2 VLP)。於本發明之一具體實施例，所述之PCV2外殼蛋白具有如SEQ ID NO.1之胺基酸序列。

於本發明之一些具體實施例，所述之親源病毒株其病毒DNA具有gE基因缺損(僅保留3’端序列)。於本發明之其他具體實施例，所述之親源病毒株其病毒DNA具有gE基因缺損(保留3’端序列)及tk基因缺損(保留5’端及3’端序列)。

於本發明之一具體實施例，所述之親源病毒株進一步包含編碼一可供篩選之報告蛋白的基因片段。於本發明之另一具體實施例，所述之報告蛋白為螢光蛋白。

於另一方面，本發明係提供一種用於防治豬環狀病毒二型疾病之單位疫苗，包含由重組假性狂犬病毒(PRV)生產之豬環狀病毒二型類病毒顆粒。

圖一顯示重組transfer質體pUC/gIPCV2CapgE3’(A)與重組gE^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒株(B)之構築流程。

圖二顯示重組transfer質體pUCUL24PCV2Cap(A)UL23(A)與重組gE^-tk^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒株(B)之構築流程。

圖三為本發明利用重組病毒所表現之PCV2 Cap蛋白的特性分析結果。(A)為以SDS-PAGE分析未經病毒感染之PK15細胞(lane 1)，經野外病毒株(TNL)感染之細胞(lane 2)，重組gE^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒感染之細胞(lane 3)，及重組gE^-tk^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒感染之細胞(lane 4)所收集的細胞溶解液之結果。(B)為利用特異性抗-PCV2 Cap2單株抗體進行西方墨點法之測定結果。(C)為PK15細胞分別以重組gE^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒(a、b、c、d)及重組gE^-tk^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒(e、f、g、h)感染18小時後，以抗-PCV2 Cap單株抗體(a、e)、抗-PRV之豬隻高免血清(b、f)進行IFA測定之結果，其中c為a與b的影像合併，g為e與f的影像合併，d與h為可見光觀察之影像。

圖四顯示本發明之方法可利用重組病毒表現得到PCV2 VLP。(A)為以穿透式電子顯微鏡觀察重組gE^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒所表現的VLP，顆粒大小約17-25 nm(如箭頭所指)。(B)及(C)分別為以抗-PCV2 Cap單株抗體(Ingenasa)針對重組gE^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒所表現的VLPs，以及重組gE^-tk^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒所表現的VLPs，進行免疫金染色分析所得之結果。

圖五顯示以經過不活化的重組gE^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒免疫小鼠後，測定其血清中抗PRV之抗體變化情形。以1.2x10⁸ pfu之不活化重組病毒(immunized group)或PBS(control group)免疫的小鼠，分別於初次免疫和補強免疫前後，以間接ELISA測定其血清中抗PRV之抗體。抗體反應以測得在波長405 nm之吸光值(OD₄₀₅)來表示。(**表示P<0.05)

圖六顯示以不活化的重組gE^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒所表現的VLPs免疫小鼠後，測定其血清中抗PCV2 Cap蛋白之抗體變化情形。以50 μg不活化重組病毒所表現的VLPs(immunized group)或PBS(對照組)免疫的小鼠，分別於初次免疫和兩次補強免疫前後，以間接ELISA測定其血清中抗PCV2 Cap蛋白之抗體。抗體反應以測得在波長405 nm之吸光值(OD₄₀₅)來表示。

本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。根據本發明所呈現的各種實施例，下述各種儀器、裝置、方法和其相關結果者，實施例中為了方便讀者閱讀所使用的標題或副標題，並不被限制在本發明的範圍之內。

實施例一：重組病毒之構築與特性分析

製備表現PCV2 Cap蛋白之重組病毒株

(1)由重組transfer質體pUC/gIPCV2CapgE3’製備

首先利用特異性引子對(Capf-NheI：5’-GCTAGCATGACGTATCCAAGG-3’及Capr-SalI：5’-GTCGACTTAGGGTTTAAGTGG-3’，SEQ ID NO.2及3)，以PCR反應增幅得到重組質體pGapZ/PCV2ORF2中所含有之PCV2 ORF2基因(702 bp)片段，並選殖於載體pCRII-TOPO，而構築得重組質體pTOPO/PCV2Cap。接著利用限制酵素NheI及SalI切位，剪切pTOPO/PCV2Cap所含有之PCV2 Cap基因片段，進一步與重組質體pUC/gIGFPgE3’經由接合作用，而產生重組transfer質體pUC/gIPCV2CapgE3’(圖一A)，其基因序列包含PRV Ka株之gI基因、缺損gE基因(保留3’端序列)及CMV啟動子，可轉錄和轉譯出PCV2 SC株之Cap蛋白。

選擇親源病毒株(gE^-GFP⁺PRV)，其病毒DNA之gE基因缺損(僅保留3’端序列)，並帶有CMV啟動子可轉錄和轉譯出綠色螢光蛋白(GFP)。將該親源病毒株(gE^-GFP⁺PRV)之DNA，與前述所得之transfer質體pUC/gIPCV2CapgE3’共同轉染於PK15細胞中，而獲得重組gE^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒株(圖一B)。其製備及分析方法如下：將PK15細胞培養於24孔細胞培養盤待細胞培養隔夜至形成八成滿。首先製備含有0.8 μg之重組transfer質體的50 μl opti-MEM^® I培養基(Invitrogen)，另外則同時準備內含有2 μl Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)的50 μl opti-MEM^® I培養基，並 置於室溫下作用5分鐘後，將兩者進行溫和混勻而於室溫靜置20分鐘。在將混合物加入細胞進行轉染作用前，將細胞培養液置換為200 μl opti-MEM^® I medium，再將上述混合液加入細胞，並於培養箱中作用6個小時，之後取出細胞更換為500 μl之細胞培養液，而於轉染後18個小時，以間接免疫螢光染色進行蛋白表現之分析。

(2)重組質體pUC/UL24PCV2Cap(A)UL23

以特異性引子對(Capf-NheI：5’-GCTAGCATGACGTATCCAAGG-3’及Capr-SalI：5’-GTCGACTTAGGGTTTAAGTGG-3’，SEQ ID NO.2及3)，利用PCR增幅得到重組質體pUC/gIPCV2CapgE3’中所含有之PCV2 Cap基因(702 bp)，並選殖於載體pJET2.1而構築出重組質體pJET2.1/PCV2Cap。接著利用限制酵素NheI及BlpI切位剪切pJET2.1/PCV2Cap之PCV2 Cap基因片段，進一步與重組質體pUC/UL24GFP(A)UL23經由接合作用，而產生重組transfer質體pUC/UL24PCV2Cap(A)UL23(圖二A)，其基因序列包含PRV Ka株之UL24基因、缺損UL23基因(tk基因)(保留5’端、3’端序列但序列中央缺損)及CMV啟動子可轉錄和轉譯出PCV2 SC株之Cap蛋白。

選擇親源病毒株(gE^-tk^-GFP⁺PRV)，其病毒DNA之gE基因缺損(保留3’端序列)、tk基因缺損(保留5’端及3’端序列)，並帶有CMV啟動子可轉錄和轉譯出綠色螢光蛋白(GFP)。將該親源病毒株(gE^-tk^-GFP⁺PRV)之病毒DNA，與前述所得之transfer質體pUCUL24PCV2Cap(A)UL23共同轉染於PK15細胞中，產生重組gE^-tk^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒株(圖二B)。其製備及分析方法如下：將PK15細胞培養於24孔細胞培養盤待細胞培養隔夜至形成八成滿。首先製備含有0.8 μg之重組transfer質體的50 μl opti-MEM^® I培養基(Invitrogen)，另外則同時準備內含有2 μl Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)的50 μl opti-MEM^® I培養基，並置於室溫下作用5分鐘後，將兩者進行溫和混勻而於室溫靜置20分鐘。在將混合 物加入細胞進行轉染作用前，將細胞培養液置換為200 μl opti-MEM^® I medium，再將上述混合液加入細胞，並於培養箱中作用6個小時，之後取出細胞更換為500 μl之細胞培養液，而於轉染後18個小時，以間接免疫螢光染色進行蛋白表現之分析。

重組病毒所表現PCV2 Cap蛋白之特性分析

為確認重組病毒表現PCV2 Cap蛋白之情形，遂在病毒感染細胞後分別以間接免疫螢光染色，和西方墨點法進行蛋白表現測定及分析。將前述所得之兩株重組病毒(gE^-/PCV2 cap⁺ PRV和gE^-tk^-/PCV2 cap⁺ PRV)，在感染細胞隔夜後收集細胞溶解液，以西方墨點法均可偵測到其PCV2 Cap蛋白(28 kDa)之表現，而野外病毒株(TNL)和PK15細胞之溶解液，則沒有偵測到有PCV2 Cap蛋白表現(圖三B)。而經由間接免疫螢光染色分析，此兩株重組病毒皆可於感染細胞後，偵測到PCV2 Cap蛋白(圖三C之a、e)和PRV病毒蛋白之表現(圖三C之b、f)。由以上結果顯示，本發明所得之兩株重組病毒於病毒複製過程中，皆可產生具抗原性的PRV和PCV2 Cap蛋白。

為了解重組病毒所表現的PCV2 Cap蛋白是否能夠，在病毒複製過程中自行組裝為類病毒顆粒(VLP)，分別將兩株重組病毒(gE^-/PCV2 cap⁺ PRV和gE^-tk^-/PCV2 cap⁺ PRV)感染細胞之細胞溶解液，進一步以40%蔗糖cushion超高速離心的方式純化PCV2 VLPs，並以穿透式電子顯微鏡(TEM)進行觀察。結果顯示，該兩株重組病毒在病毒複製過程中皆可產生VLPs，且其大小約17-25 nm左右(圖四A)，顯示其與原始PCV2病毒顆粒相似。進一步利用特異性單株抗體MAb α-PCV2 Cap進行辨識，兩株重組病毒所產生的PCV2 VLPs皆可被金粒子所標定(圖四B、C)。綜合以上結果，本發明所製得之重組病毒，於病毒複製過程中可產生具抗原性的PCV2 VLPs。

實施例二：重組病毒株之疫苗效力分析

病毒株(gE ^- /PCV2 cap ⁺ PRV)免疫小鼠之疫苗效力

首先利用間接ELISA測定，存在鼠血清中的抗PRV特異性抗體。將9隻6週齡的BALB/c小鼠隨機分為兩組。免疫組小鼠(6隻)係以50 μg重組病毒所表現之PCV2 VLPs(1.2x10⁸ pfu)進行免疫，對照組(3隻)則以500 μl的PBS進行免疫。每隻小鼠免疫劑量為500 μl其中包含了250 μl抗原和250 μl的ISA201佐劑(SEPPIC)，並分別在小鼠6週齡、8週齡及10週齡以腹腔注射進行免疫。

利用間接ELISA測定小鼠血清中的抗PRV之特異性抗體。預先於ELISA分析盤上將PRV可溶性抗原進行抗原被覆，而以被覆緩衝液(coating buffer,150 mM Na₂CO₃,348 mM NaHCO₃,pH 9.6)進行抗原稀釋，於4℃作用隔夜。以PBST清洗一次後每孔加入100 μl含1% BSA的PBS溶液(阻斷液)，於37℃作用兩個小時。再以PBST清洗兩次，每孔加入50 μl以阻斷液稀釋100倍的待測小鼠血清，於37℃下作用一個小時。之後以PBST清洗三次後，每孔加入50 μl HRP連結的山羊抗-鼠之抗體(以阻斷液稀釋4000倍)，接著於37℃下作用一個小時。以PBST清洗三次，再以PBS清洗兩次，最後每孔加入50 μl呈色試劑(ABTS)。實驗結果則是利用ELISA測定儀，於波長405 nm下進行吸光值判讀。

結果發現，以不活化重組病毒株(gE^-/PCV2 cap⁺ PRV)免疫的小鼠，於初次免疫後兩週及補強免疫後一週產生抗PRV之特異性抗體，並於補強免疫後產生明顯的抗體揚升(P<0.05)。而免疫PBS的小鼠於實驗過程中，並未測得抗PRV之特異性抗體(圖五)。

進一步利用10倍LD₅₀之PRV野外病毒株(TNL)進行攻毒感染試驗，以評估疫苗所產生的保護效力。將9隻6週齡的BALB/c小鼠隨機分為兩組。免疫組小鼠(6隻)免疫1.2x10⁸ pfu之不活化重組病毒，而對照組(3隻)則免疫500 μl的PBS。每隻小鼠免疫劑量為500 μl其中包含了250 μl抗原和250 μl的ISA563佐劑 (SEPPIC)，並分別在小鼠6週齡和8週齡以腹腔注射進行免疫，並於11週齡以500 μl DMEM中含10倍LD₅₀之PRV野外病毒株(TNL)進行PRV攻毒感染。結果發現，免疫組小鼠並未產生臨床症狀且全數存活，而實驗對照組則全數死亡。由以上結果顯示，免疫不活化重組病毒株(gE^-/PCV2 cap⁺ PRV)可誘發小鼠產生抗PRV之中和性抗體且具有良好的保護效力。

不活化重組病毒株(gE ^- /PCV2 cap ⁺ PRV)所表現VLPs免疫小鼠之疫苗效力

首先製備不活化重組病毒：配製0.1 M BEI(1.025 g 2-bromoethylamine溶於50 ml 0.2 N NaOH，於37℃以150 rpm震盪1小時，利用0.22 μm過濾膜進行過濾，並保存於4℃)和1 M sodium thiosulphate。先取0.1 M BEI加入病毒液中進行不活化，使其終濃度為3 mM，於37℃以150 rpm震盪24小時。之後先抽取1 ml病毒液，加入10 μl冰涼的1 M sodium thiosulphate，進行小量細胞感染測試以確定為不感染細胞之不活化病毒液。最後將不活化病毒液加入1 M sodium thiosulphate，終止BEI之作用。

將9隻6週齡的BALB/c小鼠隨機分為兩組。免疫組小鼠(6隻)免疫50 μg重組病毒所表現之PCV2 VLPs，對照組(3隻)則免疫500 μl的PBS。每隻小鼠免疫劑量為500 μl，其中包含250 μl抗原和250 μl的ISA201佐劑(SEPPIC)，並分別在小鼠6週齡、8週齡及10週齡以腹腔注射進行免疫。

利用間接ELISA測定小鼠血清中的抗PCV2 Cap蛋白之特異性抗體。預先於ELISA分析盤上分別將大腸桿菌所表現PCV2 Cap蛋白進行抗原被覆，而以被覆緩衝液(coating buffer,150 mM Na₂CO₃,348 mM NaHCO₃,pH 9.6)進行抗原稀釋，於4℃作用隔夜。以PBST清洗一次後每孔加入100 μl含1% BSA的PBS溶液(阻斷液)，於37℃作用兩個小時。再以PBST清洗兩次，每孔加入50 μl以阻斷液稀釋100倍的待測小鼠血清，於37℃下作用一個小時。之後以PBST清洗三次後，每孔加入50 μl HRP連結的山羊抗-鼠之抗體(以阻斷液稀釋4000倍)，接著於37℃下作用一個小時。以 PBST清洗三次，再以PBS清洗兩次，最後每孔加入50 μl呈色試劑(ABTS)。實驗結果則是利用ELISA測定儀，於波長405 nm下進行吸光值判讀。

由圖六之結果顯示，以不活化重組病毒株(gE^-/PCV2 cap⁺ PRV)所表現的VLPs免疫的小鼠，於補強免疫後一週及二次補強免疫後兩週，會產生抗-PCV2 Cap蛋白之特異性抗體，並於第二次補強免疫後，免疫組小鼠所產生的抗體量，相較於對照組有明顯揚升。免疫PBS的組別則於實驗過程中，並未測得抗PCV2 Cap蛋白之特異性抗體。由以上結果顯示，以重組病毒株(gE^-/PCV2 cap⁺ PRV)所表現的VLPs免疫小鼠，可誘發小鼠體內產生抗-PCV2 Cap蛋白之特異性抗體。

重組病毒株(gE-tk-/PCV2 cap+ PRV)於小鼠LD50測定

為了解重組gE^-tk^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒株之安全性，將10隻6週齡的BALB/cJNarl小鼠隨機分為兩組，每組5隻小鼠，分別以腹腔注射方式接種500 μl含7x10⁶及7x10⁵ pfu之重組病毒液。而小鼠接種病毒液後，每日觀察小鼠健康情形。實驗結果顯示，小鼠無論以7x10⁶或7x10⁵ pfu之劑量進行接種，皆不產生臨床症狀且無任何小鼠死亡，因此確認重組gE^-tk^-/PCV2 cap⁺ PRV病毒株於小鼠的LD₅₀為大於7x10⁶ pfu，已完全減弱毒力。

其他具體態樣

本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。於是，本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。

從前述之說明，習於該項技藝人士可容易地確定本發明之基本特徵，且在未偏離其範圍下，可進行本發明之各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。

<110> 國立中興大學

<120> 利用假性狂犬病毒生產豬環狀病毒二型類病毒顆粒

<160> 3

<170> Patent In Version 3.3

<210> 1

<211> 233

<212> PRT

<213> 豬環狀病毒二型(Porcine circovirus type 2)

<400> 1 230

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 正向引子Capf-NheI

<400> 1

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 反向引子Capr-SalI

<400> 1

Claims (8)

1. 一種利用假性狂犬病毒(PRV)生產豬環狀病毒二型類病毒顆粒(PCV2 VLP)之方法，其包含：(1)製備一包含編碼PCV2外殼蛋白(capsid protein,Cap)之基因片段的重組轉移(transfer)質體，其基因序列包含PRV TNL株之gI基因與gE3’基因(僅保留3’端序列之gE基因)或缺損UL23基因(保留5’端、3’端序列但序列中央缺損之缺損tk基因)及CMV啟動子；(2)選擇一其病毒DNA具有至少gE基因缺損之親源病毒株，將其病毒DNA與該重組轉移transfer質體共同轉染於宿主細胞中，產生具有至少gE基因缺損，並包含PCV2外殼蛋白(capsid protein,Cap)之基因片段的重組PRV病毒株；及(3)將所得之重組PRV病毒株感染宿主細胞；(4)將經感染之宿主細胞於細胞培養液中培養，使該重組PRV病毒株於該細胞培養時增殖並自行組裝，製造出具抗原性之豬環狀病毒二型之類病毒顆粒(PCV2 VLP)。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該PCV2外殼蛋白具有SEQ ID NO.1之胺基酸序列。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該親源病毒株之病毒DNA具有gE基因缺損(僅保留3’端序列)。
4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該親源病毒株之病毒DNA具有gE基因缺損(保留3’端序列)及進一步具有tk基因缺損(保留5’端及3’端序列)。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該親源病毒株進一 步包含編碼一可供篩選之報告蛋白的基因片段。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該報告蛋白為螢光蛋白。
7. 一種用於防治豬環狀病毒二型疾病之次單位疫苗，其特徵在於包含由如申請專利範圍第1項所述之方法生產之豬環狀病毒二型類病毒顆粒，其中該豬環狀病毒二型類病毒顆粒的顆粒大小為17-25nm。
8. 如申請專利範圍第7項所述之次單位疫苗，其中PCV2外殼蛋白於該病毒複製過程中自行組裝為類病毒顆粒(VLP)。