CN113322271A - 基于酵母表面展示系统的covid-19亚单位疫苗 - Google Patents

基于酵母表面展示系统的covid-19亚单位疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于酵母表面展示系统的COVID‑19亚单位疫苗，属于抗病毒疫苗领域。本发明的疫苗是通过酵母表面展示系统，融合表达新型冠状病毒抗原基因RBD基因与凝集素受体Aga2亚基，将新型冠状病毒的表面抗原RBD展示于酵母表面所得到的新型疫苗。本发明的疫苗安全、有效、制备快速、使用方便，在COVID‑19疫情防控中应用前景良好。

Description

基于酵母表面展示系统的COVID-19亚单位疫苗
技术领域
本发明属于抗病毒疫苗领域，具体涉及一种基于酵母表面展示系统的 COVID-19亚单位疫苗。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称“新冠病毒”)是继SARS-CoV、 MERS-CoV之后，在人类大规模爆发的传染性冠状病毒，其能引起新型冠状病毒肺炎(COVID-19，简称“新冠肺炎”)。
新冠病毒由双层脂质的囊膜组成，包含刺突蛋白(Spike glycoprotein，S)、包膜蛋白(Envelope protein，E)、膜蛋白(Membrane glycoprotein，M)以及核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)。其中S蛋白和N蛋白是其中最重要的靶点蛋白。S蛋白就是冠状病毒表面的“皇冠”，位于病毒最外层，与病毒的传染能力相关。S蛋白含有两个功能亚基：分别是S1和S2，S1通过与宿主受体结合促进病毒感染，其中S1的C端的受体结合区域(RBD)负责识别受体呼吸道细胞表面的血管紧张素转换酶ACE2进入胞内感染人类。S蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合的功能，是宿主中和抗体重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。
亚单位疫苗是目前构建COVID-19疫苗的主流种类之一，基于 SARS-CoV-2的关键蛋白或多肽，利用细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞进行体外表达，是开发COVID-19亚单位候选疫苗的主要策略。尽管目前已有十余种COVID-19亚单位候选疫苗已进入临床试验，但是疫苗的安全性、关键蛋白的构想稳定性以及免疫应答水平的保证还仍有待进一步的确认。
而随着COVID-19的不断蔓延，仍然亟需开发更多的新型COVID-19候选疫苗以应对SARS-CoV-2高突变带来的挑战。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供基于酵母表面展示系统的COVID-19亚单位疫苗。酿酒酵母表面展示系统利用酿酒酵母的a-凝集素受体在细胞表面显示外来蛋白。凝集素受体由Aga1(Gene ID:855780)和Aga2(Gene ID:852851) 基因编码的两个亚单位组成。酿酒酵母能够展示高分子量的蛋白质，能对表达的外源真核生物蛋白质进行有效的折叠、糖基化和形成二硫键，其相比其他展示系统有较多优势。首先，酿酒酵母具有公认的安全性(GRAS)，并且在食品和医药工业中已经被大量使用。其次，酿酒酵母EBY100的细胞壁表面成分中含有佐剂β-1,3-D-葡聚糖和甘露聚糖，能够增强机体对抗原的免疫应答。再次，酵母分子显示系统具有典型的真核特异性、翻译后修饰机制，能够表达许多翻译后修饰所需的功能蛋白。再次，酿酒酵母的培养方法简单，成本低，生长周期短，能够大规模应用于工业生产。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种重组质粒，它是能够融合表达SARS-CoV-2抗原基因与凝集素受体Aga2亚基，得到融合蛋白的重组质粒；所述SARS-CoV-2抗原基因为RBD基因，序列如SEQID NO.1所示；所述Aga2亚基以C-末端与RBD基因融合。
进一步地，上述Aga2亚基与SARS-CoV-2抗原基因之间有接头序列，所述接头序列翻译得到的氨基酸序列为(G4S)3，所述(G4S)3为 GGGGSGGGGSGGGGS。
进一步地，上述质粒以pYD1为骨架质粒，所述pYD1优选为Invitrogen生产的pYD1。
本发明还提供了一种重组酵母，它是包含上述重组质粒的酵母；所述酵母是S.cerevisiae EBY100。
进一步地，上述酵母与凝集素受体Aga1亚基连接，所述Aga1亚基与所述重组质粒连接；优选地，所述酵母与凝集素受体Aga1亚基通过β葡聚糖共价连接；和/或所述Aga1亚基与所述重组质粒通过二硫键共价连接。
本发明还提供了上述重组酵母在制备COVID-19疫苗中的用途。
进一步地，上述疫苗为口服疫苗。
本发明还提供了一种COVID-19亚单位疫苗，它是以上述重组酵母为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
进一步地，上述制剂为口服制剂。
本发明还提供了一种制备权利要求3或4所述重组酵母的方法，其包括如下步骤：
(1)构建凝集素受体亚单位Aga2基因的C末端与SARS-CoV-2抗原基因融合的重组质粒；
(2)将重组质粒导入感受态酵母菌中，即可；
所述SARS-CoV-2抗原基因为RBD基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，上述步步骤(2)的导入步骤如下：
1)用LiAc制备酵母菌菌悬液，0～10℃作用5～20min，得感受态酵母；
2)ssDNA煮沸5～20min，冷却；
3)将步骤1)得到的感受态酵母、步骤2)处理后的ssDNA、分子量大于 3000的PEG与重组质粒在水中混匀，25～35℃下作用20～24min，40～25℃热激 20～30min。
本发明的有益效果如下：
(1)安全性。pYD1作为大肠杆菌-酿酒酵母的穿梭质粒，含有的氨苄青霉素抗性标记只在中间宿主E.coli DH5α中发挥作用，当带有目标基因的 pYD1整合到酿酒酵母EBY100的基因组时，抗性标记随即丢失。因此，通过pYD1构建的酿酒酵母表面展示系统是食品级的，这为新冠病毒口服疫苗的安全性奠定了坚实的物质基础。
(2)有效性。本申请巧妙地选择了新冠病毒具有免疫原性的RBD作为目标蛋白，利用酿酒酵母表面展示技术，构建C末端表面展示系统。RBD的免疫原性接近病毒，而EBY100的细胞壁表面成分β-1,3-D-葡聚糖和甘露聚糖具有很强的佐剂功能，两者相互配合，能最大限度发挥疫苗的免疫原性，有效提高小鼠对新型冠状病毒的免疫力。
(3)时效性。酿酒酵母表面展示技术可以应用于快速、大规模地制备新型冠状病毒疫苗。从载体构建到酵母的大规模培养，只需要约10天就可完成，这为预防新冠病毒的感染提供了可靠的战略保障。
(4)便捷性。本发明制备口服疫苗的整个操作过程不要特殊的实验条件，在生物安全二级(BSL II)实验室就可完成。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：重组酵母EBY100/pYD5-RBD展示抗原的结构图。
图2：RBD基因的PCR扩增结果，Lane 1：DNA marker(DL 2,000)；Lane 2：RBD基因。
图3：pYD1的双酶切结果，Lane 1：DNA marker(DL 5,000)；Lane 2：pYD1 (N/E)。
图4：重组质粒pYD1-RBD的双酶切电泳结果，Lane 1：DNA marker(DL 5,000)；Lane2：双酶切后的重组质粒pYD1-RBD。
图5：EBY100/pYD1-RBD的PCR鉴定结果，Lane 1：DNA marker(DL 2,000)；Lane 2：pYD1特异性基因片段。
图6：Western blot结果，Lane 1：Precision plus protein标准品；Lane 2：EBY100/pYD1-RBD裂解物；Lane 3：EBY100/pYD1裂解物。
图7：免疫荧光分析结果。A.EBY100/pYD1；B.EBY100/pYD1-RBD。
图8：流式细胞仪分析结果。A.EBY100/pYD1；B.EBY100/pYD1-RBD。
图9：RBD特异性血清IgG。数据用平均值±标准差表示，星号表示 EBY100/pYD1-RBD组和PBS组以及EBY100/pYD1-RBD组和EBY100/pYD1 组之间有显著差异。(*p＜0.05，**p＜0.01)。
图10：粪便中分泌型IgA。数据用平均值±标准差表示，星号表示 EBY100/pYD1-RBD组和PBS组以及EBY100/pYD1-RBD组和EBY100/pYD1 组之间有显著差异。(*p＜0.05，**p＜0.01)。
图11：T细胞增殖分析。数据用平均值±标准差表示，星号表示 EBY100/pYD1-RBD组和PBS组以及EBY100/pYD1-RBD组和EBY100/pYD1 组之间有显著差异。(*p＜0.05，**p＜0.01)。
图12：IFN-γ和IL-4的分泌水平。数据用平均值±标准差表示，星号表示 EBY100/pYD1-RBD组和PBS组以及EBY100/pYD1-RBD组和EBY100/pYD1 组之间有显著差异。(*p＜0.05，**p＜0.01)。
图13：CD4+T细胞介导的IFN-γ和IL-4的分泌水平。数据用平均值±标准差表示，星号表示EBY100/pYD1-RBD组和PBS组以及EBY100/pYD1-RBD组和EBY100/pYD1组之间有显著差异。(*p＜0.05，**p＜0.01)。
图14：SARS-CoV-2假病毒微量中和分析。数据用平均值±标准差表示， *表示EBY100/pYD1-RBD组和PBS组以及EBY100/pYD1-RBD组和 EBY100/pYD1组之间有统计学差异。(*p＜0.05，**p＜0.01)
具体实施方式
1、材料
Figure BDA0003097759030000041
Figure BDA0003097759030000051
2、菌株及质粒
Figure BDA0003097759030000052
3、培养基及试剂的配制
(1)5×TAE缓冲液
称取26.54g Tris、1.45g EDTA和13.3g H3PO4加入350mL超纯水中，搅匀，调节pH值为8.3，定容至500mL。
(2)氨苄青霉素溶
称取2g氨苄青霉素20mL灭菌超纯水，搅匀，0.22μm滤膜过滤，-20℃保存，待用。
(3)10×YNB溶液
称取3.3g无氨基酵母氮源(YNB)加入45mL灭菌超纯水中，搅匀，定容至50mL，0.22μm滤膜过滤，待用。
(4)20％葡萄糖溶液
称取20g葡萄糖加入70mL超纯水中，搅匀，定容至100mL，0.22μ m滤膜过滤，待用。
(5)1M山梨醇溶液
称取45.5g山梨醇加入175mL超纯水中，搅匀，定容至250mL，高压灭菌20min，待用。
(6)10mg/mL亮氨酸
称取0.2g亮氨酸加入20mL超纯水中，搅匀，定容至200mL，0.22μ m滤膜过滤，-20℃保存，待用。
(7)10×CAA溶液
称取10g酪蛋氨基酸(CAA)加入150mL超纯水中，搅匀，定容至400 mL，0.22μm滤膜过滤，待用。
(8)含2％葡萄糖YNB-CAA培养液
Figure BDA0003097759030000062
(9)Luria-Bertani(LB)培养基
称取5.0g胰蛋白胨、2.5g酵母提取物和5.0g NaCl加入400mL超纯水中，搅匀，定容至500mL，灭菌15min，4℃保存，待用。加入7.5g琼脂粉后，得固体LB培养基。
(10)YPD培养基
称取10g蛋白胨和5.0g酵母提取物加入450mL超纯水中，灭菌20min，加50mL 20％葡萄糖溶液，搅匀，4℃保存，待用。加入4.5g琼脂粉后，得 YPD固体培养基。
(11)亮氨酸Minimal Dextrose9(MD)选择培养基
称取4.0g琼脂粉加入168mL超纯水中，高压灭菌20min，加入10× YNB溶液、20％葡萄糖溶液和亮氨酸溶液，搅匀，倒板，4℃保存，待用。
(12)1％琼脂糖凝胶
称量0.3g琼脂糖倒入锥形瓶中，取35mL 1×TAE倒其中，混合均匀，微波炉加热两次，趁热加入核酸染料，混匀，倒胶，插梳。
(13)1mol/L LiAc溶液
称取6.6g醋酸锂(LiAc)加入90mL超纯水中，搅匀，定容至100mL， 0.22μm滤膜过滤，待用。
(14)50％PEG3350
称取50g PEG3350加入70mL超纯水中，搅匀，定容至100mL，高压灭菌20min，待用。
实施例1重组质粒pYD1-RBD的构建
1、RBD基因扩增
1.1 RBD特异性引物设计
以SARS-CoV-2的S基因(基因库编号:MN908947)作为DNA模板，通过设计特异性引物扩增RBD基因，引物序列如表1所示，引物F-1和R-1中的下划线分别为酶切位点Nhe I和EcoR I。
表1.RBD基因的PCR引物
Figure BDA0003097759030000061
受体结合结构域(RBD)基因序列(SEQ ID NO.1，582bp)如下：
ATGCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGC CACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAAC TGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTA AGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAAT GTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCG CTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGAT GATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAA GGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCT CAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGC ACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATC ATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTA GTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCATAA。
1.2 RBD基因的PCR扩增
RBD基因的PCR扩增体系：
Figure BDA0003097759030000071
PCR扩增反应程序：
Figure BDA0003097759030000072
1.3 PCR产物电泳及回收
通过1％琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析。电泳完成后，取出凝胶块置于凝胶成像仪中进行成像分析。切胶(尽量小以提高回收率)，回收。回收提取后的PCR产物标记为RBD基因，-20℃保存，待用。
1.4 RBD基因的双酶切及胶回收
(1)RBD基因双酶切
将RBD基因进行Nhe I/EcoR I双酶切。酶切体系为：
Figure BDA0003097759030000073
混合均匀后37℃反应1.5小时。
(2)酶切产物电泳
参照1.3(1)的步骤，对酶切产物进行电泳分析。
(3)酶切产物割胶回收
参照1.3(2)的步骤，对电泳后的凝胶进行割胶回收，回收产物标记为 RBD(N/E)，-20℃保存，待用。
2、表达质粒pYD1的提取及双酶切鉴定
2.1表达质粒pYD1的提取
利用Takara质粒小抽试剂盒从E.coli DH5α/pYD1提取质粒，-20℃保存，待用。
2.2表达质粒pYD1的双酶切及胶回收
参照1.4的步骤，对表达质粒pYD1进行双酶切，凝胶电泳及割胶回收，回收后产物标记为pYD1(N/E)，-20℃保存，待用。
3、RBD(N/E)与pYD1(N/E)的连接
3.1反应体系：
Figure BDA0003097759030000081
16℃反应1小时。
3.2连接产物的转化
(1)取50μL存于-80℃的E.coli DH5α感受态细胞，冰浴融化；
(2)加入1μL连接产物，冰浴30min，42℃反应45s，冰浴2min；
(3)加入适量LB液体培养基。
(4)37℃，250rpm振荡培养1h，使用移液枪吸取培养后菌液，涂布，于恒温培养箱37℃过夜培养。
3.3阳性克隆的筛选鉴定
(1)E.coli DH5α/pYD1-RBD的筛选
使用移液枪挑取单菌落接种于1.5mL液体培养基中，37℃，250rpm振荡过夜。抽提纯化pYD1-RBD，-20℃保存，待用。
(2)pYD1-RBD的鉴定
参照1.4的步骤，对pYD1-RBD进行双酶切和电泳分析。
实施例2、重组酵母EBY100/pYD1-RBD的分子构建
1、重组质粒pYD1-RBD的转化
(1)取存于-80℃超低温冰箱中的EBY100菌种，划线于YPD固体培养基，置于培养箱中，30℃培养；
(2)挑取单菌落于3mL YPD培养基，30℃培养；
(3)测定EBY100吸光度(OD)，并将培养后的菌液转入50mL新鲜 YPD培养液，调整OD值为0.4，30℃，200rpm继续培养4-5h；
(4)4℃，3,000rpm离心5min，无菌水洗涤两次；
(5)4℃，3,000rpm离心5min，菌体重悬于1mL 0.1M的LiAc中；
(6)放在准备好的冰上静置10min，4,000rpm离心3min，弃上清，沉淀重悬于300μLLiAc，取2个EP管，将重悬后的感受态细胞分装于其中；
(7)取变性鲑鱼精(ssDNA)，100℃煮沸10min，冰上迅速冷却；
(8)取分装好的EBY100感受态细胞，3,000rpm，离心5min，弃上清；
(9)按顺序加入：240μL聚乙二醇PEG(分子量3350)，36μL 1mol/L LiAc，12μLssDNA，12μL pYD1-RBD以及62μL无菌超纯水；
(10)涡旋振荡1min，30℃水浴30min，42℃热激25min；
(11)5,000rpm离心2min，弃上清；
(12)使用灭菌水洗涤，重悬；
(13)涂布于亮氨酸选择性培养基，30℃，培养2-3天；
(14)按上述方法将质粒pYD1转入EBY100。
2、阳性克隆的筛选鉴定
使用移液枪挑取单菌落接种至5mL含2％葡萄糖的YNB-CAA液体培养基，30℃，250rpm培养过夜。抽提纯化酵母基因组。并以其为模板以及pYD1 特异性引物(如表2所示)，进行PCR扩增，并对PCR产物进行电泳分析。将PCR及电泳分析结果中的阳性克隆标记为EBY100/pYD1-RBD。本发明重组酵母EBY100/pYD5-RBD展示抗原的结构如图1所示。
表2.pYD1基因引物
Figure BDA0003097759030000091
实施例3、口服疫苗的制备
(1)诱导重组酿酒酵母EBY100/pYD1-RBD表达。
(2)取诱导表达72h的菌液，测定其OD600nm处的吸收值。
(3)4℃，5,000rpm，离心15min，弃上清，使用灭菌后的PBS将沉淀漂洗3次。
(4)使用灭菌后的PBS重悬菌体，并将其浓度调整为1OD600nm/μL，并于60℃水浴灭活处理1h。
步骤(1)中诱导表达方法如下：
(a)使用移液枪挑取实施例2制备的EBY100/pYD1-RBD单菌落，接种于3mL培养基中，置于振荡摇床中，30℃、250rpm培养16-18h。
(b)取1mL菌液测OD600nm值，使OD600nm值在2.0-5.0之间。
(c)在YNB-CAA液体培养基中，用2％半乳糖替代2％葡萄糖，20℃、 250rpm诱导培养72h。
(d)与此同时，利用同样的方法处理EBY100/pYD1，作为后续实验的对照。
以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。
试验例1、本发明重组质粒和重组酵母的成功构建
1、RBD基因的PCR扩增
以SARS-CoV-2的S基因(基因库编号:MN908947)为模板，利用RBD 特异性引物进行PCR扩增，凝胶电泳结果如2所示，PCR扩增得到的目的基因RBD的条带大小约为591bp，与预期结果相符。
2、表达质粒pYD1的双酶切分析
使用Nhe I和EcoR I快切酶对提取后的表达质粒pYD1进行双酶切，得到pYD1(N/E)，经凝胶电泳后得到的结果如图3所示。线性质粒pYD1(N/E) 条带大小约为5,000bp，条带大小与预期相符。
3、重组质粒pYD1-RBD的双酶切分析
将双酶切后的pYD1(N/E)和RBD(N/E)经重组构建后转至感受态 E.coli DH5α中，筛选后得到E.coli DH5α/pYD1-RBD。使用质粒小抽试剂盒提取pYD1-RBD后对其进行双酶切以及凝胶电泳分析，结果如图4所示。重组质粒pYD1-RBD经Nhe I/EcoR I双酶切后得到两个条带，大小分别约为 4,943bp(上)和591bp(下)，该结果与预期一致，证明目的基因RBD已成功亚克隆到表达质粒pYD1中。
4、EBY100/pYD1-RBD的PCR鉴定
分别以EBY100/pYD1和EBY100/pYD1-RBD的基因组DNA为模板，使用pYD1引物进行PCR扩增，经电泳后得到的结果如图5所示。其中图5A 示意EBY100/pYD1基因组DNA为模板的扩增结果，pYD1的特异性基因片段大小约为399bp；图5B是以EBY100/pYD1-RBD基因组DNA为模板的扩增结果，条带大小约为912bp。二者正好相差591bp，证明重组质粒 pYD1-RBD成功克隆并整合到EBY100基因组中。
上述结果本发明通过设计特异性PCR引物扩增获得RBD基因，并将其亚克隆至质粒pYD1的AGA2-(G4S)3基因的下游，成功构建了重组质粒，在表达的Aga2-(G4S)3-RBD蛋白中，甘氨酸-丝氨酸连接肽(G4S)3具有稳定Aga2 和RBD蛋白融合表达的作用。
通过PEG/LiAc法制备感受态酿酒酵母EBY100，这是能否成功构建 EBY100/pYD1-RBD的关键点。在制备过程中，PEG、LiAc以及鲑鱼精DNA 是影响感受态酿酒酵母EBY100质量的三个关键因素。PEG是一种高分子聚合物，可以保护高浓度LiAc环境中的酿酒酵母EBY100细胞膜结构不被破坏，同时还可以促进重组质粒pYD1-RBD与酿酒酵母EBY100细胞膜接触，从而增加重组质粒的转化效率。值得注意的是，只有当PEG的分子量达到 3000以上时，才能发挥最大作用。LiAc能够使酿酒酵母细胞产生短暂的感受性状态，以便重组质粒进入酿酒酵母细胞中。而鲑鱼精DNA的加入可有效避免重组质粒在转化过程中被降解。鲑鱼精DNA在使用前需要加热变性，以保证其在转化过程中以单链形式存在。
试验例2、本发明重组酵母EBY100/pYD1-RBD的体外表达分析
1、实验方法
以D-半乳糖为诱导剂，对诱导72h后的EBY100/pYD1-RBD进行体外表达分析。诱导表达方法参照实施例3。通过Western blot检测RBD蛋白在酿酒酵母EBY100中的特异性表达。与此同时，通过免疫荧光显微镜以及流式细胞仪分析检测RBD蛋白的表达位置和展示效率。
2、实验结果
(1)Western blot
以多克隆兔源抗-RBD抗体作为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，通过Western blot检测RBD蛋白在酿酒酵母EBY100中的特异性表达。 EBY100/pYD1-RBD的裂解物中检测到了一条特异性条带，其蛋白分子量大小约为32kDa(如图6 Lane 2所示)，与预期的蛋白分子量大小一致。在 EBY100/pYD1的裂解物中未检测到特异性条带(图6 Lane 3所示)。Western blot结果表明重组EBY100/pYD1-RBD可以特异性表达RBD蛋白。
(2)免疫荧光分析
用半乳糖诱导72h后的EBY100/pYD1-RBD直接与一抗多克隆兔抗 -RBD抗体特异反应，以FITC-标记的羊抗兔IgG作为二抗，通过激光共聚焦显微镜检测RBD蛋白在EBY100细胞中的表达位置。结果如图7所示，在 EBY100/pYD1组中未出现绿色荧光信号，而在EBY100/pYD1-RBD中检测到较强的特异性绿色荧光信号。免疫荧光分析结果表明，RBD蛋白成功地表达在酿酒酵母EBY100的细胞表面。
(3)流式细胞仪分析
在免疫荧光检测的基础上，进一步利用流式细胞仪分析酿酒酵母 EBY100/pYD1-RBD的展示效率。结果如图8所示，与EBY100/pYD1相比， EBY100/pYD1-RBD的表达效率为45.1％。流式细胞仪分析结果佐证了RBD 蛋白在酿酒酵母EBY100的细胞表面成功地表达。
上述结果说明，本发明的RBD蛋白成功地特异性展示在酿酒酵母 EBY100的表面，并且成功表达，制得的重组EBY100/pYD1-RBD可以特异性表达RBD蛋白，具有作为COVID-19疫苗的潜力。
试验例3、本发明重组酵母BY100/pYD1-RBD的免疫应答检测
1、实验方法
将45只BABL/c小鼠随机分为PBS组(n＝15)，EBY100/pYD1组(n＝ 15)和EBY100/pYD1-RBD组(n＝15)。口服免疫安排如表3所示，在第1， 2天进行初次免疫，在第14，15天进行加强免疫。在初次免疫后第12，28 天，收集血清和粪便，并分离脾脏。
表3.口服免疫安排
Figure BDA0003097759030000121
(注：1μL＝150OD600nm)
(1)血清采集
每次下颌取血后室温静置2h，室温，2,000rpm离心15min，取上清， -20℃保存，待用。
(2)粪便收集和处理
每次收集粪便后，无菌PBS浸泡3小时，室温，2,000rpm离心15min，取上清，-20℃保存，待用。
(3)T淋巴细胞样品收集和处理
(a)取脾脏组织，用剪刀将脾脏剪成小块；
(b)将剪好的脾脏组织块小心转移到200目细胞筛网上，随后不断进行研磨，同时加入准备好的匀浆冲洗液，收集研磨液；
(c)将脾脏组织研磨液300g离心12min，弃去上清后重悬；
(d)将脾脏组织单细胞悬液与分离液混合，300g离心30min；
(e)向其中加入5mL洗涤液，将细胞混匀后300g离心12min，洗涤后弃去上清，重悬细胞；
(f)细胞计数。
2、实验结果
(1)血清特异性IgG的检测
在初次免疫后第12，28天收集小鼠血清，通过ELISA检测RBD特异性血清IgG效价。结果如图8所示，在初次免疫后的第12天，EBY100/pYD1-RBD 组诱导产生的RBD特异性血清IgG抗体效价高于PBS和EBY100/pYD1组， IgG滴度分别为22.6±0.55、23.2±045和25.8±0.84，加强免疫后(在初次免疫后的第 28天)，PBS和EBY100/pYD1组的RBD特异性血清IgG抗体效价没有发生明显变化，而EBY100/pYD1-RBD组的RBD特异性血清IgG抗体效价显著增加，达到210 ±0.71。ELISA结果表明，BABL/c小鼠口服免疫 EBY100/pYD1-RBD后能够产生具有统计学意义的体液免疫应答反应。
(2)分泌型IgA的检测
在初次免疫后第12，28天收集小鼠粪便，通过ELISA检测分泌型IgA 的OD450nm吸收值。结果如图9所示，在初次免疫的第12天，PBS、 EBY100/pYD1和EBY100/pYD1-RBD组的OD450nm吸收值分别为0.676± 0.089、0.322±0.051和0.269±0.069。在初次免疫的第28天，EBY100/pYD1-RBD组的OD450nm吸收值显著增加，为0.885±0.083，而PBS 和EBY100/pYD1组的OD450nm吸收值无明显变化。ELISA结果表明，BABL/c 小鼠口服免疫EBY100/pYD1-RBD后能够产生具有统计学意义的黏膜免疫应答反应。
(3)T淋巴细胞增殖分析
在初次免疫后第12，28天收集免疫后小鼠的脾细胞，并用RBD蛋白刺激，孵育36h后，用CCK-8试剂盒进行检测，从而评估T细胞的增殖情况。结果如图10所示，与PBS和EBY100/pYD1组相比，EBY100/pYD1-RBD组在第12天和第28天的OD450nm吸收值分别为0.725±0.038和1.186±0.049。 CCK-8结果表明，EBY100/pYD1-RBD经口服免疫BABL/c小鼠后能够诱导脾脏淋巴细胞增殖。
(4)细胞因子表达分析
收集免疫后小鼠的脾细胞，并用RBD蛋白刺激，孵育36h后，通过ELISA 检测刺激后IFN-γ和IL-4的分泌水平。结果如图11所示，与PBS和 EBY100/pYD1组相比，初次免疫12和28天后，EBY100/pYD1-RBD组的IL-4 分泌水平升高，IFN-γ分泌水平显著升高。
进一步地，通过流式细胞仪检测CD4+T细胞以及CD8+T细胞介导的 IFN-γ和IL-4的分泌水平。CD4+T细胞介导的IFN-γ和IL-4的分泌水平结果如图12所示，与PBS和EBY100/pYD1组相比，初次免疫后， EBY100/pYD1-RBD组的IFN-γ的分泌水平升高，而IL-4分泌水平虽有升高，但不具有统计学意义。加强免疫后，IL-4和IFN-γ的分泌水平均升高。CD8+T 细胞介导的IFN-γ和IL-4的分泌水平的结果如图13所示， EBY100/pYD1-RBD组在加强免疫后IFN-γ分泌水平明显升高，而IL-4分泌水平虽有升高，但不具有统计学意义。
ELISA和流式细胞仪分析结果表明，EBY100/pYD1-RBD能够诱导有意义的细胞免疫应答以及混合型Th1/Th2反应，并具有Th1偏向性，具有作为 COVID-19疫苗的潜力。
试验例4、微量中和实验
1、实验方法
按照试验例2的方法去免疫小鼠血清作为待检血清进行分析：
(1)使用SARS-CoV-2S蛋白和pNL4-3.Luc.R-E-质粒转染HEK293T细胞；
(2)48h后收集含有假病毒的上清培养液，无菌过滤，-80℃保存；
(3)SARS-CoV-2假病毒与待检血清共孵育后侵染ACE2-HEK293T细胞；
(4)5％CO2，37℃孵育72小时；
(5)采用化学发光法检测Luciferase发光值，根据Luciferase发光值计算抗体中和效价。
2、实验结果
结果如图14所示。在PBS和EBY100/pYD1组中未检测到明显的中和抗体，而EBY100/pYD1-RBD组在初次免疫后的中和滴度为44.8±17.527，加强免疫后的中和滴度为115.2±28.62。这表明，EBY100/pYD1-RBD可诱导产生有意义的抗体中和效价，EBY100/pYD1-RBD可作为有效的COVID-19亚单位疫苗。
综上，本发明本通过酵母表面展示系统，融合表达新型冠状病毒抗原基因RBD基因与凝集素受体亚单位Aga2基因，将RBD展示于酵母表面，成功制得了EBY100/pYD1-RBD重组酵母，可以作为新型的COVID-19亚单位疫苗。本发明的疫苗安全、有效、制备快速、使用方便，在COVID-19疫情防控中应用前景良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南交通大学
<120> 基于酵母表面展示系统的COVID-19亚单位疫苗
<130> GYKH1354-2021P0113086CCZ
<150> 2020105941276
<151> 2020-06-24
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 582
<212> DNA
<213> RBD
<400> 1
atgcctaata ttacaaactt gtgccctttt ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca 60
tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta 120
tataattccg catcattttc cacttttaag tgttatggag tgtctcctac taaattaaat 180
gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga 240
caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt gctgattata attataaatt accagatgat 300
tttacaggct gcgttatagc ttggaattct aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat 360
tataattacc tgtatagatt gtttaggaag tctaatctca aaccttttga gagagatatt 420
tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt 480
tactttcctt tacaatcata tggtttccaa cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac 540
agagtagtag tactttcttt tgaacttcta catgcaccat aa 582

Claims (10)

1.一种重组质粒，其特征在于：它是能够融合表达SARS-CoV-2抗原基因与凝集素受体Aga2亚基，得到融合蛋白的重组质粒；所述SARS-CoV-2抗原基因为RBD基因，序列如SEQ IDNO.1所示；所述Aga2亚基以C-末端与RBD基因融合。
2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述Aga2亚基与SARS-CoV-2抗原基因之间有接头序列，所述接头序列翻译得到的氨基酸序列为(G4S)3，所述(G4S)3为GGGGSGGGGSGGGGS。
3.如权利要求1或2所述的重组质粒，其特征在于：它以pYD1为骨架质粒，所述pYD1优选为Invitrogen生产的pYD1。
4.一种重组酵母，其特征在于：它是包含权利要求1～4任一所述重组质粒的酵母；所述酵母是S.cerevisiae EBY100。
5.如权利要求4所述的重组酵母，其特征在于：所述酵母与凝集素受体Aga1亚基连接，所述Aga1亚基与所述重组质粒连接；优选地，所述酵母与凝集素受体Aga1亚基通过β葡聚糖共价连接；和/或所述Aga1亚基与所述重组质粒通过二硫键共价连接。
6.权利要求4或5所述的重组酵母在制备COVID-19疫苗中的用途，优选地，所述疫苗为口服疫苗。
7.一种COVID-19亚单位疫苗，其特征在于：它是以权利要求4或5所述重组酵母为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
8.如权利要求7所述的疫苗，其特征在于：所述制剂为口服制剂。
9.一种制备权利要求3或4所述重组酵母的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建凝集素受体亚单位Aga2基因的C末端与SARS-CoV-2抗原基因融合的重组质粒；
(2)将重组质粒导入感受态酵母菌中，即可；
所述SARS-CoV-2抗原基因为RBD基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)的导入步骤如下：
1)用LiAc制备酵母菌菌悬液，0～10℃作用5～20min，得感受态酵母；
2)ssDNA煮沸5～20min，冷却；
3)将步骤1)得到的感受态酵母、步骤2)处理后的ssDNA、分子量大于3000的PEG与重组质粒在水中混匀，25～35℃下作用20～24min，40～25℃热激20～30min。
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