CN109082435A

CN109082435A - 一种预防寨卡病毒感染的口服疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN109082435A
Application number: CN201810373785.5A
Authority: CN
Inventors: 雷涵; 林文杰; 黄子恩; 张炜; 芩黔鸿
Original assignee: Southwest Jiaotong University
Current assignee: Southwest Jiaotong University
Priority date: 2017-04-24
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2018-12-25
Anticipated expiration: 2038-04-24
Also published as: CN109082435B

Abstract

本发明公开了一种预防寨卡病毒感染的口服疫苗及其制备方法。具体地，本发明公开了一种重组质粒，还公开了包含前述重组质粒的重组酵母菌，以及它在制备预防寨卡病毒感染的疫苗中的用途。本发明已经成功建立了包含寨卡病毒部分基因片段的重组酵母EBY100/pYD1‑prM‑Env，而且证实了prM‑Env可以在酵母中有效表达，并且进一步证明了重组酵母对寨卡病毒具有良好的免疫保护性，可以制备成为口服疫苗，应用前景优良。

Description

一种预防寨卡病毒感染的口服疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种预防寨卡病毒感染的口服疫苗及其制备方法。

背景技术

ZIKV归属于黄病毒科(Flaviviriade)，黄病毒属(Flavivirus)，是一种虫媒病毒，与登革热病毒(dengue virus，DENV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)及西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)同属。ZIKV具有传播速度快、波及范围广的特点。ZIKV于1947年首次在乌干达Zika森林的恒河猴中发现。2007年4-7月，位于西太平洋密克罗尼西亚的Yap岛上185例ZIKV感染者出现发热、头痛、皮疹、结膜炎和关节痛等症状。最终，ZIKV导致Yap岛上73％的居民被感染，这是有记载历史以来最大的一次ZIKV感染人类事件。此后，该病毒处于异常活跃状态，2013-2014年，法属波利尼西亚爆发ZIKV疫情，当地约11％的居民被感染。2015-2016年，ZIKV疫情主要发生在南美洲的巴西。令人担忧的是，我国大陆地区在2016年2月9日确诊了首例ZIKV感染输入性病例，ZIKV输入性病例的持续发现严重威胁我国的公共卫生安全。鉴于ZIKV疫情的严重程度，2016年2月1日，世界卫生组织(WHO)将ZIKV感染列为“国际关注的公共卫生紧急事件”。

大多数ZIKV感染病例不会表现出明显的临床症状，仅约20％的ZIKV感染病例会产生发热、皮疹、关节痛、结膜炎等症状。因此，在2007年ZIKV疫情爆发之前，ZIKV并没有完全进入科学家们的研究视野。但是随着最近研究的不断深入，ZIKV对神经系统潜藏着巨大的危害。目前，至少有两种疾病：胎儿小头畸形(microcephaly)和格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome)，与ZIKV感染存在关联。2015年10月，科研人员首次从巴西出生的一例小头畸形(microcephaly)的新生儿身上分离出了ZIKV[7]，并提出了ZIKV感染与小头畸形(microcephaly)之间存在关联。与此同时，斯洛文尼亚的研究人员从小头畸形死亡胎儿的脑组织中检测到了ZIKV，并通过测序获得了该病毒的全基因序列。Cugola FR等通过构建ZIKV感染的C57BL/6或SJL孕鼠模型，找到了来源于巴西的ZIKV(ZIKVBR)与胎儿小头畸形之间的关键证据，ZIKV能穿过SJL孕鼠的胎盘并促使大脑皮层前体细胞死亡，抑制大脑类器官的发育，但是ZIKVBR并不能穿过C57BL/6孕鼠的胎盘。Miner JJ等构建了两种ZIKV感染动物模型。第一种是I型干扰素缺失的C57BL/6雌性小鼠(Ifnar1-/-C57BL/6female mice)模型，该模型在ZIKV感染后，病毒主要分布在脑部和脊髓，最终导致小鼠死亡。为了探讨ZIKV感染后的胚胎生长状况，Ifnar1-/-雌鼠与野生型(wild-type，WT)雄性小鼠交配后，在孕后的第6.5或7.5天，Ifnar1-/-雌性孕鼠经足底注射103(focus forming unit，FFU)的ZIKV悬液，在第13.5天或15.5天检测胎儿的发育情况，结果表明在ZIKV感染后的第7天，在孕鼠的血液、肾、脑以及胎盘都能检测到ZIKV RNA，孕后的第15.5天胎儿死亡。利用同样的方法检测了第二种动物模型，野生型(WT)雌性C57BL/6小鼠注射抗干扰素单克隆抗体(MAR1-5A3)后，经ZIKV感染，在怀孕后的第16.5天，在孕鼠的血液、肾、脑以及胎盘检测到了ZIKV RNA，但是胎儿并未死亡，而且第二种动物模型对ZIKV的敏感性与MAR1-5A3的注射剂量存线性关系。这两种动物模型既可以应用于ZIKV致畸性的研究，也可以用于检测抗病毒药物或疫苗在预防ZIKV诱发的先天性畸形中的作用。我国科研人员以ICR小鼠为模型研究亚洲谱系的ZIKV SZ01的致病性，也获得了类似的结果。将1μl ZIKV SZ01(浓度为：6.5×105PFU/ml)注射至怀孕13.5天的ICR小鼠的侧脑室，结果表明ZIKV可以感染神经前体细胞(neural progenitor cells，NPCs)并造成其增殖与分化异常，另外还检测到小头畸形(microcephaly)相关基因表达下调，并最终导致胎儿小头畸形(microcephaly)。Garcez PP等通过免疫组化和电子显微镜进一步证实了ZIKV可以感染人神经干细胞、神经球和大脑类器官(brain organoids)，使神经球和大脑类器官的生长速度降低了40％，并诱导细胞死亡，导致神经球和大脑类器官畸形，该研究有助于阐述ZIKV致小头畸形(microcephaly)的病因。除此之外，ZIKV感染还与格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome，GBS)存在关联。GBS是一种自身免疫性疾病引起的急性脱髓鞘多发性神经炎，临床上表现为进行性、上升性、对称性麻痹和四肢软瘫以及不同程度的感觉障碍，严重时导致死亡。2013年10月至2014年4月法属波利尼西亚暴发ZIKV疫情，有42例GBS确诊病例，其中41例伴有ZIKV IgM或IgG抗体阳性。2015年11月到2016年3月，在哥伦比亚观察到68例格林-巴利综合征，其中66例与ZIKV感染有关。可以预见的是，随着ZIKV疫情的蔓延，会出现较多的GBS病例。综上所述，ZIKV感染与小头畸形(microcephaly)和GBS存在密切的关联性。

尽管对ZIKV的致病机制有了一定深度的研究，但是非常遗憾的是，目前没有有效的抗病毒药物或疫苗用于治疗或预防ZIKV感染。众所周知，ZIKV结构的解析有助于推动药物或疫苗研发的进程。

ZIKV是一种单股正链RNA病毒，基因组不分节段，整个基因组长度约10.7kb，共编码10个蛋白，其中3个结构蛋白：衣壳蛋白(Capsid，C)、前膜蛋白/膜蛋白(Precursormembrane/membrane，prM/M)和包膜蛋白(Envelope,Env)；7个非结构蛋白：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5。美国普渡大学(Purdue University)和美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)国家过敏症与传染病研究所(NIAID)的研究人员通过冷冻电子显微镜(cryo-electron microscopy)首次解析出ZIKV(H/PF/2013)在分辨率下的结构。ZIKV的结构与其它黄病毒科病毒相似，病毒的外壳是由高达180个拷贝的两种不同蛋白(即包膜蛋白和膜蛋白)组成，区别就在于病毒外壳的一个糖基化位点附近的氨基酸上存在差异。ZIKV外壳上的Asn154糖基化位点向外延伸，由多种糖分子组成的糖类物质通过Asn154糖基化位点附着到ZIKV的表面，人细胞表面上的附着受体分子能够识别并与ZIKV表面的糖类物质结合，从而开启ZIKV感染模式。因此，ZIKV表面特殊的糖基化位点可以作为一个靶标，用于设计抗病毒化合物，从而阻止ZIKV附着并感染人细胞。与此同时，杜克-新加坡国立大学医学院(Duke-NUS)的研究人员也通过冷冻电子显微镜(cryo-electronmicroscopy)分析了ZIKV(H/PF/2013)在分辨率下结构，发现ZIKV的整体结构与登革热病毒(dengue virus，DENV)和西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)等黄病毒科病毒结构相似，但是ZIKV的包膜蛋白(Envelope，Env)具有更紧密的相互作用，使得它比登革热病毒(DENV)更加稳定。研究人员发现ZIKV即便在40℃(模拟被ZIKV感染后高烧患者的体温)下孵育时，ZIKV在结构上也是稳定的。这就使得ZIKV可能在诸如精子、唾液和尿液之类的严峻环境中存活下来。ZIKV结构的稳定性也使得ZIKV除了通过蚊子叮咬传播外，还可以通过性接触进行传播，而西尼罗病毒(WNV)和登革热病毒(DENV)不能够通过性接触进行传播。因此，针对ZIKV结构特点设计特定的抗体或药物，可以有效地阻断ZIKV感染或者限制它的扩。Liang Q等发现ZIKV可以阻断人胎儿神经干细胞(fetal neural stem cells，fNSCs)的Akt-mTOR信号通路，进而抑制神经发育和自噬调控。通过对ZIKV的10个蛋白进行筛选，最终发现两个非结构蛋白NS4A和NS4B协同抑制Akt-mTOR信号通路并导致细胞功能失调。我国科学家高福院士领导的研究团队利用X射线分析了ZIKV NS1的C末端片段的晶体结构。研究人员发现ZIKV NS1的表面电荷分布与西尼罗病毒(WNV)和登革热病毒(DENV)差异显著，ZIKVNS1具有独特的表面静电特性，这一特征可以改变ZIKV与宿主因子和抗NS1抗体的结合特性。基于ZIKV NS1表面结构特点，既可以开发出新的诊断工具，又可以开发抗病毒药物。随着ZIKV结构的深度解析，各种有效的药物或疫苗会不断涌入临床试验。

事实上，为了应对ZIKV突如其来的挑战，有的科学家专注于ZIKV致病性研究与结构解析，而有的科学家则专注于开发有效的抗病毒药物和疫苗。Fernanda R等考察了prM与Env不同组合的质粒DNA疫苗以及ZIKV灭活疫苗(PIV)在Balb/c、SJL、C57BL/6三种不同小鼠模型上的免疫保护效率。结果表明prM-Env DNA疫苗和PIV疫苗通过单次肌肉注射分别免疫三种动物模型后均能够提供完全保护。Dowd KA等也构建了prM-Env DNA疫苗，并在小鼠和非灵长类动物模型上检测了能预防病毒血症的中和抗体。与此同时，Abbink P等构建的prM-Env DNA疫苗在恒河猴(rhesus monkeys)动物模型上也获得了类似的结果。Kim E等利用腺病毒作为骨架构建了Ad5.ZIKV-Efl和MNA-ZIKV-rEfl疫苗，并在C57BL/6小鼠模型上检测了这两种疫苗的免疫原性，ZIKV病毒致死性攻击实验表明这两种疫苗都能提供100％免疫保护。在新出生的幼鼠中，Ad5.ZIKV-Efl提供100％保护的，而MNA-ZIKV-rEfl的保护率为50％。Xie X等通过交换ZIKV和DENV-2的prM-Env基因构建了具有很高的免疫原性的CHV-I和CHV-II两种嵌合病毒，证实了prM-Env蛋白决定了病毒的热稳定性，这两种嵌合病毒可以用于开发ZIKV疫苗。另外，来源于人胎盘滋养层细胞的III型干扰素可以阻断ZIKV感染，这为预防ZIKV感染可提供新的策略。Sapparapu G等从ZIKV感染的康复者中筛选出ZIKV-117单克隆抗体，该抗体具有很强的中和活性，在小鼠模型上能够明显地降低ZIKV的致病性。我国科学家也从ZIKV感染的康复者中分离得到三株抗体(Z20、Z3L1和Z23)。这三株抗体通过结合Env蛋白的不同结构域而影响膜融合过程中Env蛋白构象变化，最终阻断ZIKV感染，这为人类防治ZIKV提供了重要的抗体药物支撑。综上所述，就ZIKV疫苗的有效性而言，灭活疫苗[24]、DNA疫苗[24-26]和以病毒为载体的疫苗[27，28]可以有效地预防ZIKV感染，但是这些候选疫苗在安全性方面存在隐患。

疫苗的核心是安全性、有效性和时效性。如何在三者之间找寻一个平衡点，是从事疫苗开发的研究人员需要直面的一个的挑战。研究证实，基于非病毒递送载体开发的黏膜疫苗展现出非常诱人的应用潜能。

酵母表面展示系统在抗体筛选、疫苗工程领域有着广泛的应用。根据酵母种类的不同可分为：酿酒酵母展示系统、毕赤酵母展示系统、解脂耶罗威亚酵母展示系统等，其中，酿酒酵母展示系统较为安全。Wang Z等发现以商品化的pYD1为基础的C末端表面展示的抗体活性很低，为此，他们将pYD1载体进行改造获得N末端展示质粒pYD5，并将单链抗体以N末端游离的方式展示在酿酒酵母的表面，结果发现Huntingin蛋白的C末端只与ScFV的可变轻链结构域结合，并且抗体活性很高，以此开发出抗Huntingin蛋白的人单可变轻链结构域细胞内抗体，为治疗亨特氏综合症提供了新的方法。该研究带来的提示是，可以根据被展示蛋白的特性选择C末端或N末端展示，将会获得不同的表达效果。

发明内容

本申请基于高效、稳定以及安全的酿酒酵母(S.cerevisiae EBY100)表面展示技术平台，根据Zika virus/SZ01/2016的prM-Env或Env蛋白末端处于不同游离状态时产生不同免疫效率的特性，构建酿酒酵母C末端表面展示系统(EBY100/pYD1-prM-Env、EBY100/pYD1-Env)和酿酒酵母N末端展示系统(EBY100/pYD5-prM-Env、EBY100/pYD5-Env)。在不使用黏膜免疫佐剂的情况下，通过肠溶胶囊包裹冷冻干燥后的ZIKV疫苗，口服免疫SJL小鼠。检测免疫后SJL小鼠的体液免疫应答、黏膜免疫应答和细胞免疫应答水平。通过不同来源的ZIKV进行攻击分析，检测并比较酿酒酵母C末端表面展示系统和N末端表面展示系统的交叉免疫保护效果。进一步地，以I型干扰素缺失的C57BL/6雌性小鼠(Ifnar1-/-C57BL/6femalemice)为动物模型，重点考察ZIKV疫苗在孕鼠中对胎儿发育的免疫保护效率。最终研发出以酿酒酵母表面展示系统为递送载体的ZIKV口服疫苗，为将来ZIKV口服疫苗进入临床前期大型动物实验或临床试验提供可行的方案和可靠的数据支撑。这一技术平台的建立将为世界防控ZIKV提供强有力的保障，也为设计和研发它病毒或细菌口服疫苗提供新的思路和策略。本发明的目的在于提供一种碳纤维/聚苯硫醚复合材料。

具体地，本发明提供了一种重组质粒，它是含有SEQ ID NO：1(prM-Env蛋白的核苷酸序列)或者SEQ ID NO：2(Env蛋白的核苷酸序列)所述核苷酸序列的重组pYD1质粒或者重组pYD5质粒。

本发明还提供了一种重组酵母菌，它是含有前述重组质粒的酵母菌。优选地，所述酵母菌是S.cerevisiae EBY 100。

本发明还提供了前述重组酵母菌在制备预防寨卡病毒感染的疫苗中的用途。其中，所述疫苗为口服疫苗。

本发明还提供了一种预防寨卡病毒感染的疫苗，它是以前述的重组酵母菌为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

其中，所述制剂是口服制剂。优选地，所述辅助性成分为肠溶性胶囊。

本发明还提供了一种制备预防寨卡病毒感染的重组酵母菌的方法，步骤如下：

(1)取寨卡病毒的基因或者基因片段，与pYD1质粒或者pYD5质粒连接；

(2)导入感受态酵母菌中，即可。

步骤(1)中，所述寨卡病毒的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或者SEQ IDNO：2所示。

步骤(2)中，所述酵母菌为S.cerevisiae EBY 100。

本发明已经成功建立了包含寨卡病毒部分基因片段的重组酵母EBY100/pYD1-prM-Env，而且证实了prM-Env可以在酵母中有效表达，并且进一步证明了重组酵母对寨卡病毒具有良好的免疫保护性，可以制备成为口服疫苗，应用前景优良。

本发明的优势：

(1)安全性。pYD1和pYD5作为大肠杆菌-酿酒酵母的穿梭质粒，含有的氨苄青霉素抗性标记只在中间宿主E.coli DH5α中发挥作用，当带有目标基因的pYD1和pYD5整合到酿酒酵母EBY100的基因组时，抗性标记随即丢失。因此，通过pYD1和pYD5构建的酿酒酵母表面展示系统是食品级的，这为ZIKV口服疫苗的安全性奠定了坚实的物质基础。

(2)有效性。本申请巧妙地选择了ZIKV病毒具有中和作用的prM-Env或Env蛋白作为研究对象，并根据prM-Env或Env蛋白的C末端或N末端处于不同游离状态时产生不同的免疫效率的特性，利用稳定、成熟的酿酒酵母表面展示技术，构建C末端表面展示展示系统和N末端表面展示展示系统。

(3)时效性。酿酒酵母表面展示技术可以应用于快速、大规模地制备ZIKV疫苗。从载体构建到酵母的大规模培养，只需要约15天就可完成，这为预防ZIKV感染提供了可靠的战略保障。而且整个操作过程不要特殊的实验条件，在生物安全二级(BSL II)实验室就可完成。

(4)酿酒酵母EBY100是一种直径约10μm的圆球形真核单细胞，非常有利于荧光标记，通过免疫荧光显微镜和流式细胞仪可以准确地分析目标蛋白在酿酒酵母EBY100表面的展示效率。

综上，本发明制备得到可以有效表达寨卡病毒的免疫原的重组酵母，且实验证实了其具有免疫保护活性，安全性良好，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.以酿酒酵母C末端表面展示系统为基础的ZIKV疫苗模式图。Zika virus/SZ01/2016的prM-Env或Env蛋白通过表达质粒pYD1展示在S.cerevisiae EBY100表面，prM-Env或Env蛋白的C末端处于游离状态。A:EBY100/pYD1-prM-Env；B:EBY100/pYD1-Env。图2.以酿酒酵母N末端表面展示系统为基础的ZIKV疫苗模式图。Zika virus/SZ01/2016的prM-Env或Env蛋白通过表达质粒pYD5展示在S.cerevisiae EBY100表面，prM-Env或Env蛋白的N末端处于游离状态。A:EBY100/pYD5-prM-Env；B:EBY100/pYD5-Env。

图3.EBY100/pYD1-prM-Env诱导48小时的表达分析。A：Western blot分析。Lane1：Western blot marker(Precision Plus Protein^TM，Bio-rad)；Lane 2：EBY100/pYD1-prM-Env；Lane 3：去糖基化酶PNGase F处理过的EBY100/pYD1-prM-Env。B：免疫荧光分析。阴性对照EBY100/pYD1(左)，EBY100/pYD1-prM-Env(右)。放大倍数：400×。C：流式细胞仪分析。阴性对照EBY100/pYD1(左)，EBY100/pYD1-prM-Env(右)。10,000细胞被计数。

图4肠溶胶囊包裹荧光素Cy5.5标记的EBY100/pYD1-prM-Env在小鼠体内的动态崩解过程。A：口服40分钟后的图像。B：口服60分钟后的图像。C：口服80分钟后的图像。D：荧光强度指示带。

图5.表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope模式图。Zika/SZ01/2016的Envelope(包膜)蛋白通过表达质粒pYD1展示在酿酒酵母EBY100表面。

图6.三种免疫方案示意图。

图7.PCR扩增Envelope基因。Lane1：DNA marker DL2000。Lane2：Envelope基因。

图8.重组质粒pYD1-Envelope的酶切鉴定电泳图。Lane 1:DNA marker(100-5000bp)，Lane 2:从E.coli DH5α/pYD1-Envelope提取重组pYD1-Envelope，经Hind III/EcoR I双酶切后的电泳图。

图9.以表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope基因组DNA为模板的PCR鉴定电泳图。Lane 1:DNA marker(DL2,000)，Lane 2:通过引物F1与R1扩增得到的PCR产物。

图10.表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope的Western blot分析。Lane1：蛋白Marker 25KD～250KD.Lane2：EBY100/pYD1-Envelope的沉淀裂解物。Lane3：EBY100/pYD1-Envelope的上清。Lane4：EBY100/pYD1的沉淀裂解物。Lane5：EBY100/pYD1的上清。Lane6：阳性对照Envelope标准抗原蛋白。

图11.表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope的免疫荧光分析。A：阴性对照EBY100/pYD1。B:EBY100/pYD1-Envelope。(放大倍数：400×)。

图12.表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope的流式细胞仪分析。A：阴性对照EBY100/pYD1。B:EBY100/pYD1-Envelope。每个实验分析了20,000个细胞。

图13.ELISA检测三种免疫方案诱发的Envelope特异性血清IgG效价。A：通过Regimen1方案免疫后的IgG抗体效价。B：通过Regimen2方案免疫后的IgG抗体效价。C：通过Regimen3方案免疫后的IgG抗体效价。*表示与对照组(PBS、EBY100/pYD1)相比较，实验组(EBY100/pYD1-Envelope)具有统计学意义(p<0.05)。每组5只小鼠。

图14.ELISA检测三种免疫方案诱发的Envelope特异性血清IgM效价。A：通过Regimen1方案免疫后的IgM抗体效价。B：通过Regimen2方案免疫后的IgM抗体效价。C：通过Regimen3方案免疫后的IgM抗体效价。*表示与对照组(PBS、EBY100/pYD1)相比较，实验组(EBY100/pYD1-Envelope)具有统计学意义(p<0.05)。每组5只小鼠。

图15.ELISA检测三种免疫方案诱发的Envelope特异性IgA效价。A：通过Regimen1方案免疫后IgA抗体的OD_450nm光吸收值。B：通过Regimen2方案免疫后IgA抗体的OD_450nm光吸收值。C：通过Regimen3方案免疫后IgA抗体的OD_450nm光吸收值。*表示与对照组(PBS、EBY100/pYD1)相比较，实验组(EBY100/pYD1-Envelope)具有统计学意义(p<0.05)。每组5只小鼠。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。

本申请中，Envelope基因即为Env基因。

实施例1本发明寨卡口服疫苗的制备方法

一、方法

本申请以酿酒酵母的a-凝集素表面展示系统为基础，根据Zika virus/SZ01/2016(基因库编号：KU866423.2)的的prM-Env蛋白(578个氨基酸，基因长度：1734bp，氨基酸序列和核苷酸序列见附件1，SEQ ID NO：1所示序列)或Env蛋白(504个氨基酸，基因总长度：1515bp，氨基酸序列和核苷酸序列见附件2，SEQ ID NO：2所示序列)的末端(C末端或N末端)处于不同游离状态时产生不同免疫效率的特性，通过pYD1将prM-Env或Env蛋白展示在酿酒酵母EBY100的表面，此时prM-Env或Env蛋白C末端处于游离状态，以此构建以酿酒酵母C末端表面展示系统为基础的ZIKV疫苗(如图1所示)。同理，通过pYD5将prM-Env或Env蛋白展示在酿酒酵母EBY100的表面，此时prM-Env或Env蛋白N末端处于游离状态，以此构建以酿酒酵母N末端表面展示系统为基础的ZIKV疫苗(如图2所示)。在不使用黏膜免疫佐剂的情况下，图1或图2中各种构建经冷冻干燥后，通过肠溶胶囊包裹，口服免疫Specific pathogenfree(SPF)级SJL小鼠，系统地检测与分析酿酒酵母表面展示系统作为ZIKV疫苗递送载体的免疫活性，最终研发出安全、有效并具有免疫保护作用的ZIKV疫苗。进一步地，以SPF级I型干扰素缺失的C57BL/6雌性小鼠(Ifnar1^-/-C57BL/6female mice)为模型，重点考察ZIKV疫苗在孕鼠中对胎儿发育的免疫保护效率。为开发其它病毒或疫苗提供新的、可行的方案。具体研究内容如下：

(1)基于酿酒酵母表面展示系统构建ZIKV疫苗

本申请基于ZIKV抗原蛋白的末端(C末端或N末端)在不同游离状态时产生不同免疫效率作为研究出发点，以Zika virus/SZ01/2016的prM-Env或Env蛋白作为研究对象，通过常规的分子生物学方法构建酿酒酵母C末端表面展示系统(如图1所示)和N末端表面展示系统(如图2所示)。以图1的EBY100/pYD1-prM-Env为例，简述构建过程。该系统包括：Zikavirus/SZ01/2016的prM-Env基因(基因长度：1734bp，编码578个氨基酸)、适用于目标蛋白C末端展示的表达质粒pYD1、中间宿主菌E.coli DH5α、最终宿主S.cerevisiae EBY100。首先，通过PCR获得特异性prM-Env基因片段。其次，通过特异性酶切位点(Nhe I/EcoR I)，构建重组表达质粒pYD1/prM-Env，并转化至感受态E.coli DH5α，筛选阳性克隆。然后，将鉴定好的重组表达质粒pYD1/prM-Env电转至感受态S.cerevisiae EBY100，重组表达质粒pYD1/prM-Env最终整合至S.cerevisiae EBY100基因组中，pYD1/prM-Env本身携带的氨苄青霉素标记丢失。最后，通过氨基酸营养缺陷筛选出阳性EBY100/pYD1-prM-Env，并通过PCR和DNA测序进行鉴定。

需要说明的是，pYD1作为酿酒酵母(S.cerevisiae)表面展示型表达质粒之一，是一个长度为5.0kb、含有GAL1启动子、可以在大肠杆菌-酵母中穿梭的诱导型质粒，含有来源于酿酒酵母的AGA2基因，可以编码a-凝集素的一个结合受体Aga2，其功能是将目标蛋白的N末端与Aga2的C末端融合。宿主S.cerevisiae EBY100编码Aga1蛋白，Aga1与Aga2通过二硫键连接，最终将目标蛋白的C末端展示在EBY100的表面(如图1所示)。值得一提的是，在本申请中，我们将在进行引物设计时，巧妙地利用pYD1上的多克隆酶切位点，规避pYD1质粒上固有的Xpress、V5epitope以及His tag的表达标签，从而重点考察目标蛋白的展示效率。

与酿酒酵母C末端表面展示系统构建的方法相似，通过pYD5构建酿酒酵母N末端表面展示系统(如图2所示)。需要说明的是，pYD5(由Neville DM Jr博士提供)是从商业化的pYD1改造而来，适用于目标蛋白的N末端展示。

与此同时，构建EBY100/pYD1和EBY100/pYD5，作为平行实验中的阴性对照。

需要强调的是，在构建重组表达质粒时，目标蛋白(prM-Env或Env)和Aga2之间的(G₄S)₃linker(甘氨酸-丝氨酸柔性肽)是表达质粒pYD1和pYD5本身固有的。因此，本申请不需要再对pYD1和pYD5进行改造，只需要设计特异性的PCR引物，将目标基因克隆至相应的位点即可。

(2)目标蛋白的体外诱导表达与定位分析

将构建好的酿酒酵母表面展示系统经2％(m/v)的半乳糖诱导后，对prM-Env或Env目标蛋白的表达进行定性和定量分析。优化诱导表达条件、通过Western blot检测prM-Env或Env目标蛋白的特异性表达。通过去糖基化酶处理，利用Western blot分析酿酒酵母翻译后的糖基化修饰。通过免疫荧光显微镜和流式细胞仪分析确定prM-Env或Env目标蛋白的表达位置和展示效率。通过单向免疫扩散和BCA蛋白定量分析试剂盒测定prM-Env或Env目标蛋白的表达量。最终明确prM-Env或Env目标蛋白在酿酒酵母中的定位及表达效率。

(3)样品处理

将图1和图2中的各种构建置于60℃水浴锅中，处理40分钟，并将最终浓度调整至0.5OD₆₀₀nm/μl(1OD₆₀₀≈10⁷cells)，用于后续实验。

(4)目标蛋白稳定性检测

将诱导后的酿酒酵母表面展示系统各种构建经冷冻干燥后，分别置于不同储存温度(4℃或25℃)和不同时间(3天、7天、10天、14天和21天)，通过Western blot分析prM-Env或Env目标蛋白在酿酒酵母EBY100表面的稳定性。

(5)ZIKV疫苗在动物体内的驻留时间

利用荧光素Cy5.5对酿酒酵母表面EBY100的目标蛋白进行标记，通过小动物专用肠溶胶囊包裹后，输送至SJL小鼠的胃部。通过小动物活体光学成像仪观察荧光素标记的重组酿酒酵母在肠溶胶囊崩解后的释放过程。

(6)口服免疫优化

以SPF级的SJL小鼠作为动物模型，优化口服免疫时间、免疫次数以及以免疫剂量，从而摸索出ZIKV疫苗的最优免疫条件。以EBY100/pYD1-prM-Env(图1A)为例，在不使用黏膜免疫佐剂的前提下，重点考察三个不同免疫剂量(60OD_600nm、90OD_600nm和180OD_600nm)冷冻干燥后，通过小动物专用肠溶胶囊(型号：2^#)包裹，口服免疫SPF级SJL小鼠，通过ELISA检测口服免疫后小鼠的prM或Env特异性血清IgG效价，最终摸索出最优的免疫剂量和免疫次数。

二、具体操作方法

(1)酿酒酵母C末端表面展示系统和N末端表面展示系统的构建

利用常规的分子生物学方法构建酿酒酵母C末端表面展示系统(EBY100/pYD1-prM-Env、EBY100/pYD1-Env)和N末端表面展示系统(EBY100/pYD5-prM-Env、EBY100/pYD5-Env)。以图1A的EBY100/pYD1-prM-Env为例，商业化的pYD1(美国Invitrogen公司)作为酿酒酵母EBY100的表达质粒，适用于目标蛋白的C末端展示。其主要构建过程如下：第一步：以pGEM-prM-Env为模板，在上游引物中设计Nhe I酶切位点，下游引物设计EcoR I酶切位点并含终止密码子(TAA)，通过PCR反应、Nhe I/EcoR I双酶切、割胶回收获得prM-Env基因片段。与此同时，对表面展示型表达质粒pYD1进行Nhe I/EcoR I双酶切、割胶回收。第二步：将NheI/EcoR I双酶切后pYD1与prM-Env基因进行连接，转化至感受态E.coli DH5α，并涂布于LB固体培养基，通过氨苄青霉素筛选阳性克隆。第三步：将鉴定为阳性克隆的pYD1/prM-Env质粒进行双酶切和测序分析，确定目标基因序列的完整性。第四步：将该阳性重组质粒pYD1/prM-Env电转至感受态S.cerevisiae EBY 100，并涂布于酵母筛选固体培养基(0.67％yeast nitrogen base without amino acids(YNB),2％glucose,0.01％leucine,2％agar,和1M sorbitol)。第五步：筛选Trp⁺阳性克隆，提取基因组DNA，对阳性克隆进行PCR鉴定。最终获得EBY100/pYD1-prM-Env。

同理，利用同样的双酶切位点(Nhe I/EcoR I)，参照酿酒酵母C末端表面展示系统的构建过程，可以成功地构建EBY100/pYD1-Env和酿酒酵母N末端表面展示系统(EBY100/pYD5-prM-Env、EBY100/pYD5-Env)。

再次强调，图1和图2中目标蛋白(prM-Env或Env)和Aga2之间的(G₄S)₃linker(甘氨酸-丝氨酸柔性肽)是表达质粒pYD1和pYD5本身固有的。

以图1A的EBY100/pYD1-prM-Env为例，对以下研究方法进行阐述。与此同时，以EBY100/pYD1作为阴性对照。

(2)目标蛋白的定性与定位分析

诱导培养：EBY100/pYD1-prM-Env单克隆接种于含有2％(m/v)葡萄糖的YNB-CAA(0.67％yeast nitrogen base without amino acids(YNB),2％glucose,13.61g/LNa₂HPO₄,7.48g/L NaH₂PO₄和5g/L casamino acids)培养液中，30℃、250rpm培养18小时。通过紫外分光光度计测定OD₆₀₀nm值，并将该数值调整为OD₆₀₀nm＝0.75，加入新鲜的YNB-CAA培养液(2％(m/v)葡萄糖被2％(m/v)半乳糖替代)，20℃、250rpm培养。诱导表达后，收集不同时间点(0h、24h、36h、48h、72h)的EBY100/pYD1-prM-Env上清和沉淀。

Western blot分析：对1OD_600nm(1OD_600nm≈10⁷cells)的EBY100/pYD1-prM-Env进行Western blot分析。首先，利用4-15％的SDS-PAGE预制胶进行电泳(200伏，45分钟)。然后，通过湿转法(150伏，1小时)，将目标蛋白转移至0.45μm孔径的硝酸纤维素膜。接着，PBS-T含0.5％的脱脂奶粉作为封闭液，对转移膜常温封闭1小时，再用多克隆小鼠抗prM血清或Env血清(1:500稀释)4℃孵育过夜，PBS-T漂洗过后，用HRP标记的羊抗小鼠IgG(1:5,000稀释)孵育。最后，与West Pico化学发光底物进行反应，通过凝胶成像系统(ChemiDoc XRSSystem，Bio-Rad)进行分析。通过成像图片，可以清晰地知晓目标蛋白的表达是否具有特异性。与此同时，与Western blot标准蛋白Marker比较，就可以大致知道目标蛋白的分子量。

去糖基化分析：用去糖基化酶PNGase F(美国England Labs公司)对1OD_600nm的EBY100/pYD1-prM-Env进行处理，而后参照上述Western blot步骤进行分析。

免疫荧光分析(Immunofluorescence assay)：首先，对1OD_600nm的EBY100/pYD1-prM-Env进行离心，获得沉淀。其次，利用1:500稀释的多克隆小鼠抗prM血清或Env血清(一抗)对EBY100/pYD1-prM-Env进行直接标记(4℃，30分钟)。然后，用无菌PBS进行漂洗。接着，利用1:5,000稀释的FITC标记的羊抗小鼠IgG进行标记(4℃，30分钟)。最后，用360μl无菌PBS重悬。其中，10μl样品通过荧光显微镜(Nikon DFM-70D)进行免疫荧光分析(Immunofluorescence assay)。其余350μl样品通过流式细胞仪进行分析。

流式细胞仪分析(Flow cytometry assay)：将免疫荧光分析中剩余的350μl样品通过流式细胞仪(BD FACS Aira III)进行分析。

最终，通过Western blot可以确定prM-Env蛋白在酿酒酵母EBY100中的特异性表达。在此基础上，通过免疫荧光标记和流式细胞仪对EBY100/pYD1-prM-Env的表面进行分析，就可以确定prM-Env蛋白是否定位在酿酒酵母EBY100的表面。

(3)目标蛋白的定量分析

为了给后续的动物免疫实验提供准确的剂量参考，需要对目标蛋白的进行定量测定。

单向免疫扩散实验(single immunodiffusion)：首先，将已知浓度的抗prM血清或Env血清(标准血清)均匀地混合于琼脂糖凝胶内，平铺于载玻片上，打孔(10mm)。然后，加入已知浓度的prM-Env标准抗原，制备标准曲线。接着，巯基乙醇(1.5mol/L)处理过的EBY100/pYD1-prM-Env上清作为待测抗原，加入含有标准血清的载玻片上。最后，孔中待测样品的抗原辐射状向含抗体的胶内扩散，至抗原与抗体的量达一定比例时形成可见的沉淀环。结果判断根据待测抗原在含抗血清免疫扩散板上形成的沉淀环直径，查标准曲线即可行相应抗原的含量。以巯基乙醇(1.5mol/L)处理过的EBY100/pYD1上清作为阴性对照。

BCA法：通过酵母细胞表面可溶性蛋白提取试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)对EBY100/pYD1-prM-Env和EBY100/pYD1分别进行处理。最后，通过BCA蛋白定量分析试剂盒(Thermo Scientific Pierce)对prM-Env蛋白的浓度进行测定。

(4)目标蛋白稳定性检测

将EBY100/pYD1-prM-Env分别置于不同储存温度(4℃或25℃)，在第3天、7天、10天、14天和21天，通过Western blot分析prM-Env蛋白在酿酒酵母EBY100表面的稳定性。

类似地，可以对EBY100/pYD1-Env进行上述分析。酿酒酵母N末端表面展示系统(EBY100/pYD5-prM-Env、EBY100/pYD5-prM-Env)参照EBY100/pYD1-prM-Env的定性与定量分析方法，以EBY100/pYD5作为阴性对照。

(5)肠溶胶囊包裹ZIKV疫苗的口服递送

样品处理:将EBY100/pYD1-prM-Env置于60℃水浴锅中，处理40分钟，并将最终浓度调整至0.5OD₆₀₀nm/μl(1OD₆₀₀≈10⁷cells)。置于4℃保存，待用。

胶囊信息：本申请将使用2^#小动物专用肠溶胶囊(购买于广东强基药业有限公司)，每次包裹实验前，都要随机抽取10粒空心肠溶胶囊进行体外耐酸和崩解实验，确保100％合格。每个肠溶胶囊的最大装载量为150mg(相当于120μl ZIKV疫苗冷冻干燥后的干粉重量)。

ZIKV疫苗释放过程：利用1μl荧光素Cy5.5对EBY100/pYD1-prM-Env进行标记，通过小动物专用肠溶胶囊包裹后，输送至SJL小鼠的胃部。通过小动物活体光学成像仪观察荧光素标记的重组酿酒酵母在肠溶胶囊崩解后的释放过程。

免疫计划：本申请将使用6-8周SPF级SJL小鼠，15只/组，重点考察三个剂量(60OD₆₀₀nm＝120μl，90OD₆₀₀nm＝180μl，180OD₆₀₀nm＝360μl)冷冻干燥后经肠溶胶囊包裹后的免疫效率。以考察60OD₆₀₀nm＝120μl＝1粒胶囊为例，口服胶囊数量：1粒/天，具体免疫计划见表1。

表1.免疫计划(以考察60OD₆₀₀nm为例)

胶囊递送：通过灌胃针将包裹ZIKV疫苗的肠溶胶囊轻轻推至SJL小鼠的胃部。

三、实验结果

(1)ZIKV的prM-Env蛋白成功地展示在酿酒酵母EBY100表面

在前期预实验中，我们成功地构建了EBY100/pYD1-prM-Env，并在EBY100/pYD1-prM-Env诱导48小时后对目标蛋白prM-Env的定位表达做了分析。

通过Western blot分析，检测到了prM-Env目标蛋白的特异性表达，其分子量约为65kDa(如图3A Lane 2所示)。与此同时，通过去N-连接的糖基化酶PNGase F处理，发现prM-Env目标蛋白条带的分子量变小(如图3A Lane 3所示)，这说明EBY100/pYD1-prM-Env具有糖基化的翻译后修饰过程。糖基化修饰有助于增强病毒抗原蛋白的免疫原性。需要说明的是，由于是预实验，在进行Western blot分析时，没有设置阴性对照EBY100/pYD1。

进一步地，EBY100/pYD1-prM-Env的表面直接用抗prM或抗Env血清(一抗)对EBY100/pYD1-prM-Env表面进行直接标记，FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗。通过免疫荧光显微镜和流式细胞仪分析，EBY100/pYD1-prM-Env表面的特异性荧光信号非常强(如图3B、C右图所示)，而且目标蛋白prM-Env的展示效率为72.5％(如图3C右图所示)。这说明目标蛋白prM-Env高效、稳定地展示在酿酒酵母EBY100表面。

(2)肠溶胶囊包裹EBY100/pYD1-prM-Env在小鼠体内的释放过程

为了分析肠溶胶囊包裹EBY100/pYD1-prM-Env的靶向性，利用荧光素Cy5.5对EBY100/pYD1-prM-Env进行标记，经肠溶胶囊包裹后，通过灌胃针输送至SJL小鼠的胃部。最后，通过小动物活体光学成像仪适时观察荧光素标记的EBY100/pYD1-prM-Env在小鼠体内的释放过程。

肠溶胶囊包裹的EBY100/pYD1-prM-Env在口服40分钟后到达小肠，但是此时的肠溶胶囊并未崩解，所以荧光强度最高(如图4A所示)。随着肠溶胶囊的逐渐崩解并释放内容物，荧光强度逐渐减弱(如图4B、C所示)。这说明肠溶胶囊包裹的EBY100/pYD1-prM-Env能够逃避胃酸的降解，并在口服40分钟后到达小肠部位并逐渐崩解、释放包裹物。因此，肠溶胶囊包裹ZIKV疫苗可以有效地靶向输送小肠部位。

实验结果说明，本发明构建的EBY100/pYD1-prM-Env可以有效表达抗原，目标蛋白prM-Env的展示效率为72.5％，而且EBY100/pYD1-prM-Env可以靶向输送至小肠部位。

实施例2基于酿酒酵母表面展示技术构建寨卡疫及其免疫活性

1.材料和方法

1.1主要实验材料

Zika/SZ01/2016病毒基因，由中国科学院武汉病毒所惠赠；pYD1质粒由本实验室提纯和保存；酿酒酵母EBY100株购自上海林渊生物科技有限公司；限制性内切酶Nhe I、EcoR I、Hind III，割胶回收试剂盒，质粒DNA提取试剂盒，购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶购自NEB公司；酵母基因组DNA提取试剂盒，SDS-PAGE及Westren blot所需试剂购自上海生工生物工程有限责任公司；酵母细胞壁可溶性总蛋白提取试剂盒购自上海杰美基因有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司；Envelope蛋白标准抗原、多克隆鼠抗Envelope血清，由中国科学院武汉病毒所惠赠；HRP标记的羊抗鼠IgG，购自上海生工生物工程有限责任公司；FITC标记的羊抗鼠IgG，购自Sigma公司；生物素标记的羊抗鼠IgG，碱性磷酸酶标记的链亲和素，购自R&D Systems；生物素标记的羊抗鼠IgM、IgA，购自Abcam公司；7周龄SPF级BALB/c雌性小鼠，购自成都达硕动物生物有限公司。

1.2方法

1.2.1表面展示型酿酒酵母ZIKV疫苗的构建

以pYD1表达质粒为骨架，以Zika/SZ01/2016基因(基因库编号：KU866423.1)为模板，用引物F-1(CTAGCTAGCATCAGGTGCATAGGAGT；下划线为Nhe I酶切位点)和R-1(CCGGAATTCTTAAGCAGAGACGGCT；下划线为EcoR I酶切位点)扩增Envelope基因，将PCR产物用Nhe I/EcoR I进行双酶切、割胶回收，并将该产物与经Nhe I/EcoR I双酶切的pYD1质粒连接，经大肠杆菌E.coli DH5α复制，得重组质粒pYD1-Envelope，通过Hind III/EcoR I双酶切对重组质粒进行鉴定。将该重组质粒电转至酿酒酵母EBY100感受态细胞，涂板于MD培养基(0.67％yeast nitrogen base without amino acids(YNB)，2％glucose，0.01％leucine，1.5％agar)，30℃、倒置培养2～3d，挑取阳性克隆，提取酿酒酵母基因组DNA，通过PCR进行鉴定。最终获得表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope(如图5所示)。

1.2.2表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope的表达定位分析

诱导培养：EBY100/pYD1-Envelope接种于含有2％(m/v)葡萄糖的YNB-CAA培养液(0.67％YNB，2％glucose，13.61g/L Na₂HPO₄，7.48g/L NaH₂PO₄和0.5％casamino acids)中，30℃、250rpm培养18h；通过紫外分光光度计测定OD₆₀₀nm值，OD₆₀₀nm值处于2-5间时，加入新鲜的YNB-CAA培养液(注意：2％(m/v)葡萄糖被2％(m/v)半乳糖替代)，调整OD₆₀₀nm＝0.75，20℃、250rpm培养72h。诱导表达后，收集72h的EBY100/pYD1-Envelope上清和沉淀。

Western blot分析：取诱导72h的EBY100/pYD1-Envelope 2OD_600nm(1OD_600nm≈10⁷cells)，12,000rpm离心5min，上清与沉淀分别与50μl 5×SDS上样缓冲液(含二硫叔糖醇)混匀，沸水浴10min，12,000rpm离心5min，取上清15μl，利用10％的SDS-PAGE胶进行电泳(80伏，2h)。SDS-PAGE结束后，通过湿转法(250mA，2h)，将目标蛋白转移至0.45μm孔径的硝酸纤维素膜。接着，PBS-T含0.5％的脱脂奶粉作为封闭液，对转移膜常温封闭1小时，再用多克隆小鼠抗Envelope血清(1:500稀释)4℃孵育过夜，PBS-T漂洗过后，用HRP标记的羊抗小鼠IgG(1:5,000稀释)孵育。最后，与ECL化学发光底物进行反应，通过化学发光成像系统(ChemiDoc MP，Bio-Rad)进行分析。通过成像图片，可以清晰地知晓Envelope蛋白是否在酿酒酵母中表达。与此同时，以EBY100/pYD1作为阴性对照，以Envelope(包膜)蛋白标准抗原作为阳性对照。

免疫荧光分析(Immunofluorescence assay)：首先，对1OD_600nm的EBY100/pYD1-Envelope进行离心，获得沉淀。其次，利用1:500稀释的多克隆小鼠抗Envelope血清(一抗)对EBY100/pYD1-Envelope进行直接标记(4℃，过夜)。然后，用无菌PBS进行漂洗。接着，利用1:5000稀释的FITC-标记的羊抗小鼠IgG进行标记(4℃，30分钟)。最后，用500μl无菌PBS重悬。其中，10μl样品通过荧光显微镜(Olympus IX71)进行免疫荧光分析。其余490μl样品通过流式细胞仪进行分析。

流式细胞仪分析(Flow cytometry assay)：将免疫荧光分析中剩余的490μl样品通过流式细胞仪(BD FACSCalibur)进行分析。

1.2.3表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope的表达定量分析

首先，通过酵母细胞壁可溶性总蛋白提取试剂盒对半乳糖诱导表达后的EBY100/pYD1-Envelope进行处理，获得Envelope蛋白。然后，通过BCA蛋白定量试剂盒对Envelope蛋白的浓度进行测定。以未诱导的EBY100/pYD1-Envelope作为对照。

1.2.4口服免疫

样品处理:将诱导72h的EBY100/pYD1-Envelope置于60℃水浴锅中，处理40分钟，并将最终浓度调整至0.2OD₆₀₀nm/μl。置于4℃保存，待用。

免疫计划：本论文使用7周SPF级BALB/c雌性小鼠，5只/组，重点考察Regimen1、Regimen2、Regimen3(如图6所示)三个给药方式的免疫效率，通过ELISA分析小鼠血清IgG、IgM和粪便IgA水平。

在进行上述口服免疫时，以无菌PBS、EBY100/pYD1作为阴性对照。

1.2.5ELISA分析

血清IgG和IgM的检测^[15]：通过下颌收集血液样品，室温静置2h后，3000rpm离心10min，收集上清，保存于-20℃冰箱，备用。首先，将2μg/ml的Envelope蛋白标准抗原100μl/孔包被于96孔高吸附性的ELISA板中，4℃孵育过夜。将血清以2的倍数用封闭液进行稀释，加入ELISA板中。其次，用生物素化的羊抗鼠IgG和碱性磷酸酶标记的链亲和素(AP-Streptavidin)分别进行标记。然后，pNPP作为底物显色。最后，双波长检测：405nm作为检测波长，630nm作为参比波长。

粪便IgA的检测：取小鼠粪便50mg，浸泡2h。剧烈振荡，使其充分溶解；12700转/分钟，25℃、离心5min。吸取上清，分装成100μl/管，－20℃保存、备用。首先，将2μg/ml的Envelope蛋白标准抗原100μl/孔包被于96孔高吸附性的ELISA板中，将100μl粪便上清加入ELISA板中。其次，用生物素化的羊抗鼠IgA和碱性磷酸酶标记的链亲和素分别进行标记。然后，TMB作为底物显色。最后，双波长检测：450nm作为检测波长，630nm作为参比波长。

1.2.6统计学分析

数据以平均值(Mean)±标准方差(SD)表示。通过Student t和one-way ANOVA统计学软件进行统计学差异分析。P＜0.05被认为有统计学意义。

2.结果

2.1表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope的构建

以Zika/SZ01/2016基因为模板，用引物F-1、R-1进行PCR扩增，得到的基因片段长度为1515bp，其序列如SEQ ID NO：2所示，即为Envelope基因片段(如图7所示)。Envelope基因和表达质粒pYD1分别经NheI/EcoR I双酶切后进行连接，转化至感受态E.coli DH5α，获得E.coli DH5α/pYD1-Envelope。从E.coli DH5α/pYD1-Envelope提取重组质粒pYD1-Envelope，并经Hind III/EcoR I双酶切，结果如图8所示，与预期长度一致，说明Envelope基因已经正确地连接到质粒pYD1中。进一步地，将重组质粒pYD1-Envelope电转至感受态S.cerevisiae EBY100，筛选阳性克隆EBY100/pYD1-Envelope。以EBY100/pYD1-Envelope基因组DNA为模板，用引物F-1、R-1进行PCR扩增，得到特异性Envelope基因片段(如图9所示)，这表明重组质粒pYD1-Envelope已成功地整合到S.cerevisiae EBY100基因组中。

2.2表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope的体外表达分析

分别收集诱导72h后EBY100/pYD1(阴性对照)、EBY100/pYD1-Envelope的上清和沉淀裂解物，进行Western blot分析。结果如图10所示，阴性对照EBY100/pYD1在上清和沉淀裂解物中均未检测到特异性的Envelope蛋白条带。EBY100/pYD1-Envelope在上清中没有监测到特异性条带，但在其裂解物中发现有分子量约为55kDa的特异性条带(如图10Lane2所示)，这与阳性对照(Envelope标准抗原蛋白)特异性条带位置一致(分子量约为55kDa)，表明Envelope抗原蛋白可以有效地表达在EBY100细胞中。

为了确定Envelope抗原蛋白的表达位置，EBY100/pYD1-Envelope用多克隆鼠抗-Envelope抗体和FITC标记的二抗进行荧光标记后，通过免疫荧光显微镜(如图11)和流式细胞仪(如图12所示)进行分析，结果显示在EBY100/pYD1中未检测到绿色荧光(如图11A所示)，而EBY100/pYD1-Envelope组则检测到特异性绿色荧光(如图11B所示)。与免疫荧光显微镜的结果类似，流式细胞仪分析的结果显示阴性对照EBY100/pYD1的荧光强度在10⁰以内，其平均荧光强度为：0.26(如图12A所示)，而EBY100/pYD1-Envelope的荧光强度在10⁰～10²之间，其平均荧光强度为：5.06(如图12B所示)。这说明Envelope抗原蛋白定向表达在EBY100的表面。

除此之外，分别取50OD_600nm诱导前、诱导72h的EBY100/pYD1-Envelope，利用酵母细胞壁可溶性总蛋白制备试剂盒对酿酒酵母细胞壁蛋白进行提取，而后用BCA蛋白定量试剂盒测定Envelope抗原蛋白浓度，EBY100/pYD1-Envelope表达的Envelope蛋白表达量：0.3305μg/OD_600nm。

2.3三种免疫方案的ELISA分析

表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope经三种不同的免疫方案(Regimen1、Regimen2和Regimen3)口服免疫SPF级BALB/c小鼠后，通过ELISA检测Envelope特异性血清IgG抗体效价(如图13所示)，结果表明Regimen1、Regimen2和Regimen3在初次免疫后的第13天，对照组(PBS、EBY100/pYD1)和实验组(EBY100/pYD1-Envelope)的血清IgG效价(2ⁿ)均低于4。然而，在加强免疫后，Regimen1、Regimen2和Regimen3中的实验组(EBY100/pYD1-Envelope)都产生了有统计学意义的血清IgG抗体，而对照组(PBS、EBY100/pYD1)的血清IgG效价没有明显变化。这说明EBY100/pYD1-Envelope需要经过加强免疫才能诱发有意义的血清IgG抗体。具体地，经过加强免疫后，Regimen1、Regimen2和Regimen3诱发的血清IgG效价(2ⁿ)分别为：5.2±0.8366、5.4±0.5477和5.6±0.5477，通过比较Regimen1、Regimen2和Regimen3的Envelope特异性血清IgG抗体应答水平，Regimen3产生的Envelope特异性血清IgG抗体效价最高。

类似地，通过ELISA分析Envelope特异性血清IgM抗体效价(如图14所示)，加强免疫后，Regimen1、Regimen2和Regimen3诱发的IgM效价(2ⁿ)分别为：4.6±0.5477、4.8±0.8366、5.2±0.8366，通过比较Regimen1、Regimen2和Regimen3的免疫效果，结果表明，Regimen3产生的Envelope特异性血清IgM抗体效价最高。

进一步地，通过间接ELISA分析小鼠口服免疫表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope后的粪便IgA抗体效价，结果如图15所示，加强免疫后，Regimen1、Regimen2和Regimen3诱发的Envelope特异性IgA抗体的OD_450nm值分别为：0.1975±0.0081、0.2214±0.0098、0.2415±0.0065。这表明Regimen3的给药方案能够诱导产生较高水平的IgA抗体应答。

综上，EBY100/pYD1-Envelope经三种免疫方案(Regimen1、Regimen2和Regimen3)口服免疫SPF级BALB/c小鼠后，都能诱发有意义的体液免疫应答(血清IgG和血清IgM)和黏膜免疫应答(粪便IgA)，其中Regimen3的免疫效果最佳。

3.讨论

尽管已有ZIKV核酸疫苗进入了I期临床试验，但是研发安全、有效的ZIKV一直在路上。本研究基于酿酒酵母表面展示技术，成功地构建了表面展示型酿酒酵母EBY100/pYD1-Envelope，并对其免疫活性进行了分析。

在表面展示型EBY100/pYD1-Envelope的构建过程中，本研究巧妙地运用pYD1质粒多克隆位点，在构建重组质粒pYD1-Envelope时，设计了Nhe I/EcoR I酶切位点，并在下游引物(R1)中加入终止密码子(TAA)，这样既保留了pYD1质粒上的信号序列，又成功地规避了pYD1质粒上固有的Xpress、V5epitope以及His tag表达标签，从而重点考察了目标蛋白(Envelope抗原蛋白)的展示效率。除此之外，pYD1质粒作为大肠杆菌-酿酒酵母的穿梭质粒，其含有的氨苄青霉素抗性标记只在中间宿主E.coli DH5α中发挥作用，当重组质粒pYD1-Envelope整合到EBY100的基因组时，抗性标记随即丢失。

血清IgG的抗体效价关系到ZIKV疫苗研发的成败，因此，建立灵敏、可靠的ELISA分析平台至关重要。本研究基于生物素-链亲和素结合系统建立的ELISA分析技术平台，不仅能够准确地分析血清IgG和血清IgM的效价，而且能够有效地排除本底和假阳性的干扰，最终获得非常可靠的实验数据。IgM抗体免疫应答中首先分泌的抗体，快速产生后经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失。在对粪便IgA抗体效价进行检测时，鉴于收集的粪便通过无菌PBS溶解后，不能通过梯度稀释(2ⁿ)进行检测，因此，通过间接ELISA法检测OD_450nm吸收值，可以准确地获得Envelope特异性IgA抗体效价。表面展示型EBY100/pYD1-Envelope经口服免疫BALB/c小鼠后，三种免疫方案(Regimen1、Regimen2和Regimen3)均能诱导小鼠产生有意义的体液免疫应答(血清IgG和血清IgM)和黏膜免疫应答(粪便IgA)，其中，Regimen3具有参考意义。

综上所述，本发明已经成功建立了包含寨卡病毒部分基因片段的重组酵母EBY100/pYD1-prM-Env以及EBY100/pYD1-Envelope，而且证实了prM-Env和Envelope可以在酵母中有效表达，并且进一步证明了重组酵母对寨卡病毒具有良好的免疫保护性，可以制备成为口服疫苗，应用前景优良。

附件1

prM-Envelope基因序列(SEQ ID NO：1)

GTGACGCTCCCCTCCCATTCCACTAGGAAGCTGCAAACGCGGTCGCAAACTTGGTTGGAATCAAGAGAATACACAAAGCACTTGATTAGAGTCGAAAATTGGATATTCAGGAACCCTGGCTTCGCGTTAGCAGCAGCTGCCATCGCTTGGCTTTTGGGAAGCTCAACGAGCCAAAAAGTCATATACTTGGTCATGATACTGCTGATTGCCCCGGCATACAGCATCAGGTGCATAGGAGTCAGCAATAGGGACTTTGTGGAAGGTATGTCAGGTGGGACTTGGGTTGATGTTGTCTTGGAACATGGAGGTTGTGTCACCGTAATGGCACAGGACAAACCGACTGTCGACATAGAGCTGGTTACAACAACAGTCAGCAACATGGCGGAGGTAAGATCCTACTGCTATGAGGCATCAATATCGGACATGGCTTCGGACAGCCGCTGCCCAACACAAGGTGAAGCCTACCTTGACAAGCAATCAGACACTCAATATGTCTGCAAAAGAACGTTAGTGGACAGAGGCTGGGGAAATGGATGTGGACTTTTTGGCAAAGGGAGCCTGGTGACATGCGCTAAGTTTGCATGCTCCAAGAAAATGACCGGGAAGAGCATCCAGCCAGAGAATCTGGAGTACCGGATAATGCTGTCAGTTCATGGCTCCCAGCACAGTGGGATGATCGTTAATGACACAGGACATGAAACTGATGAGAATAGAGCGAAGGTTGAGATAACGCCCAATTCACCAAGAGCCGAAGCCACCCTGGGGGGTTTTGGAAGCCTAGGACTTGATTGTGAACCGAGGACAGGCCTTGACTTTTCAGATTTGTATTACTTGACTATGAATAACAAGCACTGGTTGGTTCACAAGGAGTGGTTCCACGACATTCCATTACCTTGGCACGCTGGGGCAGACACCGGAACTCCACACTGGAACAACAAAGAAGCACTGGTAGAGTTCAAGGACGCACATGCCAAAAGGCAAACTGTCGTGGTTCTAGGGAGTCAAGAAGGAGCAGTTCACACGGCCCTTGCTGGAGCTCTGGAGGCTGAGATGGATGGTGCAAAGGGAAGGCTGTCCTCTGGCCACTTGAAATGTCGCCTGAAAATGGATAAACTTAGATTGAAGGGCGTGTCATACTCCTTGTGTACCGCAGCGTTCACATTCACCAAGATCCCGGCTGAAACACTGCACGGGACAGTCACAGTGGAGGTACAGTACGCAGGGACAGATGGACCTTGCAAGGTTCCAGCTCAGATGGCGGTGGACATGCAAACTCTGACCCCAGTTGGGAGGCTGATAACCGCTAACCCCGTAATCACTGAAAGCACTGAGAACTCCAAGATGATGCTGGAACTTGATCCACCATTTGGGGACTCTTACATTGTCATAGGAGTCGGGGAGAAGAAGATCACCCACCACTGGCACAGGAGTGGCAGCACCATTGGAAAAGCATTTGAAGCCACTGTGAGAGGTGCCAGGAGAATGGCAGTCTTGGGAGACACAGCCTGGGACTTTGGATCAGTTGGAGGCGCTCTCAACTCATTGGGCAAGGGCATCCATCAAATTTTTGGAGCAGCTTTCAAATCATTGTTTGGAGGAATGTCCTGGTTCTCACAAATTCTCATTGGAACGTTGCTGATGTGGTTGGGTCTGAACACAAAGAATGGATCTATTTCCCTTATGTGCTTGGCCTTAGGGGGAGTGTTGATCTTCTTATCCACAGCCGTCTCTGCT

氨基酸序列：

VTLPSHSTRKLQTRSQTWLESREYTKHLIRVENWIFRNPGFALAAAAIAWLLGSSTSQKVIYLVMILLIAPAYSIRCIGVSNRDFVEGMSGGTWVDVVLEHGGCVTVMAQDKPTVDIELVTTTVSNMAEVRSYCYEASISDMASDSRCPTQGEAYLDKQSDTQYVCKRTLVDRGWGNGCGLFGKGSLVTCAKFACSKKMTGKSIQPENLEYRIMLSVHGSQHSGMIVNDTGHETDENRAKVEITPNSPRAEATLGGFGSLGLDCEPRTGLDFSDLYYLTMNNKHWLVHKEWFHDIPLPWHAGADTGTPHWNNKEALVEFKDAHAKRQTVVVLGSQEGAVHTALAGALEAEMDGAKGRLSSGHLKCRLKMDKLRLKGVSYSLCTAAFTFTKIPAETLHGTVTVEVQYAGTDGPCKVPAQMAVDMQTLTPVGRLITANPVITESTENSKMMLELDPPFGDSYIVIGVGEKKITHHWHRSGSTIGKAFEATVRGARRMAVLGDTAWDFGSVGGALNSLGKGIHQIFGAAFKSLFGGMSWFSQILIGTLLMWLGLNTKNGSISLMCLALGGVLIFLSTAVSA

附件2：

Env基因序列(SEQ ID NO：2)；

ATCAGGTGCATAGGAGTCAGCAATAGGGACTTTGTGGAAGGTATGTCAGGTGGGACTTGGGTTGATGTTGTCTTGGAACATGGAGGTTGTGTCACCGTAATGGCACAGGACAAACCGACTGTCGACATAGAGCTGGTTACAACAACAGTCAGCAACATGGCGGAGGTAAGATCCTACTGCTATGAGGCATCAATATCGGACATGGCTTCGGACAGCCGCTGCCCAACACAAGGTGAAGCCTACCTTGACAAGCAATCAGACACTCAATATGTCTGCAAAAGAACGTTAGTGGACAGAGGCTGGGGAAATGGATGTGGACTTTTTGGCAAAGGGAGCCTGGTGACATGCGCTAAGTTTGCATGCTCCAAGAAAATGACCGGGAAGAGCATCCAGCCAGAGAATCTGGAGTACCGGATAATGCTGTCAGTTCATGGCTCCCAGCACAGTGGGATGATCGTTAATGACACAGGACATGAAACTGATGAGAATAGAGCGAAGGTTGAGATAACGCCCAATTCACCAAGAGCCGAAGCCACCCTGGGGGGTTTTGGAAGCCTAGGACTTGATTGTGAACCGAGGACAGGCCTTGACTTTTCAGATTTGTATTACTTGACTATGAATAACAAGCACTGGTTGGTTCACAAGGAGTGGTTCCACGACATTCCATTACCTTGGCACGCTGGGGCAGACACCGGAACTCCACACTGGAACAACAAAGAAGCACTGGTAGAGTTCAAGGACGCACATGCCAAAAGGCAAACTGTCGTGGTTCTAGGGAGTCAAGAAGGAGCAGTTCACACGGCCCTTGCTGGAGCTCTGGAGGCTGAGATGGATGGTGCAAAGGGAAGGCTGTCCTCTGGCCACTTGAAATGTCGCCTGAAAATGGATAAACTTAGATTGAAGGGCGTGTCATACTCCTTGTGTACCGCAGCGTTCACATTCACCAAGATCCCGGCTGAAACACTGCACGGGACAGTCACAGTGGAGGTACAGTACGCAGGGACAGATGGACCTTGCAAGGTTCCAGCTCAGATGGCGGTGGACATGCAAACTCTGACCCCAGTTGGGAGGCTGATAACCGCTAACCCCGTAATCACTGAAAGCACTGAGAACTCCAAGATGATGCTGGAACTTGATCCACCATTTGGGGACTCTTACATTGTCATAGGAGTCGGGGAGAAGAAGATCACCCACCACTGGCACAGGAGTGGCAGCACCATTGGAAAAGCATTTGAAGCCACTGTGAGAGGTGCCAGGAGAATGGCAGTCTTGGGAGACACAGCCTGGGACTTTGGATCAGTTGGAGGCGCTCTCAACTCATTGGGCAAGGGCATCCATCAAATTTTTGGAGCAGCTTTCAAATCATTGTTTGGAGGAATGTCCTGGTTCTCACAAATTCTCATTGGAACGTTGCTGATGTGGTTGGGTCTGAACACAAAGAATGGATCTATTTCCCTTATGTGCTTGGCCTTAGGGGGAGTGTTGATCTTCTTATCCACAGCCGTCTCTGCTTAA

氨基酸序列：

IRCIGVSNRDFVEGMSGGTWVDVVLEHGGCVTVMAQDKPTVDIELVTTTVSNMAEVRSYCYEASISDMASDSRCPTQGEAYLDKQSDTQYVCKRTLVDRGWGNGCGLFGKGSLVTCAKFACSKKMTGKSIQPENLEYRIMLSVHGSQHSGMIVNDTGHETDENRAKVEITPNSPRAEATLGGFGSLGLDCEPRTGLDFSDLYYLTMNNKHWLVHKEWFHDIPLPWHAGADTGTPHWNNKEALVEFKDAHAKRQTVVVLGSQEGAVHTALAGALEAEMDGAKGRLSSGHLKCRLKMDKLRLKGVSYSLCTAAFTFTKIPAETLHGTVTVEVQYAGTDGPCKVPAQMAVDMQTLTPVGRLITANPVITESTENSKMMLELDPPFGDSYIVIGVGEKKITHHWHRSGSTIGKAFEATVRGARRMAVLGDTAWDFGSVGGALNSLGKGIHQIFGAAFKSLFGGMSWFSQILIGTLLMWLGLNTKNGSISLMCLALGGVLIFLSTAVSA

序列表

<110> 西南交通大学

<120> 一种预防寨卡病毒感染的口服疫苗及其制备方法

<130> GY138-18P1195

<150> 201710272526.9

<151> 2017-04-24

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1734

<212> DNA

<213> prm-envelope 基因序列(Flavivirus)

<400> 1

gtgacgctcc cctcccattc cactaggaag ctgcaaacgc ggtcgcaaac ttggttggaa 60

tcaagagaat acacaaagca cttgattaga gtcgaaaatt ggatattcag gaaccctggc 120

ttcgcgttag cagcagctgc catcgcttgg cttttgggaa gctcaacgag ccaaaaagtc 180

atatacttgg tcatgatact gctgattgcc ccggcataca gcatcaggtg cataggagtc 240

agcaataggg actttgtgga aggtatgtca ggtgggactt gggttgatgt tgtcttggaa 300

catggaggtt gtgtcaccgt aatggcacag gacaaaccga ctgtcgacat agagctggtt 360

acaacaacag tcagcaacat ggcggaggta agatcctact gctatgaggc atcaatatcg 420

gacatggctt cggacagccg ctgcccaaca caaggtgaag cctaccttga caagcaatca 480

gacactcaat atgtctgcaa aagaacgtta gtggacagag gctggggaaa tggatgtgga 540

ctttttggca aagggagcct ggtgacatgc gctaagtttg catgctccaa gaaaatgacc 600

gggaagagca tccagccaga gaatctggag taccggataa tgctgtcagt tcatggctcc 660

cagcacagtg ggatgatcgt taatgacaca ggacatgaaa ctgatgagaa tagagcgaag 720

gttgagataa cgcccaattc accaagagcc gaagccaccc tggggggttt tggaagccta 780

ggacttgatt gtgaaccgag gacaggcctt gacttttcag atttgtatta cttgactatg 840

aataacaagc actggttggt tcacaaggag tggttccacg acattccatt accttggcac 900

gctggggcag acaccggaac tccacactgg aacaacaaag aagcactggt agagttcaag 960

gacgcacatg ccaaaaggca aactgtcgtg gttctaggga gtcaagaagg agcagttcac 1020

acggcccttg ctggagctct ggaggctgag atggatggtg caaagggaag gctgtcctct 1080

ggccacttga aatgtcgcct gaaaatggat aaacttagat tgaagggcgt gtcatactcc 1140

ttgtgtaccg cagcgttcac attcaccaag atcccggctg aaacactgca cgggacagtc 1200

acagtggagg tacagtacgc agggacagat ggaccttgca aggttccagc tcagatggcg 1260

gtggacatgc aaactctgac cccagttggg aggctgataa ccgctaaccc cgtaatcact 1320

gaaagcactg agaactccaa gatgatgctg gaacttgatc caccatttgg ggactcttac 1380

attgtcatag gagtcgggga gaagaagatc acccaccact ggcacaggag tggcagcacc 1440

attggaaaag catttgaagc cactgtgaga ggtgccagga gaatggcagt cttgggagac 1500

acagcctggg actttggatc agttggaggc gctctcaact cattgggcaa gggcatccat 1560

caaatttttg gagcagcttt caaatcattg tttggaggaa tgtcctggtt ctcacaaatt 1620

ctcattggaa cgttgctgat gtggttgggt ctgaacacaa agaatggatc tatttccctt 1680

atgtgcttgg ccttaggggg agtgttgatc ttcttatcca cagccgtctc tgct 1734

<210> 2

<211> 1515

<212> DNA

<213> Env基因序列(SEQ ID NO：2Flavivirus)

<400> 2

atcaggtgca taggagtcag caatagggac tttgtggaag gtatgtcagg tgggacttgg 60

gttgatgttg tcttggaaca tggaggttgt gtcaccgtaa tggcacagga caaaccgact 120

gtcgacatag agctggttac aacaacagtc agcaacatgg cggaggtaag atcctactgc 180

tatgaggcat caatatcgga catggcttcg gacagccgct gcccaacaca aggtgaagcc 240

taccttgaca agcaatcaga cactcaatat gtctgcaaaa gaacgttagt ggacagaggc 300

tggggaaatg gatgtggact ttttggcaaa gggagcctgg tgacatgcgc taagtttgca 360

tgctccaaga aaatgaccgg gaagagcatc cagccagaga atctggagta ccggataatg 420

ctgtcagttc atggctccca gcacagtggg atgatcgtta atgacacagg acatgaaact 480

gatgagaata gagcgaaggt tgagataacg cccaattcac caagagccga agccaccctg 540

gggggttttg gaagcctagg acttgattgt gaaccgagga caggccttga cttttcagat 600

ttgtattact tgactatgaa taacaagcac tggttggttc acaaggagtg gttccacgac 660

attccattac cttggcacgc tggggcagac accggaactc cacactggaa caacaaagaa 720

gcactggtag agttcaagga cgcacatgcc aaaaggcaaa ctgtcgtggt tctagggagt 780

caagaaggag cagttcacac ggcccttgct ggagctctgg aggctgagat ggatggtgca 840

aagggaaggc tgtcctctgg ccacttgaaa tgtcgcctga aaatggataa acttagattg 900

aagggcgtgt catactcctt gtgtaccgca gcgttcacat tcaccaagat cccggctgaa 960

acactgcacg ggacagtcac agtggaggta cagtacgcag ggacagatgg accttgcaag 1020

gttccagctc agatggcggt ggacatgcaa actctgaccc cagttgggag gctgataacc 1080

gctaaccccg taatcactga aagcactgag aactccaaga tgatgctgga acttgatcca 1140

ccatttgggg actcttacat tgtcatagga gtcggggaga agaagatcac ccaccactgg 1200

cacaggagtg gcagcaccat tggaaaagca tttgaagcca ctgtgagagg tgccaggaga 1260

atggcagtct tgggagacac agcctgggac tttggatcag ttggaggcgc tctcaactca 1320

ttgggcaagg gcatccatca aatttttgga gcagctttca aatcattgtt tggaggaatg 1380

tcctggttct cacaaattct cattggaacg ttgctgatgt ggttgggtct gaacacaaag 1440

aatggatcta tttcccttat gtgcttggcc ttagggggag tgttgatctt cttatccaca 1500

gccgtctctg cttaa 1515

<210> 3

<211> 578

<212> PRT

<213> prM-Envelope 氨基酸序列(Flavivirus)

<400> 3

Val Thr Leu Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln

1 5 10 15

Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Leu Ile Arg Val Glu

20 25 30

Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ile

35 40 45

Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser Thr Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu Val

50 55 60

Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro Ala Tyr Ser Ile Arg Cys Ile Gly Val

65 70 75 80

Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser Gly Gly Thr Trp Val Asp

85 90 95

Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr Val Met Ala Gln Asp Lys

100 105 110

Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr Thr Val Ser Asn Met Ala

115 120 125

Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser Ile Ser Asp Met Ala Ser

130 135 140

Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala Tyr Leu Asp Lys Gln Ser

145 150 155 160

Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu Val Asp Arg Gly Trp Gly

165 170 175

Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys

180 185 190

Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys Ser Ile Gln Pro Glu Asn

195 200 205

Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His Gly Ser Gln His Ser Gly

210 215 220

Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr Asp Glu Asn Arg Ala Lys

225 230 235 240

Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala Glu Ala Thr Leu Gly Gly

245 250 255

Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe

260 265 270

Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn Lys His Trp Leu Val His

275 280 285

Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro Trp His Ala Gly Ala Asp

290 295 300

Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu Ala Leu Val Glu Phe Lys

305 310 315 320

Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu

325 330 335

Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala Leu Glu Ala Glu Met Asp

340 345 350

Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys

355 360 365

Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala

370 375 380

Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val

385 390 395 400

Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro

405 410 415

Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu

420 425 430

Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met

435 440 445

Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly

450 455 460

Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr

465 470 475 480

Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg Gly Ala Arg Arg Met Ala

485 490 495

Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Ala Leu

500 505 510

Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe Lys

515 520 525

Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe Ser Gln Ile Leu Ile Gly Thr

530 535 540

Leu Leu Met Trp Leu Gly Leu Asn Thr Lys Asn Gly Ser Ile Ser Leu

545 550 555 560

Met Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val Leu Ile Phe Leu Ser Thr Ala Val

565 570 575

Ser Ala

<210> 4

<211> 504

<212> PRT

<213> Env蛋白氨基酸序列(Flavivirus)

<400> 4

Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Met Ser

1 5 10 15

Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly Cys Val Thr

20 25 30

Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu Val Thr Thr

35 40 45

Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Ala Ser

50 55 60

Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala

65 70 75 80

Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys Arg Thr Leu

85 90 95

Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser

100 105 110

Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met Thr Gly Lys

115 120 125

Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu Ser Val His

130 135 140

Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly His Glu Thr

145 150 155 160

Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser Pro Arg Ala

165 170 175

Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp Cys Glu Pro

180 185 190

Arg Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr Met Asn Asn

195 200 205

Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile Pro Leu Pro

210 215 220

Trp His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn Asn Lys Glu

225 230 235 240

Ala Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln Thr Val Val

245 250 255

Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu Ala Gly Ala

260 265 270

Leu Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser Ser Gly His

275 280 285

Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys Gly Val Ser

290 295 300

Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu

305 310 315 320

Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp

325 330 335

Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln Thr Leu

340 345 350

Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr Glu Ser

355 360 365

Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe Gly Asp

370 375 380

Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His His Trp

385 390 395 400

His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr Val Arg

405 410 415

Gly Ala Arg Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly

420 425 430

Ser Val Gly Gly Ala Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His Gln Ile

435 440 445

Phe Gly Ala Ala Phe Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Phe Ser

450 455 460

Gln Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Met Trp Leu Gly Leu Asn Thr Lys

465 470 475 480

Asn Gly Ser Ile Ser Leu Met Cys Leu Ala Leu Gly Gly Val Leu Ile

485 490 495

Phe Leu Ser Thr Ala Val Ser Ala

500

Claims

1.一种重组质粒，其特征在于：它是含有SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2所述核苷酸序列的重组pYD1质粒或者重组pYD5质粒。

2.一种重组酵母菌，其特征在于：它是含有权利要求1所述的重组质粒的酵母菌。

3.根据权利要求2所述的重组酵母菌，其特征在于：所述酵母菌是S.cerevisiaeEBY100。

4.权利要求2或3所述的重组酵母菌在制备预防寨卡病毒感染的疫苗中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述疫苗为口服疫苗。

6.一种预防寨卡病毒感染的疫苗，其特征在于：它是以权利要求2或3所述的重组酵母菌为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于：所述制剂是口服制剂。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述辅助性成分为肠溶性胶囊。

9.一种制备预防寨卡病毒感染的重组酵母菌的方法，其特征在于：步骤如下：

(2)导入感受态酵母菌中，即可。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述寨卡病毒的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2所示。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述酵母菌为S.cerevisiaeEBY 100。